一種提取菠蘿蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物酶的提取方法，特別是提取菠蘿蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 菠蘿蛋白酶（bromelain，EC3. 4. 22.33 )是存在于菠蘿類植株(包括果、莖、柄和 葉片)、劍麻葉中的蛋白水解酶，有多個(gè)同工酶，其活性中心含有巰基（一 SH)，所以屬巰基蛋 白酶。菠蘿蛋白酶廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、飼料、皮革等行業(yè)。它能分解纖維蛋 白、血紅蛋白等蛋白質(zhì)，能在副作用較小的情況下使纖維蛋白和血凝塊溶解，進(jìn)而改善體液 循環(huán)，增加組織通透性，導(dǎo)致炎癥、水腫消退；與抗生素、化療藥物合用可促進(jìn)藥物對(duì)病灶的 滲透和擴(kuò)散，從而增強(qiáng)療效。
[0003] 蛋白質(zhì)的提取純化方法主要有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、單寧（鞣酸）沉 淀、離子交換層析、親和層析、超濾濃縮等方法。菠蘿蛋白酶的生產(chǎn)工藝主要有硫酸銨沉淀 法、單寧沉淀法、超濾法等，這些方法都有其缺點(diǎn)：硫酸銨沉淀法需要使用大量的硫酸銨，環(huán) 境污染嚴(yán)重；單寧沉淀法所得的酶制劑難溶于水，酶活力低；超濾法所需設(shè)備投資大，菠蘿 汁超濾濃縮過(guò)程中黏度逐漸加大，超濾膜極易堵塞，因此生產(chǎn)周期長(zhǎng)，提取收率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種提取菠蘿蛋白酶 的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種提取菠蘿蛋白酶的方法，包括以下步驟： (1)去雜質(zhì)菠蘿汁的制備：新鮮菠蘿皮或菠蘿莖葉原料清洗，洗凈附在其表面的泥土 等雜質(zhì)，榨汁，菠蘿汁經(jīng)60?100目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心分離后，取上層清液。
[0006] (2)透析：利用超濾設(shè)備的超濾功能，將經(jīng)步驟（1)處理的菠蘿汁中的金屬離子等 小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低95%以上；所述的透析是采用超濾裝置；超濾裝置由 一個(gè)泵和超濾膜組成，所用超濾膜：截留分子量為20KD的內(nèi)壓式中空纖維超濾膜。
[0007] (3)酶的沉淀：將經(jīng)步驟（2)處理的電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3?5,并冷卻至 2?8°C，靜置2?3小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉淀。
[0008] (4)離心收集酶膏：將經(jīng)過(guò)酶沉淀的菠蘿汁離心分離，獲得酶膏。
[0009] (5)冷凍干燥：將酶膏冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶成品。
[0010] 步驟⑴及步驟⑷中所述的離心是采用高速碟片離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速優(yōu)選為 5000?8000轉(zhuǎn)/分鐘離心。
[0011] 步驟（3)中所述的用于調(diào)節(jié)菠蘿汁的pH的酸溶液是鹽酸或醋酸，酶沉淀的最佳溫 度為1_5°C。
[0012] 步驟（4)中酶膏冷凍干燥預(yù)凍溫度為-20?-30°C。
[0013] 本發(fā)明使用提取菠蘿蛋白酶的原料也可以使用劍麻葉，特別是生產(chǎn)劍麻中的劍麻 液，也可以大量提取菠蘿蛋白酶。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是： 本發(fā)明利用超濾設(shè)備的超濾功能，將菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，降 低菠蘿蛋白酶的溶解性，然后再調(diào)節(jié)pH、降溫，達(dá)到沉淀菠蘿蛋白酶的目的。由于未加入任 何沉淀劑，所以所得的菠蘿酶的污染少、純度高，設(shè)備要求低，外加雜質(zhì)少、酶活力高、提取 工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好，易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
