專利名稱：：提取獼猴桃蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于從獼猴桃果實(shí)中分離提取獼猴桃蛋白酶方法的改進(jìn)。
背景技術(shù)：
：獼猴桃是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的果品，被稱為“Vc之王”、保健果品和太空食品。獼猴桃果實(shí)中除含有大量的Vc和多種礦物元素外，還含有大量的獼猴桃蛋白酶。獼猴桃蛋白酶是一種其活性中心含有巰基的植物蛋白酶，在醫(yī)藥、食品、啤酒生產(chǎn)、化妝美容、生化試劑等領(lǐng)域有廣泛的用途。中國(guó)是獼猴桃生產(chǎn)大國(guó)，已有兩千年的栽培歷史。近20年來，獼猴桃的人工栽植面積迅速擴(kuò)大，目前全國(guó)總面積為87萬(wàn)畝，年產(chǎn)鮮果33萬(wàn)噸，獼猴桃資源十分豐富。獼猴桃果實(shí)屬于呼吸躍變型的漿果，不耐貯藏，鮮果如若銷售不暢，造成積壓，將會(huì)造成資源上的浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)上的損失。同時(shí)獼猴桃生產(chǎn)中每年約有20％的殘次果也有待于加工利用。為了充分利用這些獼猴桃資源，可采用生物化學(xué)的方法，分離提取出其中的獼猴桃蛋白酶。通過深加工的方式，不僅可以有效地解決獼猴桃殘次果的出路問題，為果農(nóng)增加收入，延伸獼猴桃生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)鏈，同時(shí)也可以為市場(chǎng)上提供較為緊缺的獼猴桃蛋白酶的產(chǎn)品。有關(guān)獼猴桃蛋白酶的分離提取技術(shù)，目前公開的報(bào)道還比較少。1986年廈門大學(xué)林沁瑛等人用硫酸銨沉淀法分離提純獼猴桃蛋白酶(林沁瑛等，中華獼猴桃蛋白酶分離提純及性質(zhì)研究，《廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版)》，1986，25(3)347～353)，該方法屬于實(shí)驗(yàn)室的制備方法，所用儀器設(shè)備昂貴，制備的酶樣量較少，僅供科研分析之用，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)提取所用的硫酸銨殘留在酶品中，也限制了其酶在醫(yī)藥、食品中的應(yīng)用。本發(fā)明人于日前提交了用氯化鈉食鹽沉淀法分離提取獼猴桃蛋白酶的專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N200410025932.8)，該方法雖克服了已有技術(shù)的缺陷，降低了提取成本，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，酶制品也符合食品醫(yī)藥等用途的要求，但作為工業(yè)化的生產(chǎn)工藝技術(shù)，仍存在有食鹽用量較大、工藝周期較長(zhǎng)、需冰箱冷庫(kù)等設(shè)備進(jìn)行低溫沉淀等生產(chǎn)性問題。在常見的分離提取植物蛋白酶的方法中，主要是采用沉淀法，而沉淀法中最關(guān)鍵的技術(shù)是沉淀劑的選擇。在經(jīng)典的生物化學(xué)方法中，常用的沉淀劑是中性鹽，如上所述的硫酸銨和氯化鈉等，這些方法一直沿用了近200年。在近代對(duì)植物天然活性成分進(jìn)行深入研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)茶葉中的主要活性成分茶多酚也是一種良好蛋白質(zhì)沉淀劑，可用于沉淀分離蛋白質(zhì)或酶。茶多酚(簡(jiǎn)稱TP，teapolypHenol)是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，是一類分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)游離酚羥基的復(fù)合體。茶多酚在茶葉中的含量為18％～36％。由于茶多酚在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有許多重要的用途，近年來對(duì)茶多酚化學(xué)性質(zhì)的研究也逐漸深入。