本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體地說,本發(fā)明涉及小分子定向組織和器官再生的多能人類干細(xì)胞技術(shù)、方法和產(chǎn)品。
背景技術(shù):
::未分化的人類胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells[hESC])具有長期性穩(wěn)定培養(yǎng)生長和無限的內(nèi)在潛力分化為各種類型的人體細(xì)胞。人類胚胎干細(xì)胞是從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團胚泡或外胚層的來源派生出來的,不僅提供了一個有力的體外模型系統(tǒng)用于研究人類胚胎發(fā)育,而且為大量供應(yīng)針對疾病的特定譜系的人體細(xì)胞提供了一個體外衍生物的多功能貯存庫[1-3]。然而,如何有效地可預(yù)測地引導(dǎo)多能人類干細(xì)胞的廣泛分化潛能來產(chǎn)生所需的人體細(xì)胞類型一直是發(fā)育研究和臨床應(yīng)用上的一個重大挑戰(zhàn)。常規(guī)方法依賴于多能干細(xì)胞自發(fā)的胚層多譜系分化傾向來產(chǎn)生混合細(xì)胞群內(nèi)含來源于三個胚層的細(xì)胞種類,常使所希求的分化不僅效率低,而且不可控制亦不可靠[1-3]。雖然這樣的細(xì)胞可在體外自發(fā)地通過一個多譜系聚集體或胚狀體階段分化成所有胚層的細(xì)胞,只有很一小部分細(xì)胞會成為一個給定的譜系的細(xì)胞。在這些人類胚胎干細(xì)胞衍生的聚集體或胚狀體會同時出現(xiàn)大量的來源于三個胚層的大相徑庭的不希求的細(xì)胞類型,常使產(chǎn)生所希求的細(xì)胞類型不僅效率低,而且不可控制亦不可靠。這些多能干細(xì)胞衍生的移植物在移植后往往不僅在產(chǎn)生所需的重建受損結(jié)構(gòu)的細(xì)胞類型效率低,而且發(fā)生細(xì)胞表型異質(zhì)性和不穩(wěn)定性,因此,有致瘤的高風(fēng)險[1-3]。目前人類胚胎干細(xì)胞衍生的第一代細(xì)胞產(chǎn)物含有混合細(xì)胞群,包括殘留的未分化的人類胚胎干細(xì)胞和部分分化的細(xì)胞仍保留增殖和分化成不想要的細(xì)胞的潛力,提出了一個潛在的安全性問題。鑒于對使用多能人類干細(xì)胞日益增長的興趣,包括來自非胚胎或成體細(xì)胞的人工重新編程誘導(dǎo)的多能細(xì)胞(hiPS細(xì)胞),移植后出現(xiàn)畸胎瘤和不適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型已經(jīng)成為一個經(jīng)常的關(guān)注[1-3]。如果沒有一個實際的策略來直接轉(zhuǎn)換多能干細(xì)胞成為一個給定的譜系的細(xì)胞,以往在多能人類胚胎干細(xì)胞及其分化的多譜系聚集體的研究于人類胚胎發(fā)育提供分子控制機制的影響不大。發(fā)展了一種新的實用的方法能夠有效地可預(yù)測地引導(dǎo)多能人類干細(xì)胞的廣泛分化潛能來產(chǎn)生所需的人體細(xì)胞類型,是不只對于用人類胚胎干細(xì)胞的巨大潛力來發(fā)展安全和有效的細(xì)胞治療法至關(guān)重要,同時也對揭幕人類胚胎發(fā)育中的分子和細(xì)胞線索至關(guān)重要。最初衍生的人類胚胎干細(xì)胞需要用生長停滯的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來一起培養(yǎng)[1]。盡管已經(jīng)開發(fā)了用于人類胚胎干細(xì)胞的一些用人的飼養(yǎng)細(xì)胞,不用飼養(yǎng)細(xì)胞,和化學(xué)配制的培養(yǎng)系統(tǒng),對多能人類干細(xì)胞的自我更新的必需因素仍未了解[1-3]。雖然這些外源的飼養(yǎng)細(xì)胞和生物試劑有助于保持未分化的胚胎干細(xì)胞的長期穩(wěn)定性增長,但也掩蓋了多能人類干細(xì)胞對發(fā)育信號作出反應(yīng)的能力。因此,開發(fā)多能人類干細(xì)胞的定義培養(yǎng)系統(tǒng)不僅可使多能人類干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成為臨床上的早期特定譜系的人體細(xì)胞不用中間的多譜系胚層或胚狀體的過渡階段,也可使用于模仿人類胚胎發(fā)育鑒定誘導(dǎo)器官發(fā)生過程中必需的信號分子[1-3]。目前用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的治療方法可以緩解癥狀,但不能改變疾病的預(yù)后。細(xì)胞治療法對恢復(fù)失去的神經(jīng)組織和功能提供了再生和更換的可行方法,因此有相當(dāng)大的需求。然而,適宜臨床上應(yīng)用的有足夠的神經(jīng)生長潛力的可以移植的人類干細(xì)胞來源至今缺乏,成為在開發(fā)用于恢復(fù)受損或失去的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)電路的安全和有效的細(xì)胞治療法上的嚴(yán)重障礙。可以移植的人類神經(jīng)干細(xì)胞的傳統(tǒng)來源一直是直接從中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離出來的人神經(jīng)干細(xì)胞(hNSC)[4]。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的初級人神經(jīng)干細(xì)胞類似神經(jīng)上皮細(xì)胞,對巢蛋白(nestin)標(biāo)記物呈現(xiàn)陽性,并且可以在體外和體內(nèi)自發(fā)地分化成含有未分化的人神經(jīng)干細(xì)胞,神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞的混合細(xì)胞群[4]。然而,基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞治療法遇到供應(yīng)限制和臨床上使用的困難,由于其可塑性隨衰老下降和增殖能力有限,這使得它難以保持大規(guī)模和長期的培養(yǎng),限制了組織衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞作為合適的臨床上使用的移植材料來源[1-4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞盡管取得了一些有益的結(jié)果,但其療效主要是通過非神經(jīng)子代細(xì)胞產(chǎn)生的營養(yǎng)和/或神經(jīng)保護分子來拯救垂死的內(nèi)源性宿主神經(jīng)元[1-4]。移植的組織來源的干細(xì)胞只能產(chǎn)生少量的神經(jīng)元,不足以更換受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元[1-4]。遺傳穩(wěn)定的多能人類胚胎干細(xì)胞提供了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的各類神經(jīng)元細(xì)胞可以用于再生和修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng),為許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了治愈的途徑。因此,已被視為一種提供大量的用于恢復(fù)損傷或失去的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)組織和功能的人神經(jīng)元細(xì)胞類型和子類型的理想來源。然而,實現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞的發(fā)育和治療潛力一直受到產(chǎn)生所需的人體細(xì)胞類型通過多能干細(xì)胞的多譜系分化的低效率和不穩(wěn)定性的阻礙。雖然神經(jīng)譜系細(xì)胞出現(xiàn)在相對早期的分化階段,只有<5%的人類胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化為神經(jīng)元[1-3]。視黃酸(Retinoicacid)不誘導(dǎo)維持在飼養(yǎng)細(xì)胞上的未分化的人類胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)元[1]。不像小鼠胚胎干細(xì)胞,用視黃酸處理治療人類胚胎干細(xì)胞分化的多譜系聚集體或胚狀體僅略增神經(jīng)元的分化[1-3]?,F(xiàn)用作法自多能干細(xì)胞通過多譜系分化衍生,這些神經(jīng)移植物移植后在產(chǎn)生神經(jīng)元上效率低,不僅不能充分地再生或重建受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu),而且也畸胎瘤和/或腫瘤形成的高風(fēng)險,不能為臨床應(yīng)用所接受[1-3]。類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的初級人神經(jīng)干細(xì)胞,這些人類胚胎干細(xì)胞衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞類似神經(jīng)上皮細(xì)胞,對巢蛋白(nestin)標(biāo)記物呈現(xiàn)陽性,并且可以在體外和體內(nèi)自發(fā)地分化成含有未分化的人神經(jīng)干細(xì)胞,神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞的混合細(xì)胞群[1-3]。這些次級人神經(jīng)干細(xì)胞要先從人類胚胎干細(xì)胞分化的多譜系聚集體或胚狀體中通過機械分離然后才能進一步的分化。類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的初級人神經(jīng)干細(xì)胞,這些人類胚胎干細(xì)胞衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞的治療效果是通過神經(jīng)保護或營養(yǎng)機制介導(dǎo)來拯救垂死的宿主神經(jīng)元,與移植物再生或宿主髓鞘再生無關(guān)[1-3]。越來越多的證據(jù)表明,人類胚胎干細(xì)胞從體外經(jīng)由常規(guī)的多譜系分化衍生的次級人神經(jīng)干細(xì)胞似乎有增加的致瘤風(fēng)險,但跟體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的初級人神經(jīng)干細(xì)胞相比并沒有改善神經(jīng)增長的潛力,仍然不足以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生[1-3]。目前無論是由內(nèi)源性細(xì)胞或細(xì)胞移植或心臟組織工程,缺乏合適的人心肌細(xì)胞的來源已成為在再生受損人類心肌上的嚴(yán)重障礙[1-3]。在成人心臟中,成熟的收縮心肌細(xì)胞已經(jīng)終末分化,無法再生。損傷或病態(tài)的心肌是由巨噬細(xì)胞除去并換上非功能性細(xì)胞或疤痕組織。雖然在產(chǎn)后的心臟中已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物,但數(shù)量微不足道,而且它們主要分化為平滑肌細(xì)胞而不是功能性收縮心肌細(xì)胞,越來越多的證據(jù)表明他們不是真正的心臟細(xì)胞,對他們可用于心肌修復(fù)引起質(zhì)疑[1-3]。沒有證據(jù)表明,從其他來源的干細(xì)胞,例如間充質(zhì)干細(xì)胞,骨髓細(xì)胞,臍帶血干細(xì)胞,臍帶血細(xì)胞,患者的心臟組織細(xì)胞,胎盤細(xì)胞,或脂肪組織來源的細(xì)胞移植入心臟后能夠產(chǎn)生收縮的心臟細(xì)胞[1-3]。因此,無論是內(nèi)源性或通過細(xì)胞移植的成體干細(xì)胞療法尚未滿足在現(xiàn)今的醫(yī)療保健行業(yè)再生或修復(fù)受損心臟肌肉的需求。多能人類胚胎干細(xì)胞為細(xì)胞治療法提供了唯一的產(chǎn)生大量的心臟移植物的途徑。由于全球心血管疾病的流行和器官捐贈或心臟移植物的嚴(yán)重短缺,對開發(fā)人類胚胎干細(xì)胞為基礎(chǔ)的心臟疾病細(xì)胞療法帶有強烈興趣[1-3]。人類胚胎干細(xì)胞和其衍生物較成體組織的免疫抗原性低很多[1-3]。另外,也可以大量存庫具同型白細(xì)胞抗原的人類胚胎干細(xì)胞,從而改善與細(xì)胞移植物緊密搭配的可能性[1-3]。然而,實現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞的治療潛力受到產(chǎn)生所需的心肌細(xì)胞通過多譜系分化的低效率和不穩(wěn)定性的阻礙。