[0016] 圖中看到，菠蘿皮或菠蘿莖葉經(jīng)過(guò)清洗、壓榨、過(guò)濾、離心，得到菠蘿汁，然后透析、 調(diào)節(jié)pH、酶沉淀、離心收集、冷凍干燥，得到產(chǎn)品。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 夕卜，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0018] 實(shí)施例1 清洗新鮮菠蘿皮，洗凈附在其表面的泥土等雜質(zhì)，然后壓榨，得到蛋白酶活力為3010 活力單位/毫升的菠蘿汁；用80目濾網(wǎng)過(guò)濾菠蘿汁，去除其中的粗雜質(zhì)，用高速碟片離心機(jī) 將濾液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中的細(xì)雜質(zhì)，得到雜質(zhì)少的透明菠蘿汁。利用超濾設(shè)備 的透析功能，將雜質(zhì)少的菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低98%。 將電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3. 8,冷卻至1-2°C，靜置3小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉 淀。用高速碟片離心機(jī)7300轉(zhuǎn)/分鐘離心收集含菠蘿蛋白酶的絮狀沉淀，得到酶膏；將酶 膏預(yù)凍至_25°C，冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶成品，酶活力達(dá)到118萬(wàn)單位/克。
[0019] 實(shí)施例2 將新鮮菠蘿皮洗凈附在其表面的泥土等雜質(zhì)，然后壓榨，得到蛋白酶活力約為3030活 力單位/毫升的菠蘿汁；用80目濾網(wǎng)過(guò)濾菠蘿汁，去除其中的粗雜質(zhì)，用高速碟片離心機(jī)將 濾液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中的細(xì)雜質(zhì)，得到雜質(zhì)少的透明菠蘿汁。利用超濾設(shè)備 的透析功能，將雜質(zhì)少的菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低96%。 將電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3. 5,冷卻至3-4°C，靜置2. 5小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀 沉淀。用高速碟片離心機(jī)7300轉(zhuǎn)/分鐘離心收集含菠蘿蛋白酶的絮狀沉淀，得到酶膏；將 酶膏預(yù)凍至_25°C，冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶成品，酶活力達(dá)到110萬(wàn)單位/克。
[0020] 實(shí)施例3 清洗新鮮菠蘿皮，洗凈附在其表面的泥土等雜質(zhì)，然后壓榨，得到蛋白酶活力為3500 活力單位/毫升的菠蘿汁；用80目濾網(wǎng)過(guò)濾菠蘿汁，去除其中的粗雜質(zhì)，用高速碟片離心機(jī) 將濾液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中的細(xì)雜質(zhì)，得到雜質(zhì)少的透明菠蘿汁。利用超濾設(shè) 備的透析功能，將雜質(zhì)少的菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低約 60%，用碟片離心機(jī)將菠蘿液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中因電導(dǎo)率降低而析出的色素 蛋白等雜質(zhì)；然后繼續(xù)透析該菠蘿液，使電導(dǎo)率降低98%，將電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至 3. 8,冷卻至3-5°C，靜置3小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉淀。用高速碟片離心機(jī)7300轉(zhuǎn) /分鐘離心收集含菠蘿蛋白酶的絮狀沉淀，得到酶膏；將酶膏預(yù)凍至-25°C，冷凍干燥，得到 干燥的菠蘿蛋白酶成品，酶活力達(dá)到135萬(wàn)單位/克。
[0021] 實(shí)施例4 新鮮菠蘿莖和葉清洗，洗凈附在其表面的泥土等雜質(zhì)，然后壓榨，得到蛋白酶活力為 3010活力單位/毫升的菠蘿葉汁；用80目濾網(wǎng)過(guò)濾菠蘿葉汁，去除其中的粗雜質(zhì)，用高速 碟片離心機(jī)將濾液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中的細(xì)雜質(zhì)，得到雜質(zhì)少的透明菠蘿汁。利 用超濾設(shè)備的透析功能，將雜質(zhì)少的菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo) 率降低98%。將電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3. 8,冷卻至1-2°C，靜置3小時(shí)，使菠蘿蛋白 酶產(chǎn)生絮狀沉淀。用高速碟片離心機(jī)7300轉(zhuǎn)/分鐘離心收集含菠蘿蛋白酶的絮狀沉淀，得 到酶膏；將酶膏預(yù)凍至_25°C，冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶成品，酶活力達(dá)到118萬(wàn)單 位/克。
