一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括：該方法主要根據(jù)核酸反應(yīng)熱力學最近鄰模型，計算DNA以及RNA反應(yīng)的熱力學參數(shù)，從理論上闡明探針特異性的理論極限，同時計算出不同單堿基突變的特異性差異與熱力學性質(zhì)，并在計算機上模擬預測出不同的核酸反應(yīng)結(jié)果；設(shè)計出具有理論優(yōu)化過的具有高特異性的核酸探針。本發(fā)明基于熱力學計算設(shè)計出的探針特異性達到了理論上最優(yōu)結(jié)果；穩(wěn)定性好，保存時間長；檢測過程及其簡單；且檢測時間短；檢測過程不受環(huán)境溫度影響，同時不受溶液中鹽離子濃度影響；該方法能夠滿足臨床需求，在醫(yī)學方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】-種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸雜交領(lǐng)域，特別設(shè)及一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸是一切生物細胞的基本成分，在生物體內(nèi)編碼和調(diào)節(jié)遺傳信息的表達。對生 物體的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等重大生命現(xiàn)象起著重要作用。核酸的生物重要性促 使核酸探針W及引物在生物技術(shù)如：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR),生物巧片（microarray)及巧光 原位雜交等方面的具有廣泛的應(yīng)用。
[0003] 核酸能夠用于生物學，生物技術(shù)W及納米生物技術(shù)方面的關(guān)鍵屬性就是其具有可 預測性W及特異的Watson -化ick雜交互補特性。然而除非在烙解溫度附近，許多正確堿 基配對的熱力學增加會覆蓋一些錯配的熱力學誤差，而且較長核酸鏈之間的雜交也會產(chǎn)生 非特異。
[0004] 高溫或化學變性通常被用于提高雜交的特異性。在高溫或化學變性條件下，標準 的雜交自由能較弱，基于互補序列之間的結(jié)合力，略微不同的序列就可W被辨別。然而，在 多祀標雜交系統(tǒng)中許多不同的雜交反應(yīng)必須同時進行，該個時候利用某一烙解溫度附近的 雜交來提高特異性顯然是不可行的。此外，烙解溫度取決于雜交溶液中鹽的濃度、核酸濃 度等一些因素，很難W此預測雜交的精確性。同樣，化學變性也削弱了沃森-克里克堿基配 對原則，一樣具有潛在的局限性。
[0005] 一般來說一個理想的核酸探針應(yīng)該滿足=個條件：高親和力（能夠牢固地和互補 祀標結(jié)合）、高選擇性（與錯配序列不結(jié)合）W及高穩(wěn)定性（環(huán)境因素不容易影響，不同實 驗室檢測結(jié)果具有一致性），而該在實際的實踐中很難全面滿足。
[0006] 根據(jù)核酸特異性雜交在生物技術(shù)等方面的重要作用W及目前高特異性雜交的方 法仍存在一些缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方 法，該方法針對傳統(tǒng)高特異性雜交檢測中存在的問題和不足，采用熱力學理論及鏈置換探 針高特異核酸雜交條件的優(yōu)化，提出一種衡量高特異性雜交受溫度影響程度的參數(shù)與計算 方法，為核酸的高特異性雜交W及單堿基突變特異性的檢測提供有效的方法學依據(jù)。
[000引本發(fā)明的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括：
[0009] (1)針對預檢測的目的祀標X，設(shè)計多個結(jié)構(gòu)具有差別并與目的祀標相匹配的鏈 置換探針PC，與目的祀標序列的反應(yīng)作為反應(yīng)1，反應(yīng)產(chǎn)物為P和XC，與具有單堿基突變的 祀標S的反應(yīng)作為反應(yīng)2,反應(yīng)產(chǎn)物為P和SC ;分別計算反應(yīng)1和反應(yīng)2中每一種核酸分子 的標準吉布斯自由能A護、標準滴A 5°^及標準洽A ，并根據(jù)此計算出反應(yīng)1和反應(yīng)2的 標準吉布斯自由能變化量A t護，標準滴變化量A ,5°^及標準洽變化量A 結(jié)合各反應(yīng) 物的初始濃度，最終分別計算出反應(yīng)1與反應(yīng)2的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量；
[0010] (2)根據(jù)步驟（1)的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量，選出傾向于反應(yīng)1的探針；最后合成選出的探 針，實現(xiàn)目的祀標高特異性檢測。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] (1)對核酸序列的高特異性檢測：首先依據(jù)核酸鏈置換探針的反應(yīng)方程式，針對 該核酸序列計算出幾種比較合理的探針設(shè)計方式。然后根據(jù)設(shè)計好的探針與祀標的實際反 應(yīng)結(jié)果選出特異性最優(yōu)的探針設(shè)計。從而達到對核酸序列的高特異性檢測的目的。
[0013] (2)對單堿基突變的高特異性檢測；首先依據(jù)核酸鏈置換探針的反應(yīng)方程式，針 對該單堿基突變計算出幾種比較合理的探針設(shè)計方式。然后根據(jù)單堿基突變本身的熱力學 參數(shù)計算出該突變的溫度特性，選擇出檢測的最適合的溫度范圍。最后根據(jù)實際的探針與 祀標反應(yīng)結(jié)果，選擇出最優(yōu)化的探針設(shè)計和反應(yīng)溫度。從而達到高特異性檢測單堿基突變 的目的。