在人類胚胎干細(xì)胞分化的多譜系聚集體或胚狀體,只是一小部分的細(xì)胞(~1-4%)自發(fā)分化成心肌細(xì)胞[1-3]。繼機械分離和免疫選擇之后會產(chǎn)生少量心肌細(xì)胞可以注入動物模型的心臟作為生物起搏器挽救受損心肌的功能[1-3]。雖然移植后,這樣的人類胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞可以衰減急性心肌梗死的嚙齒動物模型的心臟衰竭,它們卻不足以恢復(fù)心臟功能或改變一個慢性心肌梗塞動物模型的心臟衰竭[1-3]。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟疾病的全球流行,對發(fā)展多能人類干細(xì)胞為細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療法已產(chǎn)生了濃厚的興趣。然而,多能人類干細(xì)胞本身非專門的功能性細(xì),不能直接用于治療。我們已認(rèn)識到多能人類干細(xì)胞必須通過一個稱為分化的過程變成命運限制性專門的功能細(xì)胞然后才能用于細(xì)胞治療?,F(xiàn)存的多能人類干細(xì)胞分化途徑依賴于多能干細(xì)胞自發(fā)的不可控制亦不可靠的多譜系分化來產(chǎn)生胚狀體或聚集體含來源于三個胚層的混合細(xì)胞群,其中只有很一小部分細(xì)胞會成為一個給定的譜系的細(xì)胞。那些常規(guī)的多能人類干細(xì)胞分化方法的純化或分離步驟費力,昂貴,亦耗時,僅產(chǎn)生少量的所需細(xì)胞,不適于商業(yè)和臨床應(yīng)用。越來越多的科學(xué)證據(jù)表明,那些傳統(tǒng)的分化方法導(dǎo)致其細(xì)胞衍生物和組織工程構(gòu)建物移植后低效,不穩(wěn)定,分化不完整,表現(xiàn)不佳,和高腫瘤風(fēng)險等問題。根據(jù)目前使用的在該領(lǐng)域現(xiàn)存的方法,多能人類干細(xì)胞衍生的細(xì)胞制品含有異質(zhì)群體的混合細(xì)胞類型,包括完全分化的細(xì)胞,大量的各種程度部分分化或未分化的細(xì)胞,和少量的未分化的多能人類干細(xì)胞,提出了一個當(dāng)給病癥患者施用上潛在的安全性問題。此外,通常用于分離,擴增,和分化多能人類干細(xì)胞的異物或動物生物補充劑和/或飼養(yǎng)細(xì)胞使其細(xì)胞衍生物不適于臨床應(yīng)用或人體試驗。發(fā)展新策略能夠可專門地預(yù)測地引導(dǎo)多能人類干細(xì)胞的廣泛分化潛能來產(chǎn)生特定譜系的神經(jīng)或心臟細(xì)胞,不僅是對于用人類胚胎干細(xì)胞的巨大潛力來修復(fù)神經(jīng)或心臟至關(guān)重要,同時也對揭幕人類胚胎發(fā)育中中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心臟形成的分子和細(xì)胞線索至關(guān)重要。因此,可以看出,有必要開發(fā)新技術(shù)用于良好控制高效率引導(dǎo)多能人類干細(xì)胞的廣泛分化潛能可專門地預(yù)測地轉(zhuǎn)化成大量的神經(jīng)譜系細(xì)胞,這對為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷提供大量的高純度高效并有足夠的神經(jīng)生長潛力適合于臨床應(yīng)用的各種發(fā)育階段的人神經(jīng)細(xì)胞治療產(chǎn)品至關(guān)重要。因此,可以看出,有必要開發(fā)新技術(shù)用于良好控制高效率引導(dǎo)多能人類干細(xì)胞的廣泛分化潛能可專門地預(yù)測地轉(zhuǎn)化成大量的心臟譜系細(xì)胞,這對為修復(fù)心血管疾病中損傷的心肌提供大量的高純度高效并有足夠的心肌生長潛力適合于臨床應(yīng)用的各種發(fā)育階段的人心肌細(xì)胞治療產(chǎn)品至關(guān)重要。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種小分子定向組織和器官再生的多能人類干細(xì)胞技術(shù)、方法和產(chǎn)品。本發(fā)明的第一方面,提供了從多能人類干細(xì)胞產(chǎn)生特定譜系的人體細(xì)胞的方法,所述方法包括以下步驟:(i)在定義培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能人類干細(xì)胞;(ii)在步驟(i)的培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑,繼續(xù)培養(yǎng)至至少90%的(優(yōu)選地為至少95%的,更優(yōu)選地為至少98%的,如98.5%的、99%的、99.5%的)多能人類干細(xì)胞分化成一種特定譜系的人體細(xì)胞;其中,所述定義培養(yǎng)基中不含血清,并且不含異種細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述定義培養(yǎng)基中不含異種細(xì)胞條件培養(yǎng)基,不含異種蛋白,不含異種脫氧核糖核酸(DNA),不含異種核糖核酸(RNA)。在本發(fā)明中術(shù)語“異種”是指,與所培養(yǎng)的多能人類干細(xì)胞不同,包括:源自不同物種的、源自不同個體(同物種)的、源自不同器官(同個體)的。在另一優(yōu)選例中,所述異種細(xì)胞包括飼養(yǎng)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述定義培養(yǎng)基包含一個基礎(chǔ)培養(yǎng)基,20-100ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),0.01-0.03mg/ml胰島素(insulin),0.04-0.06mg/ml抗壞血酸(ascorbicacid),20-100ng/ml激活素(activin-A),和0.01–1mg/ml層粘連蛋白(laminin)。在另一優(yōu)選例中,所述定義培養(yǎng)基中層粘連蛋白的含量為0.01-1mg/ml,優(yōu)選地為0.02-0.2mg/ml,更優(yōu)選地為0.03-0.1mg/ml,最優(yōu)選地為0.04-0.06mg/ml。在另一優(yōu)選例中,所述多能人類干細(xì)胞包括:實驗用多能人類干細(xì)胞、臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞等。在另一優(yōu)選例中,所述多能人類干細(xì)胞包括多能人類胚胎干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的多能人類干細(xì)胞包括用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)制造的優(yōu)質(zhì)性多能人類干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述多能人類干細(xì)胞至少有70%表達(dá)選自下組的至少4種細(xì)胞標(biāo)記物:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase),OCT-4,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,乙?;慕M蛋白(acetylatedhistones),BRG-1,hSNF2H,和microRNAhsa-miR-302。在另一優(yōu)選例中,所述多能人類干細(xì)胞具有選自下組的特性:(1)能夠在定義培養(yǎng)基中增殖一年以上;(2)通過長期培養(yǎng)后仍保持穩(wěn)定的染色體核型,其中染色體是整倍體;及(3)在培養(yǎng)過程中始終保持分化為內(nèi)胚層,中胚層和外胚層組織的潛力。在另一優(yōu)選例中,所述的特定譜系的人體細(xì)胞包括從在步驟(ii)中的特定譜系的人體細(xì)胞中進一步分化出來的功能性衍生細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述誘導(dǎo)劑具有誘導(dǎo)所述多能人類干細(xì)胞分化為特定譜系的人體細(xì)胞的能力。在另一優(yōu)選例中,所述誘導(dǎo)劑選自:化合物、多肽、多核苷酸、或其組合。在另一優(yōu)選例中,所述誘導(dǎo)劑選自:化合物、生長因子、信號分子、細(xì)胞因子、形態(tài)發(fā)生素、核酸分子、核苷酸、寡核苷酸、微小核糖核酸(microRNA)、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、肽(peptides)、蛋白質(zhì)、基于序列的分子、序列編碼的分子或其組合。在另一優(yōu)選例中,所述化合物包括選自下組的至少一種分子:全反式-視黃酸(all-trans-retinoicacid);9-順式-視黃酸(9-cisretinoicacid);維甲酸(retinoid)及其類似物、受體(receptor)、或配體(ligand);Nurr-1及其途徑調(diào)劑;sonichedgehog及其途徑調(diào)劑;煙酰胺(nicotinamide)及其類似物、受體、或配體;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(nicotinamideadeninedinucleotide)和NAD依賴性酶、其活化劑或抑制劑;和Nkx2.5及其途徑調(diào)劑。在另一優(yōu)選例中,所述的特定譜系的人體細(xì)胞包括神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和心臟系統(tǒng)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞選自神經(jīng)外胚層細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元源祖細(xì)胞、神經(jīng)元前體細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、色素神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元、人腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞、和人腦腹側(cè)的神經(jīng)元。在另一優(yōu)選例中,所述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)選自下組的至少2種細(xì)胞標(biāo)記物:Nurr-1、SSEA-1、微管蛋白(beta-III-tubulin)、MAP-2、神經(jīng)元核抗原(NeuN)、microRNAhsa-miR-10,microRNAhsa-let-7、乙?;慕M蛋白(acetylatedhistones)、BRG-1、和hSNF2H。在另一優(yōu)選例中,所述的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞包括多巴胺能神經(jīng)元和運動神經(jīng)元、并且表達(dá)選自下組的至少1種細(xì)胞標(biāo)記物:酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase)、Lmx1、MSX1、Pitx3、HB9、Lim3,和Isl1。在另一優(yōu)選例中,所述的心臟系統(tǒng)細(xì)胞選自心臟中胚層細(xì)胞、心臟細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、心臟的前體細(xì)胞、心臟源祖細(xì)胞、心血管細(xì)胞、和心肌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的心臟系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)選自下組的至少2種細(xì)胞標(biāo)記物:Nkx2.5、輔肌動蛋白(alpha-actinin)、SSEA-1、心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、MEF2c、GATA-4、心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)、心肌鈣蛋白-T(cTnT)、VE-鈣粘蛋白(VEcadherin)、血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)、SM22alpha、和H1-調(diào)寧蛋白(H1-calponin)。在另一優(yōu)選例中,所述的心臟系統(tǒng)細(xì)胞包括具有自發(fā)性節(jié)律性收縮跳動的心肌細(xì)胞。