5’-鳥苷酸的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及5’-鳥苷酸的生產(chǎn)方法。使用微生物高效率地生產(chǎn)5’-鳥苷酸(GMP)。使XMP與經(jīng)過修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾而增大了GMP合成酶的活性的細菌反應來得到GMP。
【專利說明】5' -鳥苷酸的生產(chǎn)方法
[0001] 此案是申請日為2010年08月10日、中國申請?zhí)枮?01010250541. 1、發(fā)明名稱為 "5' -鳥苷酸的生產(chǎn)方法"的發(fā)明申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及5' -鳥苷酸的生產(chǎn)方法以及在5' -鳥苷酸的生產(chǎn)中使用的新微生物。 5' -鳥苷酸作為調味料、醫(yī)藥以及調味料、醫(yī)藥的原料是有用的。

【背景技術】
[0003] 作為5' -鳥苷酸（鳥苷-5' - 一磷酸，以下也稱"GMP"）的工業(yè)制備方法，采用發(fā) 酵法生產(chǎn)鳥苷，再采用酶法將所得的鳥苷磷酸化，從而得到5' -鳥苷酸的方法（專利文獻 1 ?4) 〇
[0004] 此外，還已知下述生產(chǎn)方法：將增大了 GMP合成酶活性的屬于埃希氏菌屬的微生 物與下述產(chǎn)氨短桿菌在包含XMP和氨氣或谷氨酰胺的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，高效率地將XMP 轉化為GMP，并使培養(yǎng)液中生成并蓄積GMP，其中，所述產(chǎn)氨短桿菌的腺苷-三磷酸（ATP)生 物合成（以下也稱"ATP再生"）活性高，所述腺苷-三磷酸（ATP)是代謝葡萄糖來從5'-黃 苷酸（XMP)合成GMP的反應所必需的（非專利文獻1)。
[0005] 另一方面，提出了利用發(fā)酵法來生產(chǎn)GMP的方法。例如，專利文獻5中公開了一種 GMP的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法中培養(yǎng)具有腺嘌呤營養(yǎng)缺陷性、顯示德夸菌素（decoyinine) 或甲硫氨酸亞砜抗性、且具有GMP生產(chǎn)能力的芽孢桿菌屬的突變株，并收集培養(yǎng)基中生成 蓄積的GMP。此外，專利文獻6公開了一種GMP的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法中培養(yǎng)使具有肌苷 酸（肌苷酸-5' - 一磷酸，以下也稱"IMP"）生產(chǎn)能力的埃希氏菌屬細菌的2種5' -核苷酸 酶基因缺失、以及MP脫氫酶和GMP合成酶基因增強而得到的菌株，并收集培養(yǎng)基中生成并 蓄積的GMP。但是，一般而言，GMP的直接發(fā)酵收率不充分，與前述酶法相比較未必實用。
[0006] 如前述，針對5'-鳥苷酸的生產(chǎn)進行了各種研宄，并已有數(shù)個成功的實例。但是， 對于核苷酸分解酶還有許多不明之處，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)種核苷酸分解酶，已知通過使它們缺 失能夠提高收率（專利文獻6、7)，但完全抑制其分解是困難的，這是一個大問題。
[0007] 現(xiàn)有技術文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1特開平07-231793號公報
[0010] 專利文獻2特開平10-201481號公報
[0011] 專利文獻3國際公開第96/37603號小冊子
[0012] 專利文獻4特開2001-245676號公報
[0013] 專利文獻5特公昭56-12438號公報
[0014] 專利文獻6特開2002-355087號公報
[0015] 專利文獻7國際公開第2006/078132號小冊子
[0016] 非專利文獻
[0017] 非專利文獻 ITatsuro Fujio 等，Biosci. Biotech. Biochem.，1997 年，第 61 卷，5 號，840-845 頁


【發(fā)明內容】

[0018] 發(fā)明所要解決的問題
[0019] 本發(fā)明的課題是創(chuàng)造新微生物，所述新微生物能夠在使用微生物從XMP生產(chǎn)GMP 的方法中使用、且能夠高效率地將XMP轉化為GMP。
[0020] 解決問題的方法
[0021] 本發(fā)明人等為解決上述問題進行了深入研宄，結果發(fā)現(xiàn)：通過利用經(jīng)過修飾從而 使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶活性的埃希氏菌屬微 生物，能夠高效率地將XMP轉化為GMP，從而完成了本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明的一類實施方式提供5' -鳥苷酸的生產(chǎn)方法，該方法中使黃苷酸作用于經(jīng) 過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且還經(jīng)過修飾從而增大了 5' -鳥苷酸合成 酶的活性的、具有將黃苷酸轉化為5' -鳥苷酸的能力的微生物，來生成5' -鳥苷酸，并收集 5' -鳥苷酸。
[0023] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述微生物經(jīng)過修飾從而使得nagD 基因無法正常發(fā)揮功能、而且還經(jīng)過修飾而增加了 guaA基因的表達，從而增大了 5' -鳥苷 酸合成酶的活性。
