本發(fā)明涉及對(duì)氧磷酶1的融合蛋白，特別涉及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與對(duì)氧磷酶1的融合蛋白以及所述蛋白的制備和應(yīng)用。

技術(shù)背景

人血清對(duì)氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是由肝臟合成分泌的分子量為45kDa的糖蛋白，含355個(gè)氨基酸，主要存在于血液、腎臟、脾臟、腦等組織器官中。PON1是一類(lèi)鈣離子依賴(lài)性高密度脂蛋白相關(guān)脂酶，可以水解磷酸酯鍵，對(duì)有機(jī)磷化合物具有較強(qiáng)的解毒作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、抗炎中發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、2型糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

PON1是體內(nèi)的微量蛋白，從血清中提取該蛋白還存在許多問(wèn)題。為了研究PON1水解有機(jī)磷毒劑和在其他疾病中的作用，利用生物工程方法表達(dá)PON1非常必要。PON1是糖蛋白，原核表達(dá)不能糖基化修飾，影響蛋白活性。真核系統(tǒng)表達(dá)蛋白能夠糖基化修飾，所以利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和家蠶(是真核生物)，表達(dá)蛋白可糖基化修飾，利于活性發(fā)揮。家蠶遺傳背景清晰，蛋白表達(dá)量高，且可食用，有些藥用蛋白可不必純化就能通過(guò)口服吸收。但有些蛋白被消化道蛋白酶降解，降低了其療效，因此開(kāi)發(fā)用于粘膜吸收的此類(lèi)蛋白類(lèi)藥物非常必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了提供可粘膜吸收的PON1蛋白，本發(fā)明提供一種含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的對(duì)氧磷酶1融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明的融合蛋白可用于制備口含片、鼻噴劑、直腸給入等劑型以用于治療腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病以及用于在體內(nèi)或體外降解有機(jī)磷。

研究發(fā)現(xiàn)，在一些蛋白質(zhì)上具有被稱(chēng)為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū) (protein transduction domain,PTD)的小片段，又稱(chēng)為細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)能夠有效地通過(guò)生物膜，進(jìn)入各種類(lèi)型的細(xì)胞。外源蛋白質(zhì)、DNA或復(fù)合物與PTD連接后，能夠進(jìn)入細(xì)胞和通過(guò)血腦屏障。因此，PTD在運(yùn)送蛋白質(zhì)、DNA或復(fù)合物，并進(jìn)而在治療病毒感染，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞及神經(jīng)退行性疾病等方面有巨大的潛力。

人類(lèi)免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)反義激活轉(zhuǎn)錄(trans-activator transcription，TAT)蛋白PTD(TAT-PTD)是目前PTD的一種來(lái)源。TAT中的11個(gè)氨基酸(第47-57位氨基酸，P11)是具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的肽段，其序列為YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)。TAT-PTD可以將與之相連的多肽和全長(zhǎng)蛋白在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而且可以通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸至腦組織，從而可跨越血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明人通過(guò)將PON1與P11融合獲得了可粘膜吸收的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的融合蛋白可通過(guò)粘膜吸收，無(wú)創(chuàng)性地穿透粘膜進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而可用于治療腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病以及用于在體內(nèi)或體外降解有機(jī)磷。

具體而言，本發(fā)明提供了如下的各個(gè)方面。

本發(fā)明一方面提供了P11與PON1的融合蛋白。

任選地，PON1可為全長(zhǎng)蛋白或?yàn)槠浣囟痰幕钚孕问健?/p>

更具體而言，本發(fā)明的融合蛋白可具有如下的序列：

YGRKKRRQRRRMAKLIALTLLGMGLALFRNHQSSYQTRLNALREVQPVELPNCNLVKGIETGSEDL/MEILPNGLAFISSGLKYPGIKSFNPNSPGKILLMDLNEEDPTVLELGITGSKFDVSSFNPHGISTFTDEDNAMYLLVVNHPDAKSTVELFKFQEEEKSLLHLKTIRHKLLPNLNDIVAVGPEHFYGTNDHYFLDPYLQ/RSWEMYLGLAWSYVVYYSPSEVRVVAEGFDFANGINISPDGKYVYIAELLAHKIHVYEKHANWTLTPLKSLDFNTLVDNISVDPETGDLWVGCHPNGMKIFFYDSENPPASEVLRIQNILTEEPKVTQVYAENGTVLQGSTVASVYKGKLLIGTVFHKALYCEL(SEQ ID NO：2)。