本發(fā)明的第二方面,提供了一種制備組織工程構(gòu)建物的方法,所述方法包括步驟:(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法,從多能人類干細(xì)胞產(chǎn)生特定譜系的人體細(xì)胞;及(ii)制造組織工程構(gòu)建物,將所述特定譜系的人體細(xì)胞或其功能性衍生物加入到一個結(jié)構(gòu)模板,制備所述組織工程構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中,所述結(jié)構(gòu)模板包括細(xì)胞外基質(zhì)、生物材料支架、整個器官的支架、組織支架、器官支架、和合成或純化的基質(zhì)蛋白。本發(fā)明的第三方面,提供了一種藥物篩選的方法,所述方法包括步驟:(i)根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法,從多能人類干細(xì)胞產(chǎn)生特定譜系的人體細(xì)胞;(ii)篩查化合物或細(xì)胞產(chǎn)物對于該特定譜系的人體細(xì)胞及其功能性衍生物的效果;所述效果是指>50%細(xì)胞對化合物或細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)生反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中,所述步驟(ii)中使用高通量方法。本發(fā)明的第四方面,提供了一種藥物篩選的方法,所述方法包括步驟:(i)根據(jù)本發(fā)明第二方面所述的方法制備組織工程構(gòu)建物;(ii)篩查化合物或細(xì)胞產(chǎn)物對于該組織工程構(gòu)建的效果,所述效果是指>50%細(xì)胞對化合物或細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)生反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中,所述步驟(ii)中使用高通量方法。本發(fā)明的第五方面,提供了一種細(xì)胞治療的方法,所述方法包括步驟:(i)根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法,直接從多能人類干細(xì)胞產(chǎn)生特定譜系的人體細(xì)胞;(ii)給病癥患者施用該特定譜系的人體細(xì)胞及其功能性衍生物;(iii)確定該特定譜系的人體細(xì)胞及其功能性衍生物是否有恢復(fù)組織和功能的效力;如果有效,(ⅳ)鑒定該特定譜系的人體細(xì)胞及其功能性衍生物為病人需要這種治療的細(xì)胞治療法產(chǎn)品或藥物。本發(fā)明的第六方面,提供了一種聯(lián)合細(xì)胞治療法的方法,所述方法包括步驟:(i)根據(jù)本發(fā)明第二方面所述的方法制造組織工程構(gòu)建物;(ⅱ)給病癥患者施用該組織工程構(gòu)建物;(iii)確定該組織工程構(gòu)建物是否有恢復(fù)組織和功能的效力;如果有效,(ⅳ)鑒定該組織工程構(gòu)建物為病人需要這種治療的聯(lián)合細(xì)胞治療法產(chǎn)品或藥物。在另一優(yōu)選例中,所述病癥包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心臟系統(tǒng)疾病。在另一優(yōu)選例中,所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)退化性疾病,脊髓損傷,運動神經(jīng)元病,阿爾茨海默氏病(Alzheimer'sdisease),帕金森氏癥(Parkinson'sdisease),多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis),肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis),脊髓性肌萎縮癥(spinalmuscularatrophy),腦損傷,中風(fēng)(stroke),和黃斑退化(maculardegeneration)。在另一優(yōu)選例中,所述的心臟系統(tǒng)疾病包括心臟疾病和衰竭,心肌梗死(myocardialinfarction),心肌病(cardiomyopathy),缺血性心臟疾病(ischemicheartdisease),心臟衰竭(congestiveheartfailure),中風(fēng),和冠心病(coronaryarterydisease)。應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了小分子定向分化誘導(dǎo)良好控制高效轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞直接成神經(jīng)細(xì)胞新技術(shù)的概略時間表。圖2顯示了小分子定向分化誘導(dǎo)良好控制高效轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞直接成心肌細(xì)胞新技術(shù)的概略時間表。圖3顯示了比較通過小分子定向分化誘導(dǎo)良好控制高效轉(zhuǎn)化高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞直接成神經(jīng)細(xì)胞的新技術(shù)(Neuronal,>90%)與通過自發(fā)胚層誘導(dǎo)多能人類干細(xì)胞多譜系分化的常規(guī)分化方法(Control,5-10%)的分化效率。圖4顯示了比較通過小分子定向分化誘導(dǎo)良好控制高效轉(zhuǎn)化高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞直接成心肌細(xì)胞的新技術(shù)(Cardiac,>90%)與通過自發(fā)胚層誘導(dǎo)多能人類干細(xì)胞多譜系分化的常規(guī)分化方法(Control,<4%)的分化效率。圖5顯示了多能人類胚胎干細(xì)胞通過小分子誘導(dǎo)神經(jīng)定向分化。RA通過促進神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子Nurr-1的核易位誘導(dǎo)維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的未分化的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類胚胎干細(xì)胞神經(jīng)衍生物高效發(fā)展為神經(jīng)細(xì)胞。圖6顯示了多能人類胚胎干細(xì)胞通過小分子誘導(dǎo)心肌定向分化。(A)NAM誘導(dǎo)維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的未分化的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類胚胎干細(xì)胞開始表達(dá)早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子CSX/Nkx2.5。(B)NAM誘導(dǎo)的人類胚胎干細(xì)胞心臟衍生物高效發(fā)展為跳動的心肌細(xì)胞。(C)代表性人類胚胎干細(xì)胞衍生的跳動心肌細(xì)胞及其強節(jié)奏收縮類似臨床的心電圖。具體實施方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究,獲得一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化的技術(shù),實驗結(jié)果表明,使用本發(fā)明的方法能夠高效的誘導(dǎo)多能人類干細(xì)胞產(chǎn)生特定譜系的人體細(xì)胞。在實驗中本發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中的各個組分含量特別是層粘連蛋白(laminin)的含量對細(xì)胞分化具有顯著的影響。經(jīng)過大量的實驗,本發(fā)明分別確定了誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和心臟細(xì)胞的定義培養(yǎng)基的最佳組成。本發(fā)明一般涉及到的領(lǐng)域是多能人類干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)。本發(fā)明提供的技術(shù)可以大規(guī)模地直接從多能人類干細(xì)胞通過小分子定向分化誘導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的高純度特定譜系的人體細(xì)胞,為用于細(xì)胞治療法和商業(yè)化提供了大規(guī)模生產(chǎn)或用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞及其功能性人體細(xì)胞療法衍生物的途徑。具體來說,本發(fā)明的醫(yī)療創(chuàng)新提供了高純度功能性人體神經(jīng)細(xì)胞和心臟肌肉細(xì)胞的新穎的商業(yè)來源為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心肌修復(fù)。本發(fā)明提供了技術(shù),方法和產(chǎn)品通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和臨床上的特定譜系功能性人體細(xì)胞可用于組織和器官工程和再生,細(xì)胞治療法,藥物研發(fā)和測試,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,干細(xì)胞庫,和臨床應(yīng)用。本發(fā)明提供的技術(shù),方法和產(chǎn)品通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和臨床上的特定譜系功能性人體細(xì)胞可用于組織和器官工程和再生,細(xì)胞治療法,藥物研發(fā)和測試,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,干細(xì)胞庫,和臨床應(yīng)用。多能人類干細(xì)胞可以用于恢復(fù)人體組織和器官的功能,但發(fā)揮多能人類干細(xì)胞的巨大潛力一直受到產(chǎn)生所需的人體細(xì)胞類型通過多譜系分化的低效率和不穩(wěn)定性的阻礙。本發(fā)明提供的技術(shù)可以大規(guī)模地直接從多能人類干細(xì)胞通過小分子定向分化誘導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的高純度特定譜系的人體細(xì)胞,為用于細(xì)胞治療法和商業(yè)化提供了大規(guī)模生產(chǎn)或制造優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞及其功能性人體細(xì)胞療法衍生物的途徑。具體來說,本發(fā)明的醫(yī)療創(chuàng)新提供了高純度功能性人體神經(jīng)細(xì)胞和心臟肌肉細(xì)胞的新穎的商業(yè)來源為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心肌修復(fù)。本發(fā)明提供了技術(shù),方法和產(chǎn)品通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和臨床上的特定譜系功能性人體細(xì)胞可用于組織和器官工程和再生,細(xì)胞治療法,藥物研發(fā)和測試,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,干細(xì)胞庫,和臨床應(yīng)用。本發(fā)明提供了技術(shù)通過小分子定向分化誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞一致地成與臨床相關(guān)上的特定譜系人體細(xì)胞。本發(fā)明提供了技術(shù)為從多能人類干細(xì)胞用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范大規(guī)模高效生產(chǎn)高質(zhì)量臨床級無異物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)細(xì)胞類型和亞型用于針對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)再生和更換療法。本發(fā)明提供了技術(shù)為從多能人類干細(xì)胞用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范大規(guī)模高效生產(chǎn)高質(zhì)量臨床級無異物的人心臟前體細(xì)胞和人心肌細(xì)胞用于針對心臟疾病和衰竭的心肌再生和更換療法。