[0024] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述guaA基因編碼下述（A)或（B) 的蛋白質。
[0025] ㈧具有SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的蛋白質。
[0026] (B)下述蛋白質，所述蛋白質具有在SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列中包含1個 或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5' -鳥苷酸合成 酶活性。
[0027] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得 ushA基因和aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功能。
[0028] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述微生物是屬于腸桿菌科的細菌、 芽孢桿菌屬細菌或棒狀桿菌型細菌。
[0029] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述微生物是埃希氏菌屬細菌。
[0030] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述方法，其中，所述微生物是大腸桿菌。
[0031] 本發(fā)明的其它實施方式提供經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、而 且還經(jīng)過修飾而增加了 guaA基因的表達從而增大了 5'-鳥苷酸合成酶的活性的、具有將黃 苷酸轉化為5'-鳥苷酸的能力的微生物（但是，不包括除了經(jīng)過了上述修飾以外，還經(jīng)過修 飾從而通過增加 guaB基因的表達增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物）。
[0032] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述微生物，該微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自ushA 基因和aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功能。
[0033] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是屬于腸桿菌科的細 菌、芽孢桿菌屬細菌或棒狀桿菌型細菌。
[0034] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是埃希氏菌屬細菌。
[0035] 本發(fā)明的其它實施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是大腸桿菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖I : (A)顯示使JM109/pSTV29-Ptac-guaA株與XMP反應時的XMP和GMP的濃度 變化的圖表；(B)顯示使JM109 Δ nagD/pSTV29-Ptac-guaA株與XMP反應時的XMP和GMP的 濃度變化的圖表。
[0037] 圖 2 :⑷顯示使 JM 109 Δ ushA/pSTV29-Ptac-guaA 株與 XMP 反應時的 XMP 和 GMP 的濃度變化的圖表；(B)顯示JM109AushA Δ nagD/pSTV29-Ptac-guaA株與XMP反應時的XMP 和GMP的濃度變化的圖表。
[0038] 圖 3 :⑷顯示使 JM 109 Δ ushA Δ aphA/pSTV29-Ptac_guaA 株與 XMP 反應時的 XMP 和 GMP 的濃度變化的圖表；(B)顯示使 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD/pSTV29-Ptac-guaA 株與 XMP反應時的XMP和GMP的濃度變化的圖表。
[0039] 發(fā)明的【具體實施方式】
[0040] 以下，對本發(fā)明進行具體說明。
[0041] < I >本發(fā)明的方法中使用的微生物
[0042] 本發(fā)明的方法中使用的微生物是經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能 且還經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶活性的、具有將XMP轉化為GMP的能力的微生物。
[0043] 作為微生物，可以列舉出屬于腸桿菌科的細菌、棒狀桿菌型細菌（Coryneform bacterium)、芽抱桿菌屬（Bacillus)細菌等。
[0044] 作為屬于腸桿菌科的細菌，可以列舉出：埃希氏菌屬（Escherichia)細菌、泛菌屬 (Pantoea)細菌、腸桿菌屬（Enterobacter)細菌、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)細菌、沙雷氏 菌屬（Serratia)細菌、歐文氏菌屬（Erwinia)細菌、沙門氏菌屬（Salmonella)細菌、摩根 氏菌屬（Morganella)細菌等。
[0045] 對于埃希氏菌屬細菌沒有特殊限制，只要是大腸桿菌等屬于埃希氏菌屬的細菌即 可，具體地可以利用Neidhardt等的著作（Neidhardt，F(xiàn)R.C. et al. ,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology,Washington D. C. , 1208, 表I)中列舉的埃希氏菌屬細菌。
