本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆水稻FLN2基因，以及利用轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因研究對水稻葉綠體發(fā)育的影響，可用以解決雜交稻育種過程中雜種的剔除，提高種子的純度。
背景技術(shù)：
：光合作用為水稻的生長提供了物質(zhì)來源和能量來源，葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要場所，同時也是光合色素的載體，廣泛分布在葉片綠色組織細(xì)胞中。高等植物葉綠體的發(fā)育需經(jīng)過一系列復(fù)雜的變化過程，需要細(xì)胞核基因編碼的蛋白和葉綠體編碼的蛋白協(xié)調(diào)參與完成。在黑暗條件中，葉片中非光合作用的前質(zhì)體發(fā)育成黃化質(zhì)，黃化質(zhì)體中含有晶格狀的原片層，經(jīng)光照黃化質(zhì)體不斷分化發(fā)育形成葉綠體。目前發(fā)現(xiàn)的水稻白化突變體通常與葉綠體的發(fā)育缺陷相關(guān)，進(jìn)而影響水稻光合作用，造成水稻減產(chǎn)甚至死亡。水稻葉色白化的根本原因是細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中遺傳基因突變，目前已分離出多個與水稻白化相關(guān)的基因，目前發(fā)現(xiàn)最多的是三角狀五肽重復(fù)蛋白PPR家族基因，該類基因編碼的蛋白質(zhì)大多數(shù)被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體和線粒體中參與調(diào)控葉綠體和線粒體中RNA剪接、RNA編輯、翻譯以及RNA穩(wěn)定性的保持，還包括參與葉綠體RNA代謝調(diào)控過程的NUS1蛋白以及定位在胞質(zhì)中鳥甘酸激酶GK。而含有ATP錐體結(jié)構(gòu)域和RNR1結(jié)構(gòu)域的核糖核酸還原酶和類Mi-2蛋白染色質(zhì)重構(gòu)因子也已經(jīng)確定與水稻質(zhì)體發(fā)育有關(guān)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻葉色變異相關(guān)的蛋白質(zhì)及其基因，以及由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，和利用所述基因?qū)λ救~片顏色進(jìn)行改造的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻質(zhì)體發(fā)育調(diào)控基因FLN2編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為SEQIDNo：3所示的氨基酸序列(蛋白全長)。作為本發(fā)明的水稻質(zhì)體發(fā)育調(diào)控基因FLN2編碼的蛋白質(zhì)的改進(jìn)：所述氨基酸序列還包括在SEQIDNo：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。本發(fā)明還同時提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因FLN2，該基因FLN2為SEQIDNo：1和2所示的核苷酸序列。即，該基因FLN2具有如SEQIDNo：1所示的cDNA全長序列和SEQIDNo：2所示的gDNA。作為本發(fā)明的基因FLN2的改進(jìn)：所述核苷酸序列還包括在SEQID.No：1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的質(zhì)粒。本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的植物表達(dá)載體。本發(fā)明還同時提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述基因序列。作為本發(fā)明的宿主細(xì)胞的改進(jìn)：該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。本發(fā)明還同時提供了上述基因的用途：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因水稻的葉片顏色得到改良(影響水稻葉色，包括使轉(zhuǎn)基因植株葉色恢復(fù)為正常綠色等)，從而適應(yīng)生產(chǎn)者的多種需求。本發(fā)明能利用該基因研究對水稻葉綠體發(fā)育的影響，可用以解決雜交稻育種過程中雜種的剔除，提高種子的純度。即，由于該基因的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，人們可以根據(jù)自己的需要對葉片顏色進(jìn)行定向改變，從而達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)方面的要求。本發(fā)明還同時提供了一種改良水稻葉片顏色，提高光合效率的方法：包括用具有SEQIDNo：1和2所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。進(jìn)一步作如下具體說明：本發(fā)明的目的是提供一種從水稻白化突變體中克隆的新基因FLN2，具有如SEQIDNo：1所示的cDNA序列和SEQIDNo：2所示的gDNA，也包括與SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQIDNo：3所示的蛋白質(zhì)屬于磷酸果糖激酶類似蛋白，其中進(jìn)行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQIDNo：1和SEQIDNo：2中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用FLN2基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300-FLN2,該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻葉色的方法。