因此,本發(fā)明的一個實施方案是提供了一種用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的生產(chǎn)方法通過小分子定向分化誘導(dǎo)直接從維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的多能人類干細(xì)胞來生產(chǎn)高質(zhì)量臨床級無異物的與臨床相關(guān)上的特定譜系人體細(xì)胞。本發(fā)明的另一個首選實施方案是提供了一種方法通過小分子定向分化誘導(dǎo)用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞成為特定譜系的功能性人體細(xì)胞可用于組織工程,藥物研發(fā),藥物測試,和細(xì)胞療法。本發(fā)明的一個具體的實施方案是提供了一種方法通過使用視黃酸(retinoicacid)誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向分化出神經(jīng)外胚層通過促進神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子Nurr-1的核易位及觸發(fā)神經(jīng)元譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明的另一個具體的實施方案是提供了一種方法通過使用煙酰胺(nicotinamide)誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向分化出心臟中胚層通過促進早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子CSX/Nkx2.5的表達(dá)及觸發(fā)心臟譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人心臟前體細(xì)胞和跳動的人心肌細(xì)胞。下面的說明進一步闡明這些和其它一些本發(fā)明的實施方案。發(fā)明詳述多能人類胚胎干細(xì)胞保持用于恢復(fù)細(xì)胞,組織,和器官功能的巨大潛力。然而,實現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞的發(fā)育和治療潛力一直受到產(chǎn)生所需的人體細(xì)胞類型通過多譜系分化的低效率和不穩(wěn)定性的阻礙。基于維持在定義培養(yǎng)條件下的多能人類干細(xì)胞能夠通過小分子定向分化誘導(dǎo)一致地轉(zhuǎn)變成一個特定譜系的人體細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),本發(fā)明為用于細(xì)胞治療法和商業(yè)化提供了用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模生產(chǎn)或制造優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞及其功能性人體細(xì)胞療法衍生物的途徑。該醫(yī)療創(chuàng)新提供了高純度功能性人體神經(jīng)細(xì)胞和心臟肌肉細(xì)胞的新穎的商業(yè)來源為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心肌修復(fù)。本發(fā)明提供了技術(shù),方法和產(chǎn)品通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和臨床上的特定譜系功能性人體細(xì)胞可用于組織和器官工程和再生,細(xì)胞治療法,藥物研發(fā)和測試,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,干細(xì)胞庫,和臨床應(yīng)用。具體來說,確定了視黃酸(retinoicacid)足以誘導(dǎo)維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞從多能狀態(tài)直接定向分化成神經(jīng)外胚層通過促進神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子Nurr-1的核易位并觸發(fā)神經(jīng)元譜系特定性的高效高純度的發(fā)展為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞[1-3,6-13]。同樣地,確定了煙酰胺(nicotinamide)足以誘導(dǎo)維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞從多能狀態(tài)直接定向分化成心臟中胚層通過促進早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子CSX/Nkx2.5的表達(dá)并觸發(fā)心臟譜系特定性的高效高純度的發(fā)展為人心臟前體細(xì)胞和跳動的人心肌細(xì)胞[1-3,5-7,9]。該醫(yī)療創(chuàng)新不僅提供了大量適于臨床應(yīng)用的人神經(jīng)元細(xì)胞治療產(chǎn)品用于針對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)再生和更換療法和大量適于臨床應(yīng)用的人心臟細(xì)胞治療產(chǎn)品用于針對心臟疾病和衰竭的心肌再生和更換療法,而且為大量供應(yīng)與臨床相關(guān)的特定譜系人體細(xì)胞衍生物用于再生醫(yī)學(xué)提供了小分子定向直接控制人類胚胎干細(xì)胞的多能狀態(tài)的途徑。最初衍生的人類胚胎干細(xì)胞需要用生長停滯的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來一起培養(yǎng),,因為傳遞病原體,改變遺傳背景,促進免疫原性蛋白的表達(dá)的風(fēng)險而削弱了這些細(xì)胞的治療潛力[1-3]。盡管已經(jīng)開發(fā)了用于人類胚胎干細(xì)胞的一些用人的飼養(yǎng)細(xì)胞,不用飼養(yǎng)細(xì)胞,和化學(xué)配制的培養(yǎng)系統(tǒng),對人類胚胎干細(xì)胞的自我更新的必需因素仍未了解[1-3]。雖然這些外源的飼養(yǎng)細(xì)胞和生物試劑有助于保持未分化的胚胎干細(xì)胞的長期穩(wěn)定性增長,但也掩蓋了人類胚胎干細(xì)胞對發(fā)育信號作出反應(yīng)的能力。因此,我已試圖系統(tǒng)地減少未分化的人類胚胎干細(xì)胞的生長需求到最少的定義組成培養(yǎng)元素,并確定了堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),胰島素(insulin),抗壞血酸(ascorbicacid),和層粘連蛋白(laminin)作為維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞的胚層(epiblast)多能性的最少的定義組成培養(yǎng)元素,為從頭衍生適于臨床應(yīng)用的人類胚胎干細(xì)胞及有效地使用小分子誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞一致地向功能性人體細(xì)胞譜系定向分化提供了一個平臺[1-3]。為了實現(xiàn)一致轉(zhuǎn)換多能人類胚胎干細(xì)胞為特定的細(xì)胞譜系,我已用該定義培養(yǎng)系統(tǒng)來篩選各種小分子和生長因子對人類胚胎干細(xì)胞的多能狀態(tài)的分化誘導(dǎo)作用[1-3,5,6,8]。雖然神經(jīng)譜系細(xì)胞出現(xiàn)在人類胚胎干細(xì)胞分化相對早期的分化階段,用視黃酸處理治療人類胚胎干細(xì)胞分化的多譜系聚集體或胚狀體僅略增神經(jīng)元的分化[1]。視黃酸(Retinoicacid)不足以誘導(dǎo)維持在先前報道的培養(yǎng)條件含有飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的未分化的人類胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)元[1]。不過,我發(fā)現(xiàn),該定義培養(yǎng)條件足以使小分子視黃酸誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞從多能狀態(tài)直接定向分化成神經(jīng)外胚層并觸發(fā)高效的發(fā)展為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞通過促進神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子Nurr-1的核易位,Nurr-1是孤兒核激素受體超級家族的一個成員牽連腹側(cè)神經(jīng)元發(fā)育,特別是對腹側(cè)中腦發(fā)育和多巴胺神經(jīng)元(dopaminergicneuron)分化限速步驟中的酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase)的活化[1-3,8-13]。同樣地,該定義培養(yǎng)條件足以使小分子煙酰胺誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞從多能狀態(tài)直接定向分化成心臟中胚層并觸發(fā)高效的發(fā)展為人心臟前體細(xì)胞和跳動的人心肌細(xì)胞通過促進早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子CSX/Nkx2.5的表達(dá)[1-3,5,6,9]。該化合物不足以誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞分化的多譜系聚集體或胚狀體或維持在先前報道的培養(yǎng)條件含有飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的未分化的人類胚胎干細(xì)胞分化[1]。這一發(fā)現(xiàn)為良好控制高效率通過小分子定向分化誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成與臨床相關(guān)的特定的細(xì)胞譜系提供了一個平臺[1-3]。不像那兩種典型的類似神經(jīng)上皮細(xì)胞對巢蛋白(nestin)標(biāo)記物呈現(xiàn)陽性的無論是從人類胚胎干細(xì)胞或中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞,這種新穎的人神經(jīng)前體細(xì)胞已經(jīng)視黃酸體外誘導(dǎo)多能人類胚胎干細(xì)胞而獲得神經(jīng)外胚層的特性,不表達(dá)巢蛋白,但一致呈現(xiàn)強度的核型的Nurr-1表達(dá)。雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)體內(nèi)發(fā)育過程而獲得其神經(jīng)外胚層的特性并呈現(xiàn)中度的核型的Nurr-1表達(dá),人類胚胎干細(xì)胞衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞,Nurr-1定位于細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì),這表明其無活性[10]。允許附著后,跟人類胚胎干細(xì)胞衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞(~6%)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)衍生的人神經(jīng)干細(xì)胞(~13%)在相同的神經(jīng)分化條件下產(chǎn)生beta-III-微管蛋白(-III-tubulin)的低效率相比,人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物beta-III-微管蛋白并共表達(dá)MAP-2的效率的急劇增長(~94%)[10]。沒出現(xiàn)其他神經(jīng)譜系細(xì)胞,例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,對GFAP呈陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和對MBP呈陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞,或非神經(jīng)細(xì)胞。此類神經(jīng)元細(xì)胞制品也可以胰蛋白酶(trypsin)分離并保持為單層。這些人類胚胎干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞于是有相當(dāng)大的比例開始表達(dá)與位于腹側(cè)神經(jīng)元群體相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物,如酪氨酸羥化酶(多巴胺神經(jīng)元)和HB9/Lim3/Isl1(運動神經(jīng)元)。