最初人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到茶多酚具有鞣質(zhì)和單寧所特有的收劍性，即茶多酚中游離的酚羥基可以與病毒、細(xì)菌上的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，因而具有抗病毒殺菌作用(楊賢強(qiáng)等，《茶多酚化學(xué)》上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003，44-46)。隨著研究的深入，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)茶多酚具有多酚類化合物一個(gè)共同的化學(xué)性質(zhì)即茶多酚中大量的游離酚羥基，可以與蛋白質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，在等電點(diǎn)時(shí)，就可以將蛋白質(zhì)或酶從溶液中沉淀分離。對(duì)于茶多酚絡(luò)合沉淀蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)的研究，HaslamE.等人(HaslamE.PlatPolyenolsVegetableTannisRevisited，CambridgeUniversitypress，1989，10，170)提出了茶多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的理論模型及作用條件，楊賢強(qiáng)等人系統(tǒng)描述了茶多酚沉淀蛋白質(zhì)的作用模式。在這些理論的指導(dǎo)下，近幾年人們已經(jīng)開始將茶多酚用于分離提取蛋白質(zhì)實(shí)際工作中。但由于茶多酚在這一方面的應(yīng)用研究仍處于起步階段，可參考的實(shí)例較少，應(yīng)用范圍也僅局限在少數(shù)幾種蛋白質(zhì)中。而對(duì)于利用茶多酚分離提取獼猴桃蛋白酶，經(jīng)資料檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)這方面的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的獼猴桃蛋白酶的提取方法，使其進(jìn)一步降低提取成本，并使操作更為簡(jiǎn)化，工藝周期縮短，提高酶的收率，使整個(gè)工藝過程更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提出的獼猴桃蛋白酶分離提取是采用絡(luò)合沉淀法，方法步驟包括有果汁與沉淀劑的混合，靜置沉淀，固液分離，干燥粉碎；本發(fā)明的特點(diǎn)在于，所使用的沉淀劑為含有茶多酚的水溶液，其茶多酚含量的重量比為0.1％～0.5％，其與獼猴桃果汁混合的體積比為0.8～1.1∶1。所述含有茶多酚水溶液的配制可以采用粉未狀商品茶多酚，用水配制成0.2％～0.5％(w/w)的水溶液，其與獼猴桃果汁混合的體積比為0.8～1∶1；含有茶多酚的水溶液也可以采用茶葉制成的茶葉水，其中茶多酚的含量(w/w)為0.1％～0.4％，其與獼猴桃果汁混合的體積比為0.9～1.1∶1。本發(fā)明所述的絡(luò)合沉淀是，在獼猴桃果汁中加入含有茶多酚的水溶液后，茶多酚便會(huì)與獼猴桃蛋白酶發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成茶多酚—蛋白質(zhì)的復(fù)合物，進(jìn)而凝集產(chǎn)生絮狀沉淀，從而使獼猴桃蛋白酶從溶液中沉淀析出。本發(fā)明所述的常溫靜置沉淀是，蛋白酶的沉淀析出過程是在室溫條件下進(jìn)行，即將含有茶多酚的水溶液與獼猴桃果汁混合后放在室溫條件下，2～4小時(shí)后即可完成沉淀析出。一般情況下，若使用的沉淀劑是商品茶多酚，所需的沉淀時(shí)間較長(zhǎng)，最低沉淀時(shí)間為4小時(shí)；若使用的沉淀劑是新鮮茶葉水，所需的沉淀時(shí)間較短，最低沉淀時(shí)間為2小時(shí)。本發(fā)明所述的固液分離、干燥粉碎及乙醇提純均采用已有技術(shù)。本發(fā)明沉淀時(shí)對(duì)于混合液中的等電點(diǎn)并無(wú)嚴(yán)格要求。由于茶多酚絡(luò)合沉淀蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)，等電點(diǎn)對(duì)于協(xié)助沉淀蛋白質(zhì)的作用微弱，所以要求的pH值范圍較寬，一般情況下，調(diào)整混合液的pH值至3.0～5.5均可。