具體地是利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響水稻葉色的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：一、水稻葉色白化突變體st10的分離和遺傳分析：本發(fā)明的水稻葉片白化突變體st10來自日本晴(NIP)EMS(EthylMethylSulfonate)誘變產(chǎn)生的突變。該突變體從開始萌發(fā)即表現(xiàn)為完全的白化表型(圖1A)；3葉期后，新抽的葉片開始部分轉(zhuǎn)綠，分蘗期呈現(xiàn)部分葉片白化的表型(圖1B)；抽穗期后90％的葉片均恢復(fù)綠色，但穗部為白色(圖1C)。st10通過與野生型水稻的正交實(shí)驗，證明該突變體受隱性單基因控制。二、圖位克隆控制水稻白化性狀的FLN2基因：1)、FLN2基因的初步定位：為了分離FLN2基因，本發(fā)明首先組建了一個定位群體，由st10與秈稻品種培矮64s(Indica)雜交，配成F2定位群體(雜交所得的F1代自交，得F2)，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標(biāo)記對FLN2位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第3染色體的短臂上，并介于STR20和STR15兩STS標(biāo)記之間，見圖2。2)、FLN2基因的精細(xì)定位與基因預(yù)測：通過對STR20和STR15兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標(biāo)記將FLN2精細(xì)定位于BAC克隆OJ1519_A12上STR11與STR12標(biāo)記之間48-kb范圍之內(nèi)(圖3B,C)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因。3)、FLN2基因的鑒定和功能分析：為了確定突變基因，我們對48-kb定位區(qū)間進(jìn)行測序，結(jié)果表明可能的fructokinase-likeprotein2(FLN2)編碼基因第5外顯子發(fā)生堿基替換，導(dǎo)致FLN2蛋白的第536個氨基酸由色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，造成蛋白編碼提早終止(圖3D,E,F)，由此我們推斷白化突變體st10的突變表型可能是由于FLN2基因突變造成的。我們構(gòu)建了如圖4所示的互補(bǔ)載體，用于驗證候選基因功能，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入到突變體st10中，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5)，證明本發(fā)明正確克隆了FLN2基因，氨基酸序列分析表明FLN2編碼pfkB家族中的果糖激酶類似蛋白。此外，由于該基因編碼蛋白對葉綠體的發(fā)育有影響，我們還構(gòu)建了如圖6所示亞細(xì)胞定位載體，通過水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)證明FLN2蛋白在細(xì)胞中定位于葉綠體。本發(fā)明利用水稻白化突變體st10，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了FLN2基因，該基因編碼pfkB家族中的果糖激酶類似蛋白，在水稻中影響前質(zhì)體及葉綠體的發(fā)育，但作為糖酵解重要限速酶——果糖激酶的類似蛋白，其在植物葉綠體發(fā)育過程中究竟如何發(fā)揮作用，F(xiàn)LN2突變后對環(huán)境的響應(yīng)機(jī)理如何，還需更多的研究工作去闡明，通過對FLN2基因的功能 解讀，豐富了葉綠體發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，同時為研究水稻前質(zhì)體、葉綠體的發(fā)育及二者的轉(zhuǎn)化機(jī)理打下基礎(chǔ)。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要場所，廣泛分布在葉片綠色組織細(xì)胞中。白化突變典型特征是葉綠體發(fā)育異常，大部分白化突變體缺乏葉綠素，不能正常進(jìn)行光合作用，幼苗依靠種子中的胚乳營養(yǎng)生長，當(dāng)營養(yǎng)耗盡植株就會死亡，植物葉色白化突變產(chǎn)生機(jī)制非常復(fù)雜，涉及激素調(diào)控、核-質(zhì)基因組互作、質(zhì)體基因及基因與環(huán)境的互作等過程，目前對白化的分子機(jī)理研究還僅停留在葉綠素代謝的層面，更為復(fù)雜的調(diào)控模式還不清楚。本發(fā)明獲得的白化轉(zhuǎn)綠突變體，是眾多白化突變體中較為特殊的一類，苗期表現(xiàn)為白化性狀，但在發(fā)育后期新生的葉片可以復(fù)綠，保證突變體的正常生長。通過圖位克隆技術(shù)本發(fā)明首次在水稻中克隆了相關(guān)基因FLN2，該基因編碼果糖激酶類似蛋白，屬于pfkB家族，在水稻中影響前質(zhì)體及葉綠體的發(fā)育。通過對FLN2基因的功能解讀，將為深入研究葉綠體發(fā)育機(jī)制，闡明植物光合系統(tǒng)作用的分子機(jī)理，進(jìn)而為水稻高光合育種奠定基礎(chǔ)。