以Gemini表面活性劑反膠束從菠蘿皮中萃取分離菠蘿蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程中反膠束萃取技術(shù)領(lǐng)域，也涉及菠蘿皮的回收利用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，廣泛存在于菠蘿果實(shí)、芽、葉、莖中，它在生物化 工中用于干酪、明膠、水解蛋白的生產(chǎn)，在食品工業(yè)中作為一種食品添加劑，使肉質(zhì)嫩化、啤 酒澄清；在醫(yī)藥工業(yè)中，可以治療水腫及多種炎癥，對正常組織無害，不影響植皮，適用于中 小面積深度燒傷的治療。
[0003]目前，用于工業(yè)化生產(chǎn)、提取菠蘿蛋白酶的方法主要有三種：高嶺土吸附法、單寧 沉淀法、超濾濃縮法；但這三種方法不僅生產(chǎn)成本高昂、易造成污染環(huán)境、生產(chǎn)工藝和操作 復(fù)雜，而且所得酶活性也不足以滿足醫(yī)藥級別及食品中對酶活性要求較高的應(yīng)用。且相關(guān) 研究多集中于從菠蘿莖和果肉中提取菠蘿蛋白酶。
[0004] 我國雖然菠蘿資源豐富，年產(chǎn)量在140萬噸以上，而在用于加工菠蘿罐頭、果汁 等食品上，采用的完全是菠蘿果肉部分，剩下的菠蘿皮等部分就被作為廢棄物而扔掉，這樣 不僅造成了資源的浪費(fèi)，而且也污染環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提出一種充分利用菠蘿皮廢棄物，以Gemini表面活性劑反膠束 進(jìn)行高效菠蘿蛋白酶提取的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟： 1) 制備菠蘿蛋白酶粗提液：將干凈的菠蘿皮與pH值為5. 5?6. 5的磷酸緩沖溶液混 合粉粹后，經(jīng)渣汁分離，取得粗酶液； 2) 前萃取：將NaCl濃度為0. 05?0. 2M、pH值為8?10. 5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖 液與粗酶液混合后再與反膠束以等體積比混合振蕩后，經(jīng)離心分離取上層有機(jī)相；其中，反 膠束由季銨鹽Gemini表面活性劑和正己烷、正己醇和水混合組成；所述季銨鹽Gemini表面 活性劑在反膠束中的濃度為0. 01g/mL?0. 03g/mL; 3) 后萃?。簩Br濃度為0. 25?1M、pH值為3. 8?4. 2的HAC-NaAC緩沖液與有機(jī) 相等體積比混合振蕩后，離心分離取下層水相； 4) 冷凍干燥：將下層水相在壓強(qiáng)為50±2Pa、溫度為-60°C?_55°C下冷凍干燥，得到純 菠蘿蛋白酶。
[0007] 季銨鹽Gemini表面活性劑以Cm-s_Cm表示，結(jié)構(gòu)式如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以Gemini表面活性劑反膠束從菠蘿皮中萃取分離菠蘿蛋白酶的方法，包括將干凈 的菠蘿皮與pH值為5. 5?6. 5的磷酸緩沖溶液混合粉粹后，經(jīng)渣汁分離，取得粗酶液；將粗 酶液與甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液和反膠束混合進(jìn)行前萃取，再將前萃取取得的上層有機(jī)相 與HAC-NaAC緩沖液混合進(jìn)行后萃取，最后將后萃取取得的下層水相冷凍干燥，得到純菠蘿 蛋白酶；其特征在于： 所述反膠束由季銨鹽Gemini表面活性劑和正己烷、正己醇、水混合組成；所述季銨鹽 Gemini表面活性劑在反膠束中的濃度為0. Olg/mL?0. 03g/mL ; 所述前萃取是將NaCl濃度為0. 05?0. 2M、pH值為8?10. 5的甘氨酸-氫氧化鈉緩 沖液與粗酶液混合后再與反膠束以等體積比混合振蕩后，經(jīng)離心分離取上層有機(jī)相； 所述后萃取是將KBr濃度為0. 25?1M、pH值為3. 8?4. 2的HAC-NaAC緩沖液與有 機(jī)相等體積比混合振蕩后，離心分離取下層水相； 所述冷凍干燥是將下層水相在壓強(qiáng)為50±2Pa、溫度為-60°C?_55°C下冷凍干燥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：在反膠束中，正己烷和正己醇的體積比為 6?9. 5:1，水與季銨鹽Gemini表面活性劑的摩爾比為10?20:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于：所述季銨鹽Gemini表面活性劑在反膠 束中的濃度為〇. 〇25g/mL?0. 03g/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述前萃取中，所述甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 和粗酶液的混合體積比為22?25:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于前萃取時(shí)，所述甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中 NaCl的濃度為0. 1M。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于后萃取時(shí)，所述HAC-NaAC緩沖液中KBr的濃 度為0? 25?0? 5M。
【專利摘要】以Gemini表面活性劑反膠束從菠蘿皮中萃取分離菠蘿蛋白酶的方法，屬于生物工程中反膠束萃取技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明采用具有季銨鹽Gemini表面活性劑的反膠束對菠蘿皮中的菠蘿蛋白酶進(jìn)行萃取，萃取過程中僅需少量的表面活性劑，通過控制前萃液的pH值既能使菠蘿皮粗提液中的菠蘿蛋白酶轉(zhuǎn)移至反膠束，又能減少表面活性劑對菠蘿蛋白酶的污染；通過調(diào)節(jié)正己烷和正己醇的比例，還能提高菠蘿蛋白酶的活性。本發(fā)明操作過程簡單，菠蘿蛋白酶活性損失少，酶活性回收率較高，萃取后所得菠蘿蛋白酶的活性回收率可達(dá)163%，純化倍數(shù)可達(dá)到4。
【IPC分類】C12N9-50
【公開號】CN104531642
【申請?zhí)枴緾N201510028564
【發(fā)明人】郭霞, 萬靜, 繆枝彤
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月21日