根據(jù)目前使用的在該領(lǐng)域現(xiàn)存的方法,多能人類干細(xì)胞衍生的細(xì)胞制品含有異質(zhì)群體的混合細(xì)胞類型,包括完全分化的細(xì)胞,大量的各種程度部分分化或未分化的細(xì)胞,和少量的未分化的多能人類干細(xì)胞,提出了一個當(dāng)給病癥患者施用上潛在的安全性問題[1-3]。與此相反,人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞制品含有同質(zhì)群體的人神經(jīng)前體細(xì)胞具有產(chǎn)生大量的神經(jīng)元細(xì)胞的潛力(~94%)。在這種新穎的人類胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞產(chǎn)物中輔助細(xì)胞(例如,其它類型的神經(jīng)細(xì)胞)和不適當(dāng)?shù)募?xì)胞(例如,未分化的人類胚胎干細(xì)胞,細(xì)胞毒性細(xì)胞,和非神經(jīng)細(xì)胞)是檢測不到的。人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞只高效地產(chǎn)生神經(jīng)元,并沒有分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,表明這些對Nurr-1呈陽性的人神經(jīng)前體細(xì)胞是一種新穎的神經(jīng)元前體細(xì)胞比典型的類似神經(jīng)上皮細(xì)胞對巢蛋白(nestin)標(biāo)記物呈現(xiàn)陽性的人神經(jīng)干細(xì)胞更具特定的神經(jīng)元譜系。該小分子定向分化誘導(dǎo)方法從人類胚胎干細(xì)胞的多能狀態(tài)以神經(jīng)元譜系特定性地高效高純度地直接產(chǎn)生對核型的Nurr-1呈陽性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞,因此,可以通過消除未分化的人類胚胎干細(xì)胞和非神經(jīng)不適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型的存在來最大限度地減少畸胎瘤和異位組織形成的風(fēng)險。該醫(yī)療創(chuàng)新將大大增加依賴于移植的神經(jīng)元更換和再生的臨床療效及人類胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞產(chǎn)品用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的安全。同樣地,該小分子定向分化誘導(dǎo)方法從人類胚胎干細(xì)胞的多能狀態(tài)以心臟譜系特定性地高效高純度地直接產(chǎn)生人心臟前體細(xì)胞和人心肌細(xì)胞,因此,可以通過消除未分化的人類胚胎干細(xì)胞和非心臟不適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型的存在來最大限度地減少畸胎瘤和異位組織形成的風(fēng)險。該醫(yī)療創(chuàng)新將大大增加依賴于移植的心肌細(xì)胞更換和再生的臨床療效及人類胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞產(chǎn)品用于心血管修復(fù)的安全。微核糖核酸(MicroRNA)是新興的干細(xì)胞多能性和分化的重要調(diào)節(jié)因子。微核糖核酸是小小分子,進化上保守的非編碼核糖核酸,通過抑制基因(mRNA)翻譯和促進基因(mRNA)降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。微核糖核酸作為基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的控制人,從而調(diào)節(jié)發(fā)育或疾病中復(fù)雜的細(xì)胞表型。微核糖核酸芯片剖面(microarrayprofile)分析表明,與多能性相關(guān)的微核糖核酸兩個最突出的系列has-miR-302家族和has-miR-371/372/373家族的表達(dá)通過小分子定向分化誘導(dǎo)是急劇下降[9,11]。其中在多能人類胚胎干細(xì)胞中表達(dá)最高的hsa-miR-302家族被完全表達(dá)沉默,這表明人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞不像以往的人類胚胎干細(xì)胞通過多譜系分化衍生的細(xì)胞產(chǎn)物,不包含任何殘留的多能人類干細(xì)胞。微核糖核酸基因組的芯片剖面分析的敏感性,特異性,穩(wěn)健性和精確性足以表明人類胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞產(chǎn)物的同質(zhì)性和特質(zhì)性,因此,當(dāng)施用于患者時的安全性和有效性。一組微核糖核酸的表達(dá)通過視黃酸神經(jīng)誘導(dǎo)后顯示上調(diào),通過煙酰胺心肌誘導(dǎo)后顯示下調(diào)[9]。值得注意的是,hsa-miR-10系列在未分化的人類胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)沉默,但通過視黃酸神經(jīng)誘導(dǎo)后急劇上升[9,11]。該miR-10基因位于Hox基因簇系的發(fā)育調(diào)節(jié)因子內(nèi)并共同表達(dá)一組Hox基因來抑制轉(zhuǎn)錄[9]。小鼠Hoxb-1的基因增強因子控制對視黃酸的反應(yīng)并主要在神經(jīng)外胚層中調(diào)節(jié)基因表達(dá),該因子含有視黃酸反應(yīng)元件,它不僅涉及到對視黃酸的異位反應(yīng),但也對建立Hoxb-1在胚胎發(fā)育中的早期基因表達(dá)模式必不可少[9]。hsa-miR-10表達(dá)急劇上升表明,在視黃酸誘導(dǎo)時,視黃酸誘導(dǎo)Hox基因表達(dá)并共表達(dá)Hox微核糖核酸hsa-miR-10來沉默與多能性相關(guān)的基因和has-miR-302以驅(qū)動神經(jīng)外胚層表型和神經(jīng)元命運[9,11]。let-7微核糖核酸下調(diào)與多能性相關(guān)的基因如myc和lin28[9,11]。這些數(shù)據(jù)顯示人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞已經(jīng)獲得了神經(jīng)元特性通過沉默與多能性相關(guān)的微核糖核酸的表達(dá),并誘導(dǎo)高水平的與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和功能相關(guān)的微核糖核酸的表達(dá),與其神經(jīng)生長的高能力一致。一組獨特的微核糖核酸,其中許多以前不知道到涉及神經(jīng)發(fā)育和功能,有助于多能人類胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)命運的起源和神經(jīng)元發(fā)展[9,11]。一組微核糖核酸的表達(dá)通過煙酰胺心肌誘導(dǎo)后顯示上調(diào),通過視黃酸神經(jīng)誘導(dǎo)后顯示下調(diào)[9]。一組新型的微核糖核酸,其中許多以前不知道到涉及心臟發(fā)育和功能,有助于多能人類胚胎干細(xì)胞的心臟命運的起源和心肌發(fā)展[9]。微核糖核酸基因組規(guī)模剖面分析鑒定了人類胚胎干細(xì)胞心臟和神經(jīng)小分子定向分化誘導(dǎo)中的新型的發(fā)育起源中的小分子微核糖核酸組[9]。在人類胚胎干細(xì)胞小分子定向分化誘導(dǎo)中,獨特的一組與多能性相關(guān)的微核糖核酸顯示下調(diào),而新穎的驅(qū)動心臟和神經(jīng)的微核糖核酸表達(dá)上調(diào),包括通過視黃酸神經(jīng)誘導(dǎo)后沉默與多能性相關(guān)的hsa-miR-302系列的表達(dá)并大幅增加驅(qū)動神經(jīng)的Hox微核糖核酸hsa-miR-10系列的表達(dá)[9]。這一發(fā)現(xiàn)為大量供應(yīng)與臨床相關(guān)的細(xì)胞譜系用于再生療法打開了一個小分子介導(dǎo)的對人類胚胎干細(xì)胞多能性命運的直接調(diào)控的新的層面。該醫(yī)療創(chuàng)新為良好控制高效率從多能人類胚胎干細(xì)胞衍生大量的健壯的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和特定譜系的功能性成體細(xì)胞可用于臨床上組織和器官的再生和修復(fù)。為了解決這種新型的人神經(jīng)前體細(xì)胞是否可以安全移植于腦內(nèi)并可在體內(nèi)遷移和保留其神經(jīng)源性能的問題,人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞移植到新生小鼠的腦室。這條途徑進入腦室下區(qū)很佳,腦室下區(qū)是一個輔助生發(fā)區(qū)從此細(xì)胞廣泛地遷移并應(yīng)對適當(dāng)?shù)膮^(qū)域發(fā)育線索。至少移植3個月后,將小鼠處理用于組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人神經(jīng)前體細(xì)胞可移植并在大腦的神經(jīng)區(qū)域內(nèi)廣泛地遷移,廣泛地產(chǎn)生了分散良好綜合良好的人神經(jīng)元,包括對nurr-1呈現(xiàn)陽性的多巴胺能神經(jīng)元,顯示了其對神經(jīng)元再生和更換細(xì)胞療法的潛力。移植后沒有移植物過度生長,形成畸胎瘤或腫瘤,或出現(xiàn)非神經(jīng)元細(xì)胞類型。未分化的多能人類干細(xì)胞可長期大量培養(yǎng)并穩(wěn)定增長,具有內(nèi)在潛力分化成所有的人體細(xì)胞。這些特征表明多能人類干細(xì)胞具有恢復(fù)人體組織和器官功能的巨大的潛力??茖W(xué)家和研究人員面臨的一貫挑戰(zhàn)是良好控制高效率誘導(dǎo)多能人類胚胎干細(xì)胞一致地成與臨床相關(guān)上的特定譜系人體細(xì)胞。這些方面不僅對組織和器官工程及再生細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療法,而且對于藥物研發(fā)有關(guān)鍵作用。實際上,當(dāng)今的人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品構(gòu)成了一個新的細(xì)胞藥物概念作為能夠提供與恢復(fù)人體組織和功能有關(guān)的藥理活性。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞和心肌細(xì)胞這兩種細(xì)胞系統(tǒng)的有限的自我修復(fù)能力使它們適合于基于干細(xì)胞衍生物的神經(jīng)元和心肌療法。干細(xì)胞療法衍生物的臨床應(yīng)用為許多不治之癥或迄今無法治療的神經(jīng)退化疾病和心臟疾病提供了可成功的選擇。然而,目前在干細(xì)胞研究上的一個限制因素是因為缺乏具有足夠神經(jīng)潛力可移植的適合于臨床的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞。新穎的解決方法對開發(fā)安全和有效的細(xì)胞療法再生各種神經(jīng)疾病中受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和電路至關(guān)重要。對于心血管疾病的研究,缺乏具有足夠心肌再生潛力的適合于臨床的人體心肌細(xì)胞也是實現(xiàn)再生人體受損心臟肌肉的主要障礙。本發(fā)明在有關(guān)多能人類干細(xì)胞小分子定向分化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成特定譜系的人體細(xì)胞的干細(xì)胞研究上取得了顯著的進步,代表在為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肌修復(fù)的人神經(jīng)元和心肌治療產(chǎn)品臨床上的進展。本發(fā)明提供了一個技術(shù)平臺提供當(dāng)前唯一具有足以再生神經(jīng)元和收縮心肌的藥效力人體細(xì)胞產(chǎn)品來源可用于臨床修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的功能。