綜上所述，本發(fā)明利用水稻白化突變體st10，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了FLN2基因，該基因編碼pfkb家族中的果糖激酶類似蛋白，在水稻中影響質(zhì)體、葉綠體的早期發(fā)育。通過對FLN2基因的功能解讀，進(jìn)一步明確了FLN2對質(zhì)體發(fā)育的影響，同時為研究前質(zhì)體向葉綠體轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體st10與野生型NIP(日本晴)苗期、分蘗期及抽穗期的表型；A：水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體st10與野生型NIP苗期全白的表型；B：水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體st10與野生型NIP分蘗期復(fù)綠的表型；C：水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體st10與野生型NIP抽穗期復(fù)綠的表型。圖2是FLN2基因在水稻第3染色體上的初步定位圖。圖3是FLN2基因的精細(xì)定位及突變位點(diǎn)示意圖；A,B:FLN2基因精細(xì)定位區(qū)間；C,D:候選基因外顯子、內(nèi)含子分布及突變位點(diǎn)示意圖；E:FLN2DNA序列突變位點(diǎn)比對；F:FLN2蛋白序列突變位點(diǎn)比對。圖4是互補(bǔ)載體pCAMBIA1300-FLN2圖譜。圖5是功能互補(bǔ)實(shí)驗T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株表型及測序驗證；從前至后依次為：st10轉(zhuǎn)空載體轉(zhuǎn)基因株；st10轉(zhuǎn)互補(bǔ)載體p1300-FLN2轉(zhuǎn)基因株；st10轉(zhuǎn)空載體轉(zhuǎn)基因葉片特寫；st10轉(zhuǎn)互補(bǔ)載體p1300-FLN2轉(zhuǎn)基因葉片特寫；st10轉(zhuǎn)互補(bǔ)載體p1300-FLN2T0代轉(zhuǎn)基因株測序結(jié)果。圖6是FLN2亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果；圖A：以pBI221-GFP為骨架構(gòu)建的pBI221FLN2亞細(xì)胞定位載體；圖B：FLN2在細(xì)胞中定位于葉綠體中；圖B顯示了不同觀察條件下拍的照片。圖7是突變體st10與對照日本晴二葉期高溫及低溫培養(yǎng)條件下光合色素含量；圖A為：24℃培養(yǎng)條件下st10突變體與野生型在葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素含量等方面差異不大；圖B為：32℃培養(yǎng)條件下st10突變體與野生型相比葉綠素a，葉綠素b及類胡蘿卜素含量明顯減少。圖8是突變體和野生型的透射電鏡結(jié)果；圖A為：不同放大倍數(shù)下對照NIP及突變體st10前質(zhì)體的發(fā)育情況；突變體的前質(zhì)體發(fā)育受到抑制；圖B為：不同放大倍數(shù)下對照NIP及突變體st10葉綠體的發(fā)育情況，突變體葉綠體發(fā)育異常，基粒片層消失。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：1、水稻材料：水稻(OryzasativaL.)突變體st10，原始野生材料為粳稻品種“日本晴”。水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體st10來自日本晴EMS(EthylMethylSulfonate)誘變產(chǎn)生的突變(如圖1所示)，該突變體是在中國浙江省境內(nèi)獲得。誘變方式為：1％的EMS溶液浸泡誘變；選取苗期白化3葉期后部分復(fù)綠的幼苗認(rèn)定為突變體st10。st10通過與秈稻品種(即，秈稻品種培矮64s)的正交實(shí)驗，證明該突變體受隱性單基因控制。實(shí)驗的結(jié)果為：在M2代群體中隨機(jī)選擇72個單株進(jìn)行遺傳分析，51株為野生型表型，21株為突變型表型，卡平方檢測結(jié)果(χ2＝0.63<χ20.05＝3.84)，分離比符合3：1，說明該突變表型由單隱性核基因控制。以秈稻品種培矮64s為母本，st10為父本進(jìn)行正交所得的F1代植株全部表現(xiàn)為正常表型，F(xiàn)1代自交，得F2代；F2代種子播種四周后，隨機(jī)選300個單株其中215株表現(xiàn)為野生型表 型，85株表現(xiàn)為突變型表型?？ㄆ椒綑z測結(jié)果(χ2＝1.77<χ20.05＝3.84)，正常植株表型和突變體植株表型分離比符合3：1；進(jìn)一步證明該突變表型受隱性單隱性核基因控制。2、分析和定位群體：純合的st10突變體和野生型品種秈稻品種培矮64s進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2群體。并從中選出2885株白化突變個體(隱性個體)作為定位群體。在三葉期每株取0.2克左右的嫩葉，用來提取總DNA。3、SSR和STS標(biāo)記定位FLN2基因采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約0.2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于150μl超純水中，作為DNA樣品。每一個PCR反應(yīng)用2μlDNA樣品。FLN2基因的初步定位：在st10與培矮64s組合的F2群體中選取30個隱性個體，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)5％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將FLN2初步定位在第3號染色體短臂STR20和STR15兩STS標(biāo)記之間(如圖2所示)。