為規(guī)范操作，可以調(diào)pH值至5.0為宜。在實(shí)際生產(chǎn)操作中，為了更好地在室溫條件下完成操作，當(dāng)榨取的獼猴桃果汁不能及時(shí)進(jìn)行處理且室溫過高時(shí)(20℃以上)，可以向果汁中加入8％～12％(w/v)的食鹽以利于果汁存放。加入氯化鈉的目的一方面可以起防腐作用，同時(shí)氯化鈉也可作為沉淀劑起到助沉作用，使形成的沉淀更徹底，以提高酶的收率。本發(fā)明采用絡(luò)合沉淀法所依據(jù)的原理是茶多酚是近年發(fā)展起來的一種新型沉淀劑，對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力強(qiáng)，沉淀效率高。茶多酚是多酚類化合物，所含大量的游離酚羥基可以與蛋白質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，將茶多酚與蛋白質(zhì)所形成的復(fù)合物在等電點(diǎn)下沉淀析出，就可以達(dá)到分離提取蛋白質(zhì)或酶的目的。關(guān)于茶多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的理論模式，HaslamE.提出的模式是多酚類與蛋白質(zhì)結(jié)合的主要形式是氫鍵，即多酚中的酚羥基-OH與蛋白質(zhì)肽鏈上的-NH-CO-以及與側(cè)鏈上的-OH、-NH2、-COOH等以氫鍵形式結(jié)合。楊賢強(qiáng)等人進(jìn)一步解釋了多酚類與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合模式可以是多點(diǎn)疏水鍵與氫鍵的結(jié)合，即多酚分子中的疏水基團(tuán)進(jìn)入蛋白質(zhì)分子中的疏水部位，然后多酚上的酚羥基與蛋白質(zhì)分子中的極性基團(tuán)(如肽基-NH-CO、羥基-OH、羧基-COOH等)發(fā)生兩點(diǎn)以上的多位點(diǎn)氫鍵結(jié)合，從而使多酚與蛋白質(zhì)之間形成一種穩(wěn)定結(jié)合。本發(fā)明采用茶多酚作為蛋白質(zhì)沉淀劑，具有以下明顯優(yōu)勢(shì)①茶多酚是茶樹的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在茶葉中的含量相當(dāng)高(18％～36％)。屬于植物天然活性成分，食品級(jí)原料，無(wú)毒無(wú)害，符合醫(yī)藥食品特殊的安全衛(wèi)生要求，因此適合用作提取獼猴桃蛋白酶，本發(fā)明中的茶葉可以是低檔茶、茶梗、茶末等。②茶多酚沉淀分離蛋白酶的效力高，且用量少，形成的沉淀物密集徹底，易于過濾，且形成沉淀所需的時(shí)間短，使整個(gè)工藝周期縮短。③茶多酚對(duì)于生物大分子具有抗氧化和保護(hù)作用，可以穩(wěn)定酶活性；由于獼猴桃蛋白酶屬于巰基植物蛋白酶，其巰基易被氧化而失活，本發(fā)明將茶多酚用于酶的分離提取，可以使酶活性中心的巰基得到保護(hù)，因而具有特殊的意義。④茶葉是廣泛種植的飲用性植物，中國(guó)是茶葉生產(chǎn)大國(guó)，每年均有大量的中低檔茶及茶梗、茶未，原料資源十分充足，將其作為沉淀劑使用，可提高茶葉產(chǎn)業(yè)的綜合經(jīng)濟(jì)效益。由以上可看出，本發(fā)明所提出獼猴桃蛋白酶的提取方法具有以下特點(diǎn)1)用茶多酚作為沉淀劑分離提取獼猴桃蛋白酶，既可以降低食鹽用量或不用食鹽，又可以省略脫鹽步驟，減少工藝操作環(huán)節(jié)；2)由于茶多酚對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力較強(qiáng)，所需的沉淀時(shí)間短，由鹽析法的12小時(shí)減少為2～4小時(shí)；而且過濾速度加快，使整個(gè)工藝周期縮短；3)本發(fā)明中的沉淀過程是在常溫下進(jìn)行(鹽析法是在低溫下進(jìn)行)，因此，生產(chǎn)中不必投入冰箱、冷庫(kù)等大型設(shè)備；4)降低了提取成本，與食鹽沉淀法相比，使用商品茶多酚可降低固定成本10％以上，使用茶葉水可降低固定成本20％以上；5)提高了酶的收率，在以下幾種提取方法中，獼猴桃蛋白酶的粗酶收率分別為食鹽沉淀法為1.22％，使用商品茶多酚為1.46％，使用茶葉水為1.52％，使用茶葉水并加入食鹽為1.76％；6)本發(fā)明直接用現(xiàn)場(chǎng)熬制的茶葉水分離沉淀獼猴桃蛋白酶，這樣做不僅原料易得、價(jià)格便宜、且茶多酚未經(jīng)分級(jí)純化，分子量范圍廣，其沉淀蛋白質(zhì)的效果更好；同時(shí)，直接使用茶葉水可以避免商品茶多酚所含分散劑對(duì)酶制品純度的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)例1取新鮮獼猴桃果汁1L，將配制的0.3％茶多酚水溶液800ml(無(wú)錫綠寶公司生產(chǎn)的粉未狀茶多酚)與其混合，攪拌均勻，調(diào)整混合液的PH值至5.0，在室溫下靜置沉淀4小時(shí)以上，絮狀凝聚物沉淀于容器底部。