所以，本發(fā)明一方面提供了一種融合蛋白，其包含選自如 下的序列：

a)SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列；或

b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白為：

a)SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列；和

b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。

本發(fā)明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或幾個(gè)的氨基酸，是指在序列中的任意且1個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列中的位置上取代、缺失、插入或添加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基(例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或9個(gè))，并且取代、缺失、插入和添加中的2種或兩種以上可同時(shí)發(fā)生。

本發(fā)明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或幾個(gè)的氨基酸可通過(guò)使用《Molecular Cloning 3》(分子克隆3)和《Current Protocols in Molecular Biology》(現(xiàn)代分子生物學(xué)操作規(guī)程)等記載的定點(diǎn)誘變法獲得。

對(duì)于本發(fā)明所述的取代，優(yōu)選在下列各組之內(nèi)進(jìn)行氨基酸殘基的相互取代：

1：亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、甘氨酸；

2：天冬氨酸、谷氨酸；

3：天冬酰胺、谷氨酰胺；

4：賴(lài)氨酸、精氨酸；

5：脯氨酸、羥基脯氨酸；

6：絲氨酸、蘇氨酸；和

7：苯丙氨酸、酪氨酸。

對(duì)于本文中所述的保守取代、缺失、插入或添加前活性， 可表示在取代、缺失、插入或添加后的蛋白質(zhì)或氨基酸序列的活性是取代、缺失、插入或添加前的10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％或更高。

上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸殘基的個(gè)數(shù)，一般優(yōu)選小的數(shù)目。并且此類(lèi)蛋白質(zhì)還可以為：蛋白質(zhì)，其具有與序列號(hào)5的氨基酸序列有約60％或以上、約70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有SEQ ID NO：2所具有的無(wú)創(chuàng)性高穿透性PON1活性。上述同源性的數(shù)值一般優(yōu)選大的數(shù)值。

本發(fā)明的融合蛋白除通過(guò)基因工程方法(如下述實(shí)施例所述)來(lái)獲得之外，也可以通過(guò)Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法制造，或通過(guò)肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。

本發(fā)明的另一方面還提供了編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列。

更具體而言，編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列如下：

本發(fā)明的編碼核苷酸可具有如下的序列：TATGGTCGTAAAAAACGTCGCCAGCGTCGCCGTAtggcgaagctgattgcgctcaccctcttggggatgggactggcactcttcaggaaccaccagtcttcttaccaaacacgacttaatgctctccgagaggtacaacccgtagaacttcctaactgtaatttagttaaaggaatcgaaactggctctgaagacttg/atggagatact gcctaatggactggctttcattagctctggattaaagtatcctggaataaagagcttcaaccccaacagtcctggaaaaatacttctgatggacctgaatgaagaagatccaacagtgttggaattggggatcactggaagtaaatttgatgtatcttcatttaaccctcatgggattagcacattcacagatgaagataatgccatgtacctcctggtggtgaaccatccagatgccaagtccacagtggagttgtttaaatttcaagaagaagaaaaatcgcttttgcatctaaaaaccatcagacataaacttctgcctaatttgaatgatattgttgctgtgggacctgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacaa/cgatcctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtggcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggcaagtatgtctatatagctgagttgctggctcataagattcatgtgtatgaaaagcatgctaattggactttaactccattgaagtcccttgactttaataccctcgtggataacatatctgtggatcctgagacaggagacctttgggttggatgccatcccaatggcatgaaaatcttcttctatgactcagagaatcctcctgcatcagaggtgcttcgaatccagaacattctaacagaagaacctaaagtgacacaggtttatgcagaaaatggcacagtgttgcaaggcagtacagttgcctctgtgtacaaagggaaactgctgattggcacagtgtttcacaaagctctttactgtgagctctaa(SEQ ID NO：3)。

所以，編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列包含：

a)SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列；

b)在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3的核苷酸序列進(jìn)行雜交、且編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸；或

c)上述a)或b)的互補(bǔ)序列。

進(jìn)一步優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列為：

a)SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列；

b)在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO.3的核苷酸序列進(jìn)行雜交、且編碼具有本發(fā)明融合蛋白活性的氨基酸序列的多核苷酸；

c)上述a)或b)的互補(bǔ)序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸序列可包含酶切位點(diǎn)，例如NCOI/XhoI，示例性地，NCOI+P11+PON1+XhoI序列如下：