PCR反應(yīng)體系如下：10μl反應(yīng)體系中包括：DNA模板1μl；10xPCRbuffer1μl；dNTP(2.5mmol/l)1μl；PrimerF(2.5μmol/l)1μl；PrimerR(2.5μmol/l)1μl；TAKARA公司的rTaq聚合酶0.5μl；ddH2O4.5μl。PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性4min；94℃下30s，退火30s(退火溫度隨不同標(biāo)記各異，變化范圍在48℃-60℃之間)，72℃延伸30s；共40個循環(huán)；72℃下延伸10min，15℃保溫。反應(yīng)產(chǎn)物用4％-5％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后紫外燈下觀察。FLN2基因的精細(xì)定位：選取st10與培矮64s組合的F2群體中共2885株隱性個體，在初定位的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計SSR和STS標(biāo)記，最終將FLN2精確定位于精確定位于BAC號為OJ1519_A12上48-kb范圍之內(nèi)，兩邊的分子標(biāo)記為STR11與STR12引物序列為：STR11：F：GGAAGTAGCCCTGTCTCAAA，R：CCTTGAACCTGTGCTCCT；STR12：F：GGTTACATCTCCTTTTCGTT，R：CTTTGTTTGCTGCCATCT；備注說明：如圖3所示，引物序列見表1。表1、FLN2基因的定位標(biāo)記序列MarkePrimers(5’to3’)SenseAnti-senseCHL-8GTTTTACCGATGGTTGATGATCGTGGATGCCTTTGGAGSTR6GCGAGTGTCTTCGTTTGTTGACTTGTTCCACTCCACTCTSTR11GGAAGTAGCCCTGTCTCAAACCTTGAACCTGTGCTCCTSTR12GGTTACATCTCCTTTTCGTTCTTTGTTTGCTGCCATCTSTR15GTCGCCCTCTCCTCCGCGTCGTTGTAGTGGCTCTGTSTR16TCTAAAAGTGGATGACAAGGGCCACGGCTAATGTTGTTTSTR17TTTTCGTTAGCATCACTTTGGCACACATTTCAAGATTCAASTR19TCCATTGTCAAAAGGTAGGTATTTGGTGAGTGGGATGSTR20GCCACTTTCAATCTTATGCAAATGTGAACCCGGACTASTR21AGGCAGAGGAAGAAGGAGTTTTTGGTGGACTGGAAGSTR22CTTCTTCCGCCATTGTCTGTTTTGTTTGGCTTGCTGSTR24GGACTAAGGAGCAACAGCCCCCAACAACACCTACCACAT備注說明：CHL8，STR6，STR20，STR15，STR16和STR17是初定位所用的標(biāo)記，STR19，STR11，STR21，STR12，STR22和STR24是精細(xì)定位中所用標(biāo)記。4、基因預(yù)測和比較分析：根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在48-kb范圍內(nèi)根據(jù)RiceAutomatedAnnotationSystem(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有7個候選基因。根據(jù)兩標(biāo)記剩余的重組個體數(shù)，我們設(shè)計了各基因的測序引物，采用PCR方法分別從st10和野生型品種基因組中擴(kuò)增出候選基因進(jìn)行測序分析。發(fā)現(xiàn)st10突變體在LOC_Os03g40550的第5個外顯子處發(fā)生1個堿基的替換突變，由G突變?yōu)锳，使蛋白翻譯提前終止。將此用不同的突變單株及群體中突變表型的單株，各重復(fù)驗證三次，突變位點(diǎn)穩(wěn)定存在(測序引物序列見表2)。根據(jù)BAC克隆OJ1519_A12序列的基因注釋信息(NCBI)，預(yù)測此基因編碼pfkB家族中的果糖激酶，因此我們將該基因命名為果糖激酶類似蛋白編碼基因(Fructokinase-likeprotein2)FLN2，該基因全長4534bp，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。該基因FLN2的cDNA序列如SEQIDNo：1所示，gDNA序列如SEQIDNo：2所示。該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo：3所示。表2、FLN2基因的測序引物序列實(shí)施例2：1.植物轉(zhuǎn)化：以粳稻品種“日本晴”基因組為模板，根據(jù)目的基因設(shè)計引物F-5’-aaggtaccTGGCCCATATCTTAGCAGCTT-3’和R-5’-cctctagaGTATGGCCAGTTGACCACGA-3’，PCR擴(kuò)增體系為：50μL的PCR反應(yīng)體系：模板DNA(0.2μg/μL)2μL；2×PCRbuffer25μL；2mmoldNTP(羅氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶(1U/μL)1μL；10μMPrimerF3μL；10μMPrimerR3μL；ddH2O6μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸8min；共35個循環(huán)；68℃下延伸10min，15℃保溫。