[0014] 技術(shù)方案具體為；
[0015] (1)對核酸序列的高特異性檢測：
[0016] 核酸鏈置換反應(yīng)方程式為：
[0017] X+PC 一 P巧C 1
[0018] S+PC 一 P+SC 2
[0019] 其中X代表目的祀標，PC代表鏈置換探針，P和C分別代表鏈置換探針的兩條核酸 鏈。X與PC經(jīng)過反應(yīng)，X置換出探針PC中的P鏈，從而形成反應(yīng)產(chǎn)物XC與被釋放的P鏈， 經(jīng)過一定時間后，反應(yīng)達到平衡，稱該反應(yīng)為反應(yīng)1。W S代表具有單堿基突變的祀標，貝U S+PC - SC+P代表突變的祀標與探針PC的反應(yīng)方程式，稱該反應(yīng)為反應(yīng)2,反應(yīng)過程與前述 相仿。
[0020] 第一步：根據(jù)預檢測的核酸序列，設(shè)計出與之相匹配的鏈置換探針。
[0021] 計算出參與"反應(yīng)1"和"反應(yīng)2"中每一種核酸分子的標準吉布斯自由能A護，標 準滴AS"化及標準洽AH°。并根據(jù)此計算出，該反應(yīng)1和反應(yīng)2的標準吉布斯自由能變化 量Af護，標準滴變化量AtS°W及標準洽變化量A ftf，對已反應(yīng)1，其計算公式如下：
[0022] ArG°(l) = AG°aC) + AG°(W-AG°a)-AG°(PC)
[0023] Aftfa) = AH° 狂C) + AH° (巧-AH°〇〇-AH°(PC)
[0024] ArS°(l) = AS° 狂C) + AS° (巧-AS°〇〇-AS°(PC)
[002引其中A貨(1)代表"反應(yīng)1"的標準自由吉布斯能變化量，Aftfa)為"反應(yīng)1"的 標準洽變化量，AtS°(l)為"反應(yīng)1"的標準滴變化量。A護狂C)、Atf狂C)和AS°aC)分 別為分子XC的標準吉布斯自由能、標準洽和標準滴。其他的參與反應(yīng)分子的標準吉布斯自 由能，標準洽，標準滴表示方法類似。
[0026] 對于"反應(yīng)2"，其標準吉布斯自由能變化量A t護(2)、標準洽變化量A (2)和標 準滴變化量A (2)的計算方法與"反應(yīng)1"的計算方法相同。
[0027] 在得到各個反應(yīng)方程式的標準吉布斯自由能變化量Af護、標準洽變化量和 標準滴變化量之后?？蒞進一步計算出"反應(yīng)1"和"反應(yīng)2"的雜交產(chǎn)量：
[002引

【權(quán)利要求】
1. 一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括： (1) 針對預檢測的目的靶標X，設(shè)計多個結(jié)構(gòu)具有差別并與目的靶標相匹配的鏈置換 探針PC，與目的靶標序列的反應(yīng)作為反應(yīng)1，反應(yīng)產(chǎn)物為P和XC，與具有單堿基突變的靶標 S的反應(yīng)作為反應(yīng)2,反應(yīng)產(chǎn)物為P和SC ;分別計算反應(yīng)1和反應(yīng)2中每一種核酸分子的標 準吉布斯自由能AG°、標準熵AS°以及標準焓ΛΗ°，并根據(jù)此計算出反應(yīng)1和反應(yīng)2的標 準吉布斯自由能變化量AA ci,標準熵變化量Ajtl以及標準焓變化量△ 結(jié)合各反應(yīng)物 的初始濃度，最終分別計算出反應(yīng)1與反應(yīng)2的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量； (2) 根據(jù)步驟（1)的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量，選出傾向于反應(yīng)1的探針；最后合成選出的探針， 實現(xiàn)目的靶標高特異性檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟⑴中的反應(yīng)1的標準吉布斯自由能AG°、標準熵AS°以及標準焓ΛΗ°的計 算公式為： ArG0(I) = Δ G0 (XC) + Δ G0 (P) - Δ G0 (X) - Δ G0 (PC)； ArH0(I) = Δ H0 (XC) + Δ H0 (P) - Δ H0 (X) - Δ H0 (PC)； ArS0(I) = Δ Sci(XC)+ Δ Sci(P)-A Sci(X)-A Sci(PC)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量的計算公式為：
其中R為理想氣體常數(shù)，T為反應(yīng)溫度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的目的靶標為已知單堿基突變，通過公式計算出單堿基突變的溫度特 性，確定檢測特異性最優(yōu)的溫度范圍；通過溶液中鹽離子濃度變化影響公式，選出受鹽離子 濃度變化影響最小的鏈置換探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述溫度特性計算公式為：Δ ΛΗ = ArHtl⑵_ArH°(l) ; Λ AS = ArStl⑵-ArStl⑴；
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于熱力學優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述鹽離子濃度變化計算公式為：AS°= AS°[lMNaCl]+0. 368XN/2Xln[Na+]。
【文檔編號】C12Q1/68GK104513855SQ201410707763
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】毛紅菊, 武振華, 白亞楠, 金慶輝, 趙建龍 申請人:中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所