本發(fā)明克服了臨床應(yīng)用多能人類干細(xì)胞療法衍生物的一些主要障礙,包括建立獨特的定義培養(yǎng)系統(tǒng)人類干細(xì)胞技術(shù)平臺用于衍生和維持臨床級高質(zhì)量的多能人類干細(xì)胞系及其小分子定向分化誘導(dǎo)的特定譜人體細(xì)胞,這為建立安全和有效的干細(xì)胞療法以解決主要的健康問題打下了基礎(chǔ)。該技術(shù)可以通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化在定義的培養(yǎng)條件下的多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人神經(jīng)前體細(xì)胞和功能性人神經(jīng)細(xì)胞足以用于臨床前和臨床開發(fā)針對各種神經(jīng)疾病的安全和有效的干細(xì)胞療法再生神經(jīng)。同樣地,這種技術(shù)也可以通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化在定義的培養(yǎng)條件下的多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人心臟前體細(xì)胞和功能性心肌細(xì)胞足以用于臨床前和臨床開發(fā)針對心血管疾病的安全和有效的干細(xì)胞療法再生收縮性心肌。本發(fā)明極大地增加了移植物依賴性神經(jīng)元更換的臨床療效和多能人類干細(xì)胞衍生的細(xì)胞產(chǎn)品的安全性可進行大量再生。本發(fā)明提供了技術(shù)平臺為大規(guī)模生產(chǎn)或制造高質(zhì)量臨床級的人神經(jīng)和心肌細(xì)胞治療產(chǎn)品藥物可以提供足以再生中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的藥效力來滿足醫(yī)療上的挑戰(zhàn)。本發(fā)明提供定義培養(yǎng)系統(tǒng)用于衍生和維持臨床級高質(zhì)量的多能人類干細(xì)胞,其中允許除去,取代,和用定義的人替代品優(yōu)化在培養(yǎng)系統(tǒng)中所有不良的未指明的生物成分和基質(zhì),包括那些來自于動物的,可用于從頭衍生和長期維持從未被動物細(xì)胞和蛋白污染的用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的優(yōu)質(zhì)無異物穩(wěn)定的多能人類干細(xì)胞及其人體細(xì)胞療法的衍生物,因此適合于治療開發(fā)和臨床應(yīng)用。本發(fā)明還提供了小分子定向分化誘導(dǎo)的多能人類干細(xì)胞的特定譜系人體細(xì)胞,使神經(jīng)或心臟譜系細(xì)胞直接從多能人類干細(xì)胞的多能狀態(tài)通過小分子定向分化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化出來,是一個臨床應(yīng)用人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞療法衍生物的重要里程碑,所有的其他現(xiàn)有的方法相比將提供在效率,穩(wěn)定性,安全性,有效性的優(yōu)點,并且可用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范設(shè)施進行大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)臨床級人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品用于商業(yè)和治療。這種干細(xì)胞技術(shù)的突破將非功能多能人類干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量的命運受限的功能性細(xì)胞治療衍生物或產(chǎn)品有商業(yè)和治療用途,標(biāo)志著基于細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)從目前的動物研究向人體試驗或在人類的首次研究的一個轉(zhuǎn)折點。該醫(yī)療創(chuàng)新提供了足以再生神經(jīng)元和收縮心臟肌肉的人體神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞的可用的商業(yè)來源對于許多神經(jīng)和心血管疾病臨床上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心肌修復(fù)至關(guān)重要。本發(fā)明提供了有商業(yè)和治療用途的下一代人類細(xì)胞治療產(chǎn)品,在純度,大規(guī)模生產(chǎn),高質(zhì)量,安全性,有效性上超過所有其他現(xiàn)有來源的人體細(xì)胞。本發(fā)明提供了與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟有關(guān)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和功能性人神經(jīng)元和心肌細(xì)胞可用于干細(xì)胞庫,體外和體內(nèi)的干細(xì)胞研究,移植,人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟組織和器官工程,基于細(xì)胞的為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟疾病的再生醫(yī)學(xué)或療法,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造用于商業(yè)和治療,細(xì)胞治療法,藥物篩選,藥物研發(fā)和測試,毒性和安全性測試,組織工程和再生,以及其它商業(yè)和治療目的。該醫(yī)療創(chuàng)新能開發(fā)多能人類干細(xì)胞衍生的治療產(chǎn)品和供應(yīng)來源,包括患者特異性的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞,針對疾病的功能性人體細(xì)胞,細(xì)胞或生物工程的人體組織和更換器官可用于臨床上修理或重建或更換損壞的人體結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò),以及開發(fā)技術(shù)和方法為人體組織和器官的再生,包括高通量和高含量測定,分析和操作工具,治療策略和平臺,以及組織和器官工程或再生的途徑或工具。神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)和心肌細(xì)胞有限的自我修復(fù)能力構(gòu)成在科學(xué)界和臨床領(lǐng)域的一個顯著挑戰(zhàn)。神經(jīng)退化和心臟疾病對世界范圍內(nèi)的醫(yī)療體系帶來昂貴的花費,所以強調(diào)對這些治療需求提供更新更高效的解決方案。干細(xì)胞療法衍生物的臨床應(yīng)用為許多不治之癥或迄今無法治療的神經(jīng)退化疾病和心臟疾病提供了可成功的選擇。本發(fā)明通過提供新穎,獨特的臨床上的解決方案來塑造醫(yī)學(xué)的未來。事實上,目前認(rèn)為無法治愈或無法治療的疾病現(xiàn)在通過臨床應(yīng)用本發(fā)明的多能人類干細(xì)胞療法衍生物能找到有力的選擇。本發(fā)明提供的人類干細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞治療產(chǎn)品代表一種新型的細(xì)胞藥物能夠提供新的藥效,包括恢復(fù)組織和功能。該醫(yī)療創(chuàng)新利用小分子定向分化誘導(dǎo)高效率地直接轉(zhuǎn)換多能人類干細(xì)胞成適合于開發(fā)新的,安全的,并具有成本效益的干細(xì)胞療法的高純度的人神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的商業(yè)來源。本發(fā)明提供了技術(shù)平臺以允許從高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞高效生產(chǎn)人神經(jīng)元前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞類型和亞型來開發(fā)針對許多神經(jīng)疾病的臨床設(shè)置的神經(jīng)元再生和更換療法。同樣地,本發(fā)明提供了技術(shù)平臺以允許從高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞高效生產(chǎn)人心臟前體細(xì)胞和人心肌細(xì)胞來開發(fā)針對心臟疾病和衰竭的臨床設(shè)置的心肌再生和更換療法。作為一種新型的干細(xì)胞治療產(chǎn)品,臨床應(yīng)用多能人類胚胎干細(xì)胞療法衍生物為神經(jīng)和心臟修復(fù)是治療市場的新機會。目前沒有經(jīng)過食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的人類胚胎干細(xì)胞治療產(chǎn)品。成功開發(fā)干細(xì)胞療法的藥物,人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品進入臨床試驗之前必須滿足在可塑性,特異性和穩(wěn)定性上的某些商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。推動干細(xì)胞研究從目前的動物研究到人體臨床試驗必須解決商業(yè)和治療性用途這些實際問題,包括:1)該人體干細(xì)胞及其細(xì)胞療法的衍生物產(chǎn)品必須能以工業(yè)規(guī)模進行制造;2)該人體干細(xì)胞及其細(xì)胞療法的衍生物產(chǎn)品必須能夠長期保持其正?;蚍€(wěn)定性增殖;和3)該人體干細(xì)胞及其細(xì)胞療法的衍生物產(chǎn)品必須能夠分化成修復(fù)或再生所需的足夠數(shù)量的特定細(xì)胞類型或譜系。這些實際問題對于指定任何人類干細(xì)胞作為人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品向食品藥品監(jiān)督管理局提交一份研究新藥申請(IND)并進入人體試驗或首次人體研究是必要的。該醫(yī)療創(chuàng)新提供了人類干細(xì)胞療法治療產(chǎn)品原型專門解決和克服在多能人類干細(xì)胞治療效用臨床應(yīng)用上的那些主要障礙或問題,包括在高效率,穩(wěn)定性,低腫瘤風(fēng)險,高純度,療效高,以及在用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的設(shè)施安全性和規(guī)?;a(chǎn)高質(zhì)量人類細(xì)胞治療產(chǎn)品用于商業(yè)治療上優(yōu)于所有其他現(xiàn)有的途徑。該醫(yī)療創(chuàng)新首次提供了以多能人類干細(xì)胞為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的細(xì)胞療法衍生物來滿足人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品的商業(yè)和治療性開發(fā)的指標(biāo)。本文所描述的方法,組合物,工具和產(chǎn)品是目前優(yōu)選的代表實施方案,是示例性的并且不旨在作為對本發(fā)明范圍的限制。其中的變化和其它用途將對本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)生涵蓋在本發(fā)明的精神內(nèi)并且由公開的范圍確定。因此,對本領(lǐng)域技術(shù)人員這將是顯而易見的對所公開的本發(fā)明可以作不同的替換和修改,而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。方法使用小分子誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞系特異性分化。在所定義的培養(yǎng)條件下維持未分化的人類胚胎干細(xì)胞(10毫米),播種后第3天治療4-5天,然后使其以在HESC介質(zhì)浮動蜂窩集群(cardioblasts)中的懸浮液培養(yǎng)4-5天。允許附著到組織培養(yǎng)底物后,將cardioblasts進一步用NAM(10毫米),用于一個星期,并培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基由DMEM/F-12(90%),所定義的FBS(Hyclone公司)(10%)和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2毫米)。跳動的心肌細(xì)胞中觀察到約一周停藥NAM后,隨著時間的增加在數(shù)字。用于電生理記錄,跳動的心肌細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到華納的RC-27室,灌注用上述培養(yǎng)基,并且當(dāng)填充有3摩爾/L的KCl刺穿用微電極with10M阻力。