棄去上清液，將下層稀酶糊轉(zhuǎn)入布氏漏斗中進(jìn)行抽濾，收集漏斗中的沉淀物進(jìn)行真空干燥，經(jīng)球磨機(jī)粉碎并過篩，得到獼猴桃蛋白酶粗酶干制品14.6克，其粗酶收率為1.46％。實(shí)例2取新鮮獼猴桃果汁1L與自制茶葉水1L(用陜青茶22g，加入1500ml水，煮沸3分鐘，保溫浸泡20分鐘后過濾，得到茶多酚含量約0.15％的茶葉水。通常茶多酚的溶出率為10％左右)混合，攪拌均勻，調(diào)整混合液的pH值至4.5，在室溫下靜置沉淀2小時(shí)以上，棄掉上清液，將下層稀酶糊進(jìn)行抽濾，收集沉淀物進(jìn)行真空干燥，經(jīng)球磨機(jī)粉碎并過篩，得到獼猴桃蛋白酶粗酶干制品15.2g，粗酶收率為1.52％。實(shí)例3取新鮮獼猴桃果汁2L，加入食鹽(NaCl)200g，攪拌溶解后，可在室溫下保存1-3天。取實(shí)例2自制的茶葉水1.8L，與獼猴桃果汁混合均勻，調(diào)整pH值至4.0，室溫下靜置沉淀3小時(shí)，棄去上清液，將底部稀酶糊減壓抽濾，得到獼猴桃蛋白酶粗酶濕品62.8g。取其中31.4g進(jìn)行真空冷凍干燥，然后進(jìn)行球磨粉碎并過篩，得到獼猴桃蛋白酶粗酶干制品17.6g，其粗酶收率為1.76％；將剩余的31.4g粗酶濕品，進(jìn)行乙醇提純，加入800ml的80％(V/V)的乙醇溶液使粗酶溶解，攪拌均勻，轉(zhuǎn)入離心管在4000r/min速度下離心15分鐘，移去上清液，收集底部的沉淀物，進(jìn)行真空冷凍干燥，用研缽磨碎并過篩，得到獼猴桃蛋白酶純酶干制品10.7g，其純酶的收率為1.07％。權(quán)利要求1.一種提取獼猴桃蛋白酶的方法，是采用絡(luò)合沉淀法，方法步驟包括有果汁與沉淀劑的混合，靜置沉淀，固液分離，干燥粉碎；其特征在于所使用的沉淀劑為含有茶多酚的水溶液，其茶多酚含量的重量比為0.1～0.5％，其與果汁混合的體積比為0.8～1.1∶1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有茶多酚的水溶液是采用商品茶多酚配制的0.2～0.5％的水溶液，其與果汁混合的體積比為0.8～1∶1；其靜置沉淀是在室溫條件下靜置不低于4小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有茶多酚的水溶液是采用茶葉制成的茶多酚含量為0.1～0.4％的茶葉水，其與果汁混合的體積比為0.9～1.1∶1；其靜置沉淀是在室溫條件下靜置不低于2小時(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在靜置沉淀前調(diào)整混合液的pH至3.0～5.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在果汁與沉淀劑混合前允許果汁中含有8～12％重量體積比的食鹽。全文摘要一種提取獼猴桃蛋白酶的方法，本發(fā)明采用含有0.1－0.5％的茶多酚水溶液為沉淀劑，其與果汁混合的體積比為0.8－1.1∶1。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有收率高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、周期短、成本低、無(wú)毒害且安全的優(yōu)點(diǎn)，適合于獼猴桃蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N9/50GK1594559SQ20041002624公開日2005年3月16日申請(qǐng)日期2004年6月18日優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日發(fā)明者左玉萍,馬齊申請(qǐng)人:陜西省動(dòng)物研究所