CCATGGGCTATGGTCGTAAAAAACGTCGCCAGCGTCGCCGTAtggcgaagctgattgcgctcaccctctt ggggatgggactggcactcttcaggaaccaccagtcttcttaccaaacacgacttaatgctctccgagaggtacaacccgtagaacttcctaactgtaatttagttaaaggaatcgaaactggctctgaagacttg/atggagatactgcctaatggactggctttcattagctctggattaaagtatcctggaataaagagcttcaaccccaacagtcctggaaaaatacttctgatggacctgaatgaagaagatccaacagtgttggaattggggatcactggaagtaaatttgatgtatcttcatttaaccctcatgggattagcacattcacagatgaagataatgccatgtacctcctggtggtgaaccatccagatgccaagtccacagtggagttgtttaaatttcaagaagaagaaaaatcgcttttgcatctaaaaaccatcagacataaacttctgcctaatttgaatgatattgttgctgtgggacctgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacaa/cgatcctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtggcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggcaagtatgtctatatagctgagttgctggctcataagattcatgtgtatgaaaagcatgctaattggactttaactccattgaagtcccttgactttaataccctcgtggataacatatctgtggatcctgagacaggagacctttgggttggatgccatcccaatggcatgaaaatcttcttctatgactcagagaatcctcctgcatcagaggtgcttcgaatccagaacattctaacagaagaacctaaagtgacacaggtttatgcagaaaatggcacagtgttgcaaggcagtacagttgcctctgtgtacaaagggaaactgctgattggcacagtgtttcacaaagctctttactgtgagctctaaCTCGAG(SEQ ID NO：4)。

本文所述的“嚴(yán)緊條件”，可以為低嚴(yán)緊條件、中嚴(yán)緊條件、高嚴(yán)緊條件中的任一種，優(yōu)選為高嚴(yán)緊條件。示例性地，“低嚴(yán)緊條件”可為30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的條件；“中嚴(yán)緊條件”可為40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的條件；“高嚴(yán)緊條件”可為50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解溫度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇影響雜交的嚴(yán)緊度的溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多個(gè)因素形成的綜合結(jié)果來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的的嚴(yán)緊度。

除此之外可雜交的多核苷酸還可以為，通過(guò)FASTA、BLAST等同源性檢索軟件用系統(tǒng)設(shè)定的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，與編碼序列號(hào)6的多核苷酸具有約60％或以上、約70％或以上、71％ 或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法規(guī)則BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)來(lái)確定。基于BLAST算法規(guī)則的程序BLASTN、BLASTX已被開(kāi)發(fā)(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析堿基序列時(shí)，如使參數(shù)為score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，如使參數(shù)為score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，采用各程序的系統(tǒng)可設(shè)定默認(rèn)參數(shù)值。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核苷酸序列的載體，例如質(zhì)粒載體。另外，本發(fā)明還提供了導(dǎo)入本發(fā)明所述的核苷酸的微生物，例如病毒。

本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述的融合蛋白的方法，其包括使本發(fā)明的核苷酸序列在家蠶中表達(dá)。

本發(fā)明的再一方面提供了一種藥物組合物或藥物制劑，其包含本發(fā)明的融合蛋白或其核苷酸序列。對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物或藥物制劑，其可用于治療腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病以及用于在體內(nèi)或體外降解有機(jī)磷。

本發(fā)明的又一方面提供了本發(fā)明的融合蛋白及其核苷酸序列在制備用于治療腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、2型糖尿病等 疾病的藥物中或用于在體內(nèi)或體外降解有機(jī)磷的藥物中的用途。

對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物，其可通過(guò)口含片、鼻噴劑、直腸給藥等劑型進(jìn)行施用。

附圖說(shuō)明

圖1:家蠶表達(dá)載體構(gòu)建及感染流程。

圖2:P11-PON1融合蛋白的SDS-PAGE圖，其中：

M:蛋白Marker；1,2:兩批表達(dá)的蛋白樣品。

圖3:P11-PON1融合蛋白的Westblott ing鑒定，其中：

1,2:兩批表達(dá)的蛋白樣品。

圖4：P11-PON1融合蛋白對(duì)小鼠的生物活性。

圖5：P11-PON1融合蛋白對(duì)斑馬魚(yú)的生物活性。

下面將通過(guò)借助以下實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1. 家蠶表達(dá)載體構(gòu)建及家蠶表達(dá)