記錄微電極的前端被定位外面有源訂約區(qū)域和記錄吸管位置的靜止圖像的捕獲用濱松冷卻CCD照相機。場電位,類似于體表心電圖在臨床實踐中通常觀察到的單極,外記錄,使用軸突Multiclamp700A放大器在電流鉗模式和pCLAMP軟件9(Axon儀器)進行檢測。已采用的術(shù)語和表達(dá)被用作描述的術(shù)語而不是限制性的,并且使用這樣的術(shù)語和表達(dá)不意圖排除任何現(xiàn)在存在或以后開發(fā)的出示的相等的特征和描述或局部的特征和描述,不過人們認(rèn)識到可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)作各種修改。從而應(yīng)當(dāng)理解,雖然本發(fā)明已具體公開優(yōu)選實施方案和自選特征,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對公開的詳情作修改和/或變化,并且這樣的修改和變化是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:(1)首次使多能人類干細(xì)胞通過小分子誘導(dǎo)直接從多能狀態(tài)向人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)細(xì)胞定向高效分化;(2)首次使多能人類干細(xì)胞通過小分子誘導(dǎo)直接從多能狀態(tài)向人心臟前體細(xì)胞和人心肌細(xì)胞定向高效分化;(3)首次本提供了技術(shù)通過小分子定向分化誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞一致地成與臨床相關(guān)上的特定譜系人體細(xì)胞;(4)首次提供了以多能人類干細(xì)胞為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的細(xì)胞療法衍生物來滿足人類干細(xì)胞治療產(chǎn)品的商業(yè)和治療性開發(fā)的指標(biāo);(5)首次提供了人類干細(xì)胞療法治療產(chǎn)品原型專門解決和克服在多能人類干細(xì)胞治療效用臨床應(yīng)用上的那些主要障礙或問題,包括在高效率,穩(wěn)定性,低腫瘤風(fēng)險,高純度,療效高,以及在用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的設(shè)施安全性和規(guī)?;a(chǎn)高質(zhì)量人類細(xì)胞治療產(chǎn)品用于商業(yè)治療上優(yōu)于所有其他現(xiàn)有的途徑;(6)首次提供了技術(shù)平臺以允許從高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞高效生產(chǎn)人神經(jīng)元前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞類型和亞型來開發(fā)針對許多神經(jīng)疾病的臨床設(shè)置的神經(jīng)元再生和更換療法;(7)首次提供了技術(shù)平臺以允許從高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞高效生產(chǎn)人心臟前體細(xì)胞和人心肌細(xì)胞來開發(fā)針對心臟疾病和衰竭的臨床設(shè)置的心肌再生和更換療法;(8)首次提供了與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟有關(guān)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和功能性人神經(jīng)元和心肌細(xì)胞可用于干細(xì)胞庫,體外和體內(nèi)的干細(xì)胞研究,移植,人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟組織和器官工程,基于細(xì)胞的為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟疾病的再生醫(yī)學(xué)或療法,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造用于商業(yè)和治療,細(xì)胞治療法,藥物篩選,藥物研發(fā)和測試,毒性和安全性測試,組織工程和再生,以及其它商業(yè)和治療目的;(9)首次提供了一個技術(shù)平臺提供當(dāng)前唯一具有足以再生神經(jīng)元和收縮心肌的藥效力人體細(xì)胞產(chǎn)品來源可用于臨床修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的功能;(10)首次提供了小分子定向分化誘導(dǎo)高效率地直接轉(zhuǎn)換多能人類干細(xì)胞成適合于開發(fā)新的,安全的,并具有成本效益的干細(xì)胞療法的高純度的人神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的商業(yè)來源。(11)本發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中的各組分含量,特別是層粘連蛋白(laminin)的含量對細(xì)胞分化具有顯著的影響。經(jīng)過大量的實驗,本發(fā)明分別確定了誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和心臟細(xì)胞的定義培養(yǎng)基的最佳組成。下面結(jié)合具體實施例,進一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細(xì)條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。實施例1本實施例提供了一種方法通過小分子定向分化誘導(dǎo)用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造(cGMP)的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞成為功能性人體神經(jīng)或細(xì)胞可用于組織工程,藥物研發(fā),藥物測試,和細(xì)胞療法。未分化的多能人類胚胎干細(xì)胞接種并維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中,含有DMEM/F-12或KO-DMEM(knockout-DMEM)(80%),敲除血清替代品(KO)(20%),L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2mM),MEM非必需氨基酸(MNAA,1X),巰基乙醇(0.1mM),純化的人層粘連蛋白(40微克/毫升)[在冷的DMEM/F-12中1:30稀釋]或?qū)诱尺B蛋白/膠原蛋白作為基質(zhì)蛋白,和bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子,20納克/毫升[ng/ml])。敲除血清替代品(KO)可以用含有MEM必需氨基酸(MEAA,1X),人胰島素(20微克/毫升)和抗壞血酸(50微克/毫升)的定義人類要素替換,其中加入人激活素-A(activin-A)(50納克/毫升[ng/ml]),人白蛋白(10毫克/毫升)和人轉(zhuǎn)鐵蛋白(8微克/毫升)以增加細(xì)胞存活和維持正常的細(xì)胞集落形態(tài)和健康。所得的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞可以在定義的條件下維持>50代(>12個月),定期進行分析,證實表達(dá)未分化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物,核型穩(wěn)定,可分化為三個胚層的細(xì)胞(圖5)。實施例2本實施例提供了一種方法通過使用視黃酸(retinoicacid[RA])誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造(cGMP)的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向高效分化出神經(jīng)外胚層通過促進神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子Nurr-1的核易位,及觸發(fā)神經(jīng)元譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞(>90%)(圖1,3,5)。直接從人類胚胎干細(xì)胞的多能狀態(tài)神經(jīng)元譜系特異性分化。接種并維持未分化的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類胚胎干細(xì)胞在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中3天后,加入RA(0.01mM)在定義培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-5天。然后轉(zhuǎn)移這些神經(jīng)外胚層分化的人類胚胎干細(xì)胞至無血清無bFGF的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)4-5天,以允許人神經(jīng)前體細(xì)胞形成。為進一步分化成神經(jīng)元表型細(xì)胞,所述的人神經(jīng)前體細(xì)胞然后允許附著到組織培養(yǎng)板/底物中含有DMEM/F-12,N-2補充劑(1%),肝素(8微克/毫升),VEGF(20納克/毫升),NT-3(10納克/毫升),和BDNF(10納克/毫升)的一個定義培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)約2周,以產(chǎn)生表達(dá)微管蛋白和MAP-2,廣泛突起軸承的典型在腹腦的神經(jīng)元細(xì)胞和色素細(xì)胞,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間增加(圖1,3,5)。按照上述方法進行神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化,驗證不同的定義培養(yǎng)基組分對細(xì)胞分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中包含如下組分時神經(jīng)細(xì)胞分化較好:20-100ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、0.01-0.03mg/ml胰島素(insulin)、0.04-0.06mg/ml抗壞血酸(ascorbicacid)、20-100ng/ml激活素(activin-A)、和0.01–1mg/ml層粘連蛋白(laminin)。實驗發(fā)現(xiàn),包含20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、0.02mg/ml胰島素(insulin)、0.05mg/ml抗壞血酸(ascorbicacid)、20ng/ml激活素(activin-A)、和0.04mg/ml層粘連蛋白(laminin)的定義培養(yǎng)基中,神經(jīng)細(xì)胞的分化效果最好,分化比率能夠達(dá)到約99.5%。另外,申請人發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中層粘連蛋白的含量對神經(jīng)細(xì)胞的分化影響顯著,在較低(<0.01mg/ml)和較高(>0.1mg/ml)的情況下,神經(jīng)細(xì)胞的分化效果顯著降低。定義培養(yǎng)基中,層粘連蛋白的含量在0.03-0.04mg/ml的情況下,神經(jīng)細(xì)胞分化效率最高,能夠達(dá)到98%以上。實施例3本實施例提供了一種方法通過使用煙酰胺(nicotinamide[NAM])誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造(cGMP)的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向高效分化出心臟中胚層通過促進早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子CSX/Nkx2.5的表達(dá),及觸發(fā)心臟譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人心臟前體細(xì)胞和跳動的人心肌細(xì)胞(>90%)(圖2,4,6)。使用小分子誘導(dǎo)多能人類胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞系特異性分化。