[0022] 實(shí)施例5 將劍麻廠生產(chǎn)過(guò)程的劍麻葉，洗凈附在其表面的泥土等雜質(zhì)，然后壓榨，取得劍麻。還 得到劍麻液及劍麻渣，劍麻液為蛋白酶活力約為2800活力單位/毫升的劍麻液；用80目濾 網(wǎng)過(guò)劍麻液，再用高速碟片離心機(jī)將濾液離心（7300轉(zhuǎn)/分鐘)，去除其中的細(xì)雜質(zhì)，得到雜 質(zhì)少的透明劍麻液。利用超濾設(shè)備的透析功能，將雜質(zhì)少的劍麻液中的金屬離子等小分子 物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低96%。將電導(dǎo)率低的劍麻液的pH調(diào)至3. 5,冷卻至3-4°C，靜 置2. 5小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉淀。用高速碟片離心機(jī)7300轉(zhuǎn)/分鐘離心收集含菠 蘿蛋白酶的絮狀沉淀，得到酶膏；將酶膏預(yù)凍至_25°C，冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶 成品，酶活力達(dá)到110萬(wàn)單位/克。
[0023] 用上述方法提取的菠蘿蛋白酶具有酶活力高、雜質(zhì)少的特點(diǎn)，提取工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn) 成本低、設(shè)備投入少。
[0024] 上述三個(gè)實(shí)施例所得到的菠蘿蛋白酶比傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀法、單寧沉淀法的酶活 力比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提取菠蘿蛋白酶的方法，包括以下步驟： (1) 去雜質(zhì)菠蘿汁的制備：將新鮮菠蘿皮或菠蘿莖葉原料清洗，榨汁，菠蘿汁經(jīng)60? 100目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心分離后，取上清液； (2) 透析：利用超濾設(shè)備的超濾功能，將經(jīng)步驟（1)處理的菠蘿汁中的金屬離子等小分 子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低95%以上； (3) 酶的沉淀：將經(jīng)步驟（2)處理的電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3?5,并冷卻至2? 8°C，靜置2?3小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉淀； (4) 離心收集酶膏：將經(jīng)過(guò)酶沉淀的菠蘿汁離心分離，獲得酶膏； (5) 冷凍干燥：將酶膏冷凍干燥，得到干燥的菠蘿蛋白酶成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟（1)及步驟（4)中 所述的離心是采用高速碟片離心機(jī)離心。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的透析 是采用超濾裝置；超濾裝置由一個(gè)泵和超濾膜組成，所用超濾膜：截留分子量為20KD的內(nèi) 壓式中空纖維超濾膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟（1)及步驟 (4)中所述的離心機(jī)轉(zhuǎn)速為5000?8000轉(zhuǎn)/分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟（3)中所述的調(diào)菠 蘿汁的pH所用的酸是鹽酸或醋酸，酶沉淀的溫度為1_5°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，所述的原料還包括劍 麻葉。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提取菠蘿蛋白酶的方法，首先將新鮮菠蘿皮或菠蘿莖葉洗凈,然后經(jīng)過(guò)榨汁、過(guò)濾、離心等處理，獲得雜質(zhì)少的菠蘿汁，經(jīng)過(guò)超濾，將菠蘿汁中的金屬離子等小分子物質(zhì)透析去除，使電導(dǎo)率降低95％以上，然后將所得的電導(dǎo)率低的菠蘿汁的pH調(diào)至3～5，并將菠蘿汁冷卻至4～8℃，靜置2～3小時(shí)，使菠蘿蛋白酶產(chǎn)生絮狀沉淀。通過(guò)5000～8000轉(zhuǎn)/分鐘離心條件收集絮狀沉淀，得到酶膏。最后將酶膏冷凍干燥，獲得干燥的菠蘿蛋白酶。本發(fā)明提取的菠蘿蛋白酶，不含任何添加的雜質(zhì)，具有酶活力高、雜質(zhì)少，提取工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，回收率高，設(shè)備投入少，易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。
【IPC分類】C12N9-50
【公開(kāi)號(hào)】CN104611316
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510079707
【發(fā)明人】黎穎, 林葵, 謝慶武, 周寧, 劉守廷
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日