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分離，回收得到7354bp的DNA片段，用KpnI和XbaI雙酶切目的片段和pCAMBIA1300(p1300)后進(jìn)行連接，獲得了互補(bǔ)載體pCAMBIA1300-FLN2，該克隆覆蓋了整個ORF的基因組區(qū)域(即包含了SEQIDNo：2所示的核苷酸序列)，還包括ATG上游2029-bp啟動子序列和TGA下游1208-bp終止子序列(如圖4所示)。這個質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中轉(zhuǎn)化水稻。我們利用突變體成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25℃條件下共培養(yǎng)3天后，在含有300mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷(即在抗性培養(yǎng)基上可以重生的愈傷)在含有250mg/L潮霉素預(yù)分化培養(yǎng)基上，光照、25℃培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照，25℃條件下培養(yǎng)至分化出苗，一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進(jìn)行鑒定和連續(xù)的觀察發(fā)現(xiàn)，與同時期的突變體比較，轉(zhuǎn)基因植株葉色恢復(fù)為正常綠色，與轉(zhuǎn)入空載p1300的日本晴表型一致。備注說明：上文中的目的片段是指覆蓋了整個ORF的基因組區(qū)域(即包含了SEQIDNo：2所示的核苷酸序列)，及ATG上游2029-bp啟動子序列和TGA下游1208-bp終止子序列。上文中所涉及的各種培養(yǎng)基的配方可參考TokiS.,HaraN.,OnoK.,OnoderaH.,TagiriA.,OkaS.,TanakaH.(2006)EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh‐speedtransformationofrice.ThePlantJournal47:969-976。通過上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明：本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5)。即，所述轉(zhuǎn)基因水稻的葉片顏色得到改良。2.水稻亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建根據(jù)FLN2cDNA(即包含了SEQIDNo：1所示的核苷酸序列)序列設(shè)計引物，40550cds-221F:gcggatccATGCACCGAATGGCTTCTCTTC，40550cds-221R:caaagcttCTCCACATATAAAAGCTCACTC，以NIPcDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用BamHI和HindIII雙酶切目的片段和pBI221-GFP載體后進(jìn)行連接，獲得了亞細(xì)胞定位載體pBI221FLN2(如圖6A所示)。3.水稻原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及FLN2綠色熒光融合蛋白的定位觀察:(1)生長15天左右的水稻(NIP)幼苗用鋒利的刀片在塑料培養(yǎng)皿板上切碎幼苗莖葉，移到200ml洗凈的錐形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；預(yù)先將酶解液倒入瓶中，根據(jù)瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜裝太多。放入28℃搖床，60-80rpm,4-6小時。(2)在酶解時間完成之前，配置PEG400040％溶液，置于65°水浴鍋中或室溫溶解，65°溶解時，中間取出來振蕩一次。(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入約15ml左右的W5溶液。用300目(或400目)的鋼制濾網(wǎng)將碎葉片過濾掉，用干凈的塑料培養(yǎng)皿收集酶解后的原生質(zhì)體。然后將原生質(zhì)體緩慢倒入(或用去槍尖的槍頭吸取)50ml離心管中，天平稱重平衡后，放入水平離心機(jī)，150g，5min，充分收集原生質(zhì)體。離心完成后，緩慢吸走上清。(4)向原生質(zhì)體沉淀中加入1mlW5溶液，緩慢輕輕傾斜混勻重懸，然后用去槍尖的槍頭吸移到2ml離心管中。此時50ml離心管中可能還有少量未重懸的原生質(zhì)體，可再加入1mlW5溶解，吸移到之前的2ml離心管中，150g，3min，移除上清液。(5)用MMG重懸，具體加多少根據(jù)原生質(zhì)體的量和要轉(zhuǎn)的質(zhì)粒個數(shù)來定，一般最后每個質(zhì)粒中加入100ul稀釋的原生質(zhì)體(上述步驟3所得)?；蛘哂蔑@微鏡稍微觀察下產(chǎn)量和酶解后完整個體的數(shù)目比例，然后根據(jù)原生質(zhì)體的狀態(tài)來確定MMG用量。(6)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒10-15ug左右或10ul，于2ml離心管中。即，“p35s::GFP”和“p35s::FLN2::GFP”這兩個質(zhì)粒分別被轉(zhuǎn)入了原生質(zhì)體。(7)加入100ul的重懸好的原生質(zhì)體，然后加入PEG40％110ul，混勻。(8)28℃避光靜置15min。(9)加入足量(即5倍體積的原生質(zhì)體)的W5稀釋，混勻，然后離心150g，3min，,緩慢移除上清，再用W5洗一次(中間會有損失，但不影響結(jié)果)。最后得到的沉淀，用W5重懸(用2ml的管子裝滿)，輕輕混勻，移到細(xì)胞培養(yǎng)板中。用錫箔紙包裹，避光28℃靜置培養(yǎng)，14小時。