人工合成P11-PON1融合基因NCOI+PTD+PON1+XhoI序列如下：

CCATGGGCTATGGTCGTAAAAAACGTCGCCAGCGTCGCCGTAtggcgaagctgattgcgctcaccctcttggggatgggactggcactcttcaggaaccaccagtcttcttaccaaacacgacttaatgctctccgagaggtacaacccgtagaacttcctaactgtaatttagttaaaggaatcgaaactggctctgaagacttggagatactgcctaatggactggctttcattagctctggattaaagtatcctggaataaagagcttcaaccccaacagtcctggaaaaatacttctgatggacctgaatgaagaagatccaacagtgttggaattggggatcactggaagtaaatttgatgtatcttcatttaaccctcatgggattagcacattcacagatgaagataatgccatgtacctcctggtggtgaaccatccagatgccaagtccacagtggagttgtttaaatttcaagaagaagaaaaatcgcttttgcatctaaaaaccatcagacataaacttctgcctaatttgaatgatattgttgctgtgggacctgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacaatcctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtggcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggcaagtatgtctatatagctgagttgctggctcataagattcatgtgtatgaaaagcatgctaattggactttaactccattgaagtcccttgactttaataccctcgtggataacatatctgtggatcctgagacaggagacctttgggttggatgccatcccaatggcatgaaaatcttcttctatgactcagagaatcctcctgcatcagaggtgcttcgaatccagaacattctaacagaagaacctaaagtgacacaggtttatgcagaaaatggcacagtgttgcaaggcagtacagttgcctctgtgtacaaagggaaactgctgattggcacagtgtttcacaaagctctttactgtgagctctaaCTCGAG(SEQ ID NO：5)。

上述核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如下：

YGRKKRRQRRRMAKLIALTLLGMGLALFRNHQSSYQTRLNALREVQPVELPNCNLVKGIETGSEDLEILPNGLAFISSGLKYPGIKSFNPNSPGKILLMDLNEEDPTVLELGITGSKFDVSSFNPHGISTFTDEDNAMYLLVVNHPDAKSTVELFKFQEEEKSLLHLKTIRHKLLPNLNDIVAVGPEHFYGTNDHYFLDPYLQSWEMYLGLAWSYVVYYSPSEVRVVAEGFDFANGINISPDGKYVYIAELLAHKIHVYEKHANWTLTPLKSLDFNTLVDNISVDPETGDLWVGCHPNGMKIFFYDSENPPASEVLRIQNILTEEPKVTQVYAENGTVLQGSTVASVYKGKLLIGTVFHKALYCEL(SEQ ID NO：6)。

基于合成的核苷酸序列的兩端加入了NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)，利用NcoI和XhoI分別雙酶切上述P11-PON1融合基因和pFastBac HTb載體(Invtrogen)，回收P11-PON1和載體片段，T4DNA連接酶連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5_ɑ感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，獲得重組載體pFas tBac5B-P11-PON1。然后用此載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10BmBac感受態(tài)細(xì)胞(Invtrogen)，在LB液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)4h,然后取部分稀釋菌液涂板，在含有四環(huán)素和卡那霉素霉素和X-gal的LB上生長(zhǎng)48h。根據(jù)菌落的顏色進(jìn)行篩選，挑取白斑進(jìn)行單菌斑培養(yǎng)，抽提得到重組BmBacmid基因。隨后轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞并通過(guò)常規(guī)方法獲得重組病毒。然后用此重組病毒感染家蠶5齡幼蟲(chóng)，感染96小時(shí)后即有P11-PON1融合蛋白表達(dá)，收集蟲(chóng)體凍干粉碎，-80℃保存?zhèn)溆?見(jiàn)圖1)。