接種并維持未分化的高質(zhì)量臨床級無異物的多能人類胚胎干細(xì)胞在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中3天后,加入NAM(10mM)在定義培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-5天。然后轉(zhuǎn)移這些心臟中胚層分化的人類胚胎干細(xì)胞至無血清無bFGF的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)4-5天,以允許人心臟前體細(xì)胞形成。允許附著到組織培養(yǎng)板/底物后,將人心臟前體細(xì)胞進一步用NAM(10mM)誘導(dǎo)約一個星期,并培養(yǎng)在心肌分化培養(yǎng)基中含有DMEM/F-12(90%),定義的FBS(Hyclone公司)(10%)和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2mM)。停用NAM約一周后可觀察到跳動的心肌細(xì)胞,心肌細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間增加,可用于電生理記錄檢測(圖2,4,6)。按照上述方法進行心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化,驗證不同的定義培養(yǎng)基組分對細(xì)胞分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中包含如下組分時心臟細(xì)胞分化較好:20-100ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、0.01-0.03mg/ml胰島素(insulin)、0.04-0.06mg/ml抗壞血酸(ascorbicacid)、20-100ng/ml激活素(activin-A)、和0.01–1mg/ml層粘連蛋白(laminin)。實驗發(fā)現(xiàn),包含20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、0.02mg/ml胰島素(insulin)、0.05mg/ml抗壞血酸(ascorbicacid)、20ng/ml激活素(activin-A)、和0.05mg/ml層粘連蛋白(laminin)的定義培養(yǎng)基中,心肌細(xì)胞的分化效果最好,分化比率能夠達(dá)到約99.2%。另外,申請人發(fā)現(xiàn),定義培養(yǎng)基中層粘連蛋白的含量對心肌細(xì)胞的分化影響顯著,在較低(<0.02mg/ml)和較高(>0.2mg/ml)的情況下,心肌細(xì)胞的分化效果顯著降低。定義培養(yǎng)基中,層粘連蛋白的含量在0.05-0.06mg/ml的情況下,心肌細(xì)胞分化效率最高,能夠達(dá)到98%以上。結(jié)論本發(fā)明提供了技術(shù)直接從多能人類干細(xì)胞用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范大規(guī)模高效高純度生產(chǎn)高質(zhì)量臨床級無異物的特定譜系的人體細(xì)胞。本發(fā)明聲稱提供了一種方法通過通過促進神經(jīng)或心肌分化用小分子定向分化誘導(dǎo)多能人類干細(xì)胞成為用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的人神經(jīng)元或心肌譜系細(xì)胞。本發(fā)明一個明確要求的主題是提供了一種方法通過使用視黃酸誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向分化出神經(jīng)外胚層并觸發(fā)神經(jīng)元譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人神經(jīng)前體細(xì)胞和人神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明另一個明確要求的主題是提供了一種方法通過使用煙酰胺誘導(dǎo)直接從用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造的高質(zhì)量臨床級無異物的維持在一個定義培養(yǎng)系統(tǒng)中的人類胚胎干細(xì)胞中定向分化出心臟中胚層并觸發(fā)心肌譜系特定性的高效高純度大規(guī)模的發(fā)展為人心臟前體細(xì)胞和跳動的人心肌細(xì)胞。本發(fā)明為用于細(xì)胞治療法和商業(yè)化提供了大規(guī)模生產(chǎn)或制造優(yōu)質(zhì)性臨床級無異物的多能人類干細(xì)胞及其功能性人體細(xì)胞療法衍生物的途徑。具體來說,本發(fā)明的醫(yī)療創(chuàng)新提供了高純度功能性人體神經(jīng)細(xì)胞和心臟肌肉細(xì)胞的新穎的商業(yè)來源為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或心肌修復(fù)。本發(fā)明提供了技術(shù),方法和產(chǎn)品通過小分子定向分化誘導(dǎo)為良好控制高效率直接轉(zhuǎn)化多能人類干細(xì)胞成大量優(yōu)質(zhì)的人體干細(xì)胞或前體細(xì)胞或源祖細(xì)胞和臨床上的特定譜系功能性人體細(xì)胞可用于組織和器官工程和再生,細(xì)胞治療法,藥物研發(fā)和測試,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,干細(xì)胞庫,和臨床應(yīng)用。工業(yè)實用性本發(fā)明提供了與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟相關(guān)細(xì)胞用于移植,研究,藥物開發(fā),藥物研發(fā)和測試,組織和器官工程,組織和器官再生,用當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范進行大規(guī)模制造,細(xì)胞治療法,干細(xì)胞庫銀,臨床應(yīng)用和其他用途。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。參考文獻1.ParsonsXH,TengYD,MooreDA,SnyderEY.(2011)Patentsontechnologiesofhumantissueandorganregenerationfrompluripotenthumanembryonicstemcells(hESCs).RecentPatentsonRegenerativeMedicine1:142-163.PMID:2335596.PMCID:3554241.2.ParsonsXH.(2013)Embeddingthefutureofregenerativemedicineintotheopenepigenomiclandscapeofpluripotenthumanembryonicstemcells.Ann.Rev.Res.Biol.3(4):323-349.PMID:25309947.PMCID:4190676.3.ParsonsXH.(2013)Constrainingthepluripotentfateofhumanembryonicstemcellsfortissueengineeringandcelltherapy–theturningpointofcell-basedregenerativemedicine.BritishBiotech.J.3(4):424-457.PMID:24926434.PMCID:4051304.4.RedmondDEJr,etal.(2007)BehavioralimprovementinaprimateParkinson'smodelisassociatedwithmultiplehomeostaticeffectsofhumanneuralstemcells.ProcNatlAcadSciUSA104:12175-12180.PMID:17586681.PMCID:1896134.5.ParsonsXH,TengYD,ParsonsJF,SnyderEY,SmotrichDB,MooreDA.(2011)Efficientderivationofhumancardiacprecursorsandcardiomyocytesfrompluripotenthumanembryonicstemcellswithsmallmoleculeinduction.JoVE57:e3274.DOI:10.3791/3274.PMID:22083019.PMCID:3308594.6.ParsonsJF,SmotrichDB,GonzalezR,SnyderEY,MooreDA,ParsonsXH.(2012)Definingconditionsforsustainingepiblastpluripotenceenablesdirectinductionofclinically-suitablehumanmyocardialgraftsfrombiologics-freehumanembryonicstemcells.J.Clinic.Exp.CardiologyS9:001.DOI:10.4172/2155-9880.S9-001.PMID:22905333.PMCID:3419496.7.ParsonsXH.(2012)Thedynamicsofglobalchromatinremodelingarepivotalfortrackingthenormalpluripotencyofhumanembryonicstemcells.Anatom.Physiol.S3:002.DOI:10.4172/2161-0940.S3-002.PMID:23543848.PMCID:3609651.8.ParsonsXH,TengYD,ParsonsJF,SnyderEY,SmotrichDB,MooreDA.(2011)Efficientderivationofhumanneuronalprogenitorsandneuronsfrompluripotenthumanembryonicstemcellswithsmallmoleculeinduction.JoVE56:e3273.DOI:10.3791/3273.PMID:22064669.PMCID:3227216.9.ParsonsXH.(2012)MicroRNAprofilingrevealsdistinctmechanismsgoverningcardiacandneurallineage-specificationofpluripotenthumanembryonicstemcells.J.StemCellRes.Ther.2:124.DOI:10.4172/2157-7633.1000124.PMID:23355957.PMCID:3554249.10.ParsonsXH.(2012)Anengraftablehumanembryonicstemcellneuronallineage-specificderivativeretainsembryonicchromatinplasticityforscale-upCNSregeneration.J.Reg.Med.&TissueEng.1:3.DOI:10.7243/2050-1218-1-3.PMID:23542901.PMCID:3609668.11.ParsonsXH,ParsonsJF,MooreDA.(2013)Genome-scalemappingofmicroRNAsignaturesinhumanembryonicstemcellneurogenesis.Mol.Med.Ther.1:2.DOI:10.4172/2324-8769.1000105.PMID:23543894.PMCID:3609664.12.ParsonsXH.(2013)Humanstemcellderivativesretainmoreopenepigenomiclandscapewhenderivedfrompluripotentcellsthanfromtissues.J.Regen.Med.1:2.DOI:10.4172/2325-9620.1000103.PMID:23936871.PMCID:3736349.13.ParsonsXH.(2014)Directconversionofpluripotenthumanembryonicstemcells(humanEScells)underdefinedcultureconditionsintohumanneuronalorcardiomyocytescelltherapyderivatives.MethodsMol.Biol.2014,Feb.6.ChapterinHumanEmbryonicStemCells:MethodsandProtocols,2ndEdition.Springer’sProtocols.DOI:10.1007/7651_2014_69.PMID:24500898。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3