(10)培養(yǎng)時間完成后，將培養(yǎng)板各孔中沉淀的原生質(zhì)體輕輕混勻，吸移到2ml管中，然后離心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重懸原生質(zhì)體。(11)共聚焦顯微鏡觀察拍照。結(jié)果顯示陽性對照在細(xì)胞各個部位均有表達(dá)，說明實(shí)驗的表達(dá)系統(tǒng)工作正常，F(xiàn)LN2GFP融合蛋白特異的在葉綠體中表達(dá)，其他部位未見表達(dá)，說明FLN2是定位于葉綠體中的蛋白(圖6B)。圖6B中“p35s::GFP”對應(yīng)的是“p35s::GFP”轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體后拍的照片，即陽性對照；“p35s::FLN2::GFP”對應(yīng)的是“p35s::FLN2::GFP”轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體后拍的照片，即FLN2的細(xì)胞定位結(jié)果。備注說明：上文中所涉及的各種溶液的配方可參考Zhangetal.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglightchloroplast-relatedprocesses.PlantMethods2011,7:30.4.光合色素含量測定：在光照培養(yǎng)箱(Panasonic,MLR-352H-PC)中按照如下條件分高低溫暗培養(yǎng)NIP和突變體至二葉期：高溫32℃10小時，30℃14小時；低溫24℃10小時，20℃14小時；然后轉(zhuǎn)光照，培養(yǎng)條件如下：高溫32℃10小時光照，30℃14小時黑暗；高溫24℃10小時光照，20℃14小時黑暗；光照強(qiáng)度均為200μmol/m2.s，培養(yǎng)至四葉期，分別取突變體和野生型第四葉去掉主脈，剪成1cm左右的片段，稱取0.2g浸泡于10ml80％丙酮，26℃條件下暗培養(yǎng)48小時。取溶液在紫外分光光度計(DU800,BECKMANCOULTER)663nm、645nm和470nm三種波長下測定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的光密度值。3次重復(fù)，然后根據(jù)Amon(1949)的方法計算出各檢測葉片中的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)的含量,按照Wellburn(1994)計算類胡蘿卜素(Car)的含量，計算公式如下：chla＝(12.7×OD663－2.69×OD645)×V/Wchlb＝(22.9×OD645－4.68×OD663)×V/Wcar＝(1000×OD470×V/W－3.27×Chla－104×Chlb)/198其中：V為提取液體積(10ml)，W為葉片質(zhì)量0.2g，OD663、OD645及OD470為在分光 光度儀上讀取的光密度值，單位：mg/g。結(jié)果顯示，低溫條件下培養(yǎng)的突變體與NIP相比，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素的含量及葉綠素a/b的比值均略有減少，但總體來說變化不大(圖7A),；而高溫條件下培養(yǎng)的突變體與NIP相比，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b及類胡蘿卜素的含量均明顯減少，葉綠素a/b的比值卻略有增加(圖7B)，這些結(jié)果說明突變體st10d的白化表型是由于葉綠素和類胡蘿卜素缺失引起的，而且與環(huán)境溫度相關(guān)，高溫條件會延遲突變體復(fù)綠。5.葉綠體透射電鏡的制備和觀察:(1)樣品:前質(zhì)體取樣：30℃12小時，24℃12小時，避光條件下培養(yǎng)突變體和NIP至二葉期，取突變體和對照NIP葉片，切成0.5～1mm3左右的小塊；葉綠體取樣：30℃12小時，24℃12小時，光照條件下培養(yǎng)突變體和NIP至二葉期，取突變體和對照NIP葉片，切成0.5～1mm3左右的小塊；(2)固定：將切好的樣品塊放入2ml離心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空儀器中抽真空直到葉片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％鋨酸固定2～3小時，直至樣品變黑；(3)脫水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脫水，每個濃度處理20分鐘，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液處理20分鐘，以上均在4度冰箱內(nèi)進(jìn)行，最后將樣品用純丙酮室溫處理20分鐘；(4)滲透：將樣品在無水丙酮和包埋劑(3：1)混合液中作用4小時，再在無水丙酮和包埋劑(1：1)混合液處理3小時，最后在純的包埋劑中作用12小時；(5)包埋：將上述步驟中的樣品挑的包埋盒內(nèi)，37℃過夜，45℃處理12小時最后60℃處理24小時，獲得包埋樣品；(6)切片、拍照：將包埋樣品用超薄切片機(jī)切成60-70nm左右的超薄片，然后將切片用檸檬酸鉛溶液染色10分鐘，再有醋酸鈾溶液染色30分鐘，雙蒸水清洗三次后晾干，用HitachiH-7650型透射電鏡觀察并且選擇清晰地倍數(shù)拍照。結(jié)果顯示NIP的前質(zhì)體發(fā)育飽滿，排列規(guī)則，而st10前質(zhì)體發(fā)育明顯受到抑制，數(shù)量大幅減少，形狀畸形(圖8A)；對葉綠體的觀察結(jié)果顯示，野生型葉片的葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目較多，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，葉綠體中基粒片層排列整齊，緊密，而突變體葉片中幾乎看不到完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，極個別的葉綠體其內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，根本無法辨別基粒片層的排列(圖8B)。