實(shí)施例2 P11-PON1融合蛋白的鑒定

取1克蟲(chóng)體干粉，溶于20mlPBS溶液中，4℃超聲破碎20min，12000r/min下離心10min，收集上清，利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定家蠶蛋白總量；取10μl上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，配置兩塊12％SDS-PAGE凝膠，電泳結(jié)束后，一塊置于考馬斯亮藍(lán)染色1h，冰醋酸脫色過(guò)夜，利用Gel-pro凝膠成像系統(tǒng)拍照并掃描計(jì)算P11-PON1融合蛋白占總蛋白比率，最終計(jì)算P11-PON1融合蛋白的凈含量；另一塊膠用于Western印跡鑒定，轉(zhuǎn)膜后37℃，5％脫脂牛奶封閉2h，一抗(兔抗人PON1多克隆抗體1:1000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗(1:2000稀釋)37℃孵育2h，利用增強(qiáng)型HRP-DAB 底物顯色試劑盒直接在PVDF膜上進(jìn)行顯色，顯色后利用Gel-pro凝膠成像系統(tǒng)拍照。P11-PON1融合蛋白家蠶表達(dá)分子量45kDa左右(圖2)，占家蠶總蛋白的5-10％，Western印跡鑒定完全正確(圖3)。

實(shí)施例3 P11-PON1融合蛋白的生物活性

3.1 P11-PON1融合蛋白對(duì)小鼠的生物活性

昆明小鼠雌雄各半，體重25±3克，實(shí)驗(yàn)前禁食12小時(shí)，使胃和腸道盡量排空，自由飲水。實(shí)驗(yàn)組分為灌胃組和直腸給藥組，對(duì)照組腹腔注射敵敵畏20mg/kg體重。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組6只，雌雄各半。灌胃組每只小鼠直接通過(guò)灌胃針給予表達(dá)上清液(P11-PON1融合蛋白和PON1蛋白(PON1蛋白凈含量1mg)；直腸給藥組，先用灌胃針刺激小鼠肛門(mén)，使其盡量排空直腸內(nèi)糞便，再用灌胃針探入1.5cm左右，緩慢注入，停止1min左右緩慢撤針以防止藥液流出。給藥1-5小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組按20mg/kg體重腹腔注射敵敵畏溶液，觀察小鼠狀態(tài)，記錄存活率。灌胃給藥沒(méi)有提高小鼠存活率；而直腸給藥1-5小時(shí)后再腹腔注射敵敵畏，P11-PON1融合蛋白組小鼠存活率極顯著提高(P<0.01)；表明P11-PON1融合蛋白可被胃腸道酶類(lèi)降解，而失去活性，但能通過(guò)粘膜進(jìn)入體內(nèi)，并對(duì)有機(jī)磷毒劑有抵抗作用；而不含P11的PON1蛋白不能通過(guò)粘膜進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)有機(jī)磷毒劑沒(méi)有抵抗作用(見(jiàn)圖4)。

3.2 P11-PON1融合蛋白對(duì)斑馬魚(yú)的生物活性

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組，P11-PON1融合蛋白和PON1蛋白(以PON1蛋白的凈含量)終濃度分別為1、2.5、5、10、20mg/L，將狀態(tài)正常成年斑馬魚(yú)放入，每組8條，雄雌各半，1-5小時(shí)后加入敵敵畏溶液終濃度為50mg/L，充分混勻；對(duì)照組，將狀態(tài)正常成年斑馬魚(yú)放入1L養(yǎng)殖水中，每組8條，雄雌各半，與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入敵敵畏溶液終濃度為50mg/L，充分混勻；實(shí)驗(yàn)期間及時(shí)撈出死魚(yú)，觀察24小時(shí)，記錄實(shí)驗(yàn)魚(yú)的中毒癥狀、死亡數(shù)量，評(píng)價(jià)魚(yú)是否死亡以鰓是否活動(dòng)和對(duì)輕微刺激有無(wú)反應(yīng)作為依 據(jù)，若實(shí)驗(yàn)中魚(yú)的鰓停止運(yùn)動(dòng)，用玻璃棒輕觸尾部，無(wú)反應(yīng)則認(rèn)為死亡。計(jì)算各組存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P11-PON1融合蛋白各組，20mg/L組24h存活率62.5％、10mg/L組存活率62.5％、5mg/L組存活率50％，與對(duì)照組相比，存活率極顯著提高(P<0.01)；2.5mg/L組存活率41.7％與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；1mg/L組存活率16.7％，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明P11-PON1融合蛋白能通過(guò)腮和皮膚粘膜吸收進(jìn)入體內(nèi)，并對(duì)有機(jī)磷毒劑有抵抗作用；而PON1蛋白組各組存活率均沒(méi)有顯著提高，對(duì)有機(jī)磷毒劑沒(méi)有抵抗作用(見(jiàn)圖5)。

雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動(dòng)，且這些修飾和變動(dòng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。