這些結(jié)果表明FLN2基因的突變造成突變體中葉綠體數(shù)目的減少和結(jié)構(gòu)的破壞。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不 限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<110>中國水稻研究所<120>水稻質(zhì)體發(fā)育調(diào)控基因FLN2及其用途<160>3<210>1<211>1770<212>cDNA<213>水稻（Oryzasativa）<400>1atgcaccgaatggcttctcttcttctccccccgcagtttctttgctccctgccttgtagt60accaactcaatcaggagccatttacattataagccccacttcttgggaaacattatgact120aagcctaaagctaaaatgaggctgctcaaccgaaacgtaagttccatggcaaagaagagc180tctcaagatgtagcagaaggttcaagtgatgatgagagtgacggcgagacatcaaaaacc240aagaaaagagctccgagacgtggaagaaagaaagccaccatacaagcatcagaaggggaa300acacaagaaggtcaagtgagcactgaagaagatgaatcccctgaagggactaagaaaata360aaaaggaggggccgcaagaaagctgcaactactgcaagctcatcggaagagaaggacaaa420gcaaaagaaccaaagaagaggggcagaagaaaagttaagactgtagaggaattgagtgac480aatgaaggggaagatctgggtgaagatctagtgccctccaatgacaggcaggagaaaatt540tcagcaaatgacctagaaagtaaaatagcagcattgctattagaagatactgatgataat600gatattaacaatttaatccctcttgtgtgctgctttgggcctgctaagtactcatttatt660ccttctggaagacctgctaataggctgatagatcatgaaattcatgagggaatgaaagac720atgttctggtctccagatcaatttgtaagggcaccaggaggatcatcatccaatgttgct780cttgctttagcagcttctggtggccgggttgaattcatgggaaaactaggcgatgatgat840tatggtcaaagtacattatatcacttgaacgtcaatggagttcaaactcgggcaattaaa900atggacccttcagcgtttactgccatgtccttgatgaaggtcacaggtaggggtagcttg960aaaatgagctgtgctaaaccttgtgcagaggattgttttgtccaaactgatatcaaccca1020gctgttttaaaagaggctaagatgttttactacaattcttcagctttgcttgagcccacg1080acacgatcatcattgtcgaaagcaattgaggtttccaagaaatttggtggtgtaacattc1140tttgatctcaatcttccactgccattatggtcgtccagtaaggagaccaagtcacttgtc1200aaggaagcatgggaagctgctgatattattgaaatcactaagcaggaacttgagttcttg1260tgtggcattaaaccatctgagaaatttggtacgaaggataatgataaatccaaattcact1320cactacagcccagaagttgttacgaaattgtggcatgaaaatctcaaggtcctttttgtg1380acaaacggcacttctaagattcattattacacaaaagagcatgatggctgggttcgtggc1440acagaagatgcaccaattactcctttcaccggtgacatgtcacaatcaggtgacgccatt1500gttgcagctctgatgaagatgctggcaattaaccctcacctggtcactgacaaggattac1560ttgcatactgcaatgaaacatgctattacatgtggtgtcattgaccagtggttacttgca1620cgagaacgagggttccttcccagagaaagagcagatccaaccagtgaacagtttggagtg1680agattcgtcacagagaaggaataccgtacacttcctgattccatacatacagaggattca1740tcagagagtgagcttttatatgtggagtga1770<210>2<211>4534<212>gDNA<213>水稻（Oryzasativa）<400>2ctgctcagctctgagcttcttcgtttgagggattttcttctcccgggaggcggaagaggc60gtaggcgaggattcttgtaggaatcctctcctctccattgatgcaccgaatggcttctct120tcttctccccccgcagtttctttgctccctgccttgtagtaccaactcaatcaggtatgt180aatgcttcatttttctgtgtaatgcagcttcttcttcttcttcttctggtagtagctgat240atgagtgcgtgtggcgatctctttcggattgtttgagtcgccaccatatggatcctaggt300tagggaagggaaaggagcagcacatggagtggagattgtggcatctttctttggtcccaa360atttccaatagatcttgggtctatgttttgtttcattttttgataacaactatttgattc420ttacaagatgaacaatatgtcatcaaattgtgatgtgtactcgatgaaatatatatatat480accgcttgtacctagccttgtctgaatatgctcccacgtggtatggtagcagcttcatat540ttgaatcgtgtgataacattagttctatcttacattcacttattctttattttttaacac600atcactacttacattatggtttaaattccaacagttattagtgacttgcttccgatgtgt660aatgtgcaggagccatttacattataagccccacttcttgggaaacattatgactaagcc720taaagctaaaatgaggctgctcaaccgaaacgtaagttccatggcaaagaagagctctca780agatgtagcagaaggttcaagtgatgatgagagtgacggcgagacatcaaaaaccaagaa840aagagctccgagacgtggaagaaagaaagccaccatacaagcatcagaaggggaaacaca900agaaggtcaagtgagcactgaagaagatgaatcccctgaagggactaagaaaataaaaag960gaggggccgcaagaaaggtacatcttgcttgcatattttcagtagagtacttccttcaat1020aacttaagaaaaaaattatcgtaaacccttagcaagtcatgacttctctcctatgttgca1080gctgcaactactgcaagctcatcggaagagaaggacaaagcaaaagaaccaaagaagagg1140ggcagaagaaaagttaagactgtagaggaattgagtgacaatgaaggggaagatctgggt1200gaagatctagtgccctccaatgacaggcaggagaaaatttcagcaaatgacctagaaagt1260aaaatagcagcattgctattagaagatactgatgataatgatattaacaatttaatccct1320cttgtgtgctgctttgggcctgctaagtactcatttattccttctggaagacctgctaat1380aggctgatagatcatgaaattcatgagggaatgaaagacatgttctggtctccagatcaa1440tttgtaagggcaccaggaggatcatcatccaatgttgctcttgctttagcagcttctggt1500ggccgggttgaattcatgggaaaactaggcgatgatgattatggtcaaagtacattatat1560cacttgaacgtcaatggagttcaaactcgggcaattaaaatggacccttcagcgtttact1620gccatgtccttgatgaaggtcacaggtaggggtagcttgaaaatgagctgtgctaaacct1680tgtgcagaggattgttttgtccaaactgatatcaacccagctgttttaaaagaggtaaag1740acgagtacatcaaacaatattttgattacaccttatcctctacaatattatctattacta1800catggtttaatgataaactgtatgcacacttgattggtcttgagaaaagtttgtttgtgc1860catgcacattgtggcaacaataaattgtttaaatgttcacatggtaaagttattttacta1920tgctgacctatcattatgttgtggtgcattttcttttgtcagagatgattagttaatgaa1980agagtactacacggatcagaagatttgtatgtcacacattgttttgttagttataattaa2040tctggtatggaaattttaccacataaaagcaaattttgttgaataattctgttccttata2100cagttagaaagattctatttttctttatcacaagaagagcttgctaaagtgaagaagttg2160ctttcagctgatggcatattatactgtttagatgtgcaattcataattcagttgcaacat2220tgtttgcaatacagaagtcattatatttatatcaaaagacttaaggaacaactagggcta2280tactgctaaattaatgtacttgtccaaaaagataataagaggaaattactcaactcgatt2340tctatcaattcaaacttgctatctattagttgaccatgaatgtgtcaaaatgatactatg2400tactataaacaaatgggaggtttacctgttttcattgccgtgctttggtaggttcagaaa2460aagaagtaaataaaacactttcagttcacaactgtgctttttctacatgtttgcacttag2520catggttattttttagtcagaagacacataaacctgtaccataatgatcttaattttttg2580taaaaaaccttttagcagttagggcactacaagctgctctgtactggaacttgttggata2640atatctttgctaatgctgaatgtctgaaaattcccaaactcaaaataatatg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