[0046] 此外，作為腸桿菌屬細菌，可以列舉出成團腸桿菌（Enterobacter agglomerans)、 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)等；作為泛菌屬細菌，可以列舉出Pantoea ananatis 等。
[0047] 作為棒狀桿菌型細菌，可以列舉出：按照微生物領域的本領域技術人員已知的分 類方法分類為棒狀桿菌型細菌的細菌；傳統(tǒng)上被分類為短桿菌屬，而現(xiàn)在被重新分類為棒 桿菌屬的細菌（Int. J. Syst. Bacteriol.，41，255 (1991));以及屬于與棒桿菌屬親緣關系 非常近的短桿菌屬的細菌等。這樣的棒狀桿菌型細菌的例子可以列舉如下。
[0048] 嗜乙酰乙酸棒桿菌
[0049] 醋谷棒桿菌（Corynebacterium acetoglutamicum)
[0050] 燒醇棒桿菌（Corynebacterium alkanolyticum)
[0051] 美棒桿菌（Corynebacterium callunae)
[0052] 谷氨酸棒桿菌
[0053] 百合花棒桿菌（Corynebacterium lilium)
[0054] 棲糖蜜棒桿菌（Corynebacterium melassecola)
[0055] 嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium thermoaminogenes)
[0056] 力士棒桿菌（Corynebacterium herculis)
[0057] 二歧短桿菌（Brevibacterium divaricatum)
[0058] 黃色短桿菌
[0059] Brevibacterium immariophilum
[0060] 乳發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)
[0061] 玫瑰色短桿菌（Brevibacterium roseum)
[0062] 解糖短桿菌（Brevibacterium saccharolyticum)
[0063] 生硫短桿菌（Brevibacterium thiogenitalis)
[0064] 產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes)
[0065] 白色棒桿菌（Brevibacterium album)
[0066] 賭狀短桿菌（Brevibacterium cerinum)
[0067] 嗜氨微桿菌（Microbacterium ammoniaphilum)
[0068] 作為芽孢桿菌屬細菌，可以使用按照微生物領域的本領域技術人員已知的分類方 法分類在芽孢桿菌屬的細菌，具體地，可以列舉出枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，但不 限于此。
[0069] 對在諸如上述的微生物中增大GMP合成酶的活性的方法進行說明。
[0070] 在本發(fā)明中，"經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶的活性"是指：與埃希氏菌屬細菌 等微生物的非修飾株例如野生株相比，GMP合成酶的活性高。
[0071] GMP合成酶是指催化下述反應的酶（EC 6. 3. 4. I)，"GMP合成酶的酶活性"是指催 化從XMP生成GMP的反應的活性。
[0072] ATP+XMP+NH3- AMP+ 焦磷酸 +GMP
[0073] GMP 合成酶活性可以例如采用 Spector 的方法（Spector，T.，Methods Enzymol.， 1978, 51，p219)，通過考察NADH的減少速度來測定。
[0074] 為了增大GMP合成酶的活性，優(yōu)選提高編碼該酶的guaA基因的表達量。作為提高 表達量的方法，可以列舉出提高編碼GMP合成酶的DNA在細菌細胞內的拷貝數(shù)的方法。為 了提高細胞內的拷貝數(shù)，只要將編碼GMP合成酶的DNA片段與能夠在埃希氏菌屬細菌等微 生物中發(fā)揮功能的載體連接來制作重組DNA、并將其導入宿主中來進行轉化即可。轉化株 細胞內的編碼GMP合成酶的基因（guaA基因）的拷貝數(shù)提高的結果是GMP合成酶的活性增 大。
[0075] 細胞內拷貝數(shù)的提高可以通過使GMP合成酶基因在上述宿主的染色體DNA上以多 拷貝存在來實現(xiàn)。為了在屬于埃希氏菌屬的細菌的染色體DNA上以多拷貝導入GMP合成酶 基因，可以利用染色體上多拷貝存在的序列作為靶標通過同源重組來進行。作為染色體DNA 上多拷貝存在的序列，可以利用重復DNA或存在于轉移因子端部的反向重復序列等?；蛘?， 也可以如特開平2-109985號公報所公開的那樣，將目的基因搭載在轉座子上并使之轉移 來多拷貝導入到染色體DNA上。采用任何方法提高轉化株內的GMP合成酶基因拷貝數(shù)的結 果均是GMP合成酶的活性增大。
[0076] 作為用于導入上述基因的載體，可以列舉出pSTV29、pMW218、pUC19等質粒載體， 入1〇59、人8?101、]?131^9等噬菌體載體。此外，作為轉座子，可以列舉出此、1'1110、1'115。
[0077] 在編碼GMP合成酶的DNA方面，其堿基序列是公知的，因而可以基于該序列來合成 引物，通過以埃希氏菌屬細菌等微生物的染色體DNA作為模板采用PCR法進行擴增來獲取。 例如，作為大腸桿囷的guaA基因，可以列舉出具有SEQ ID NO :1的喊基序列的基因。該基 因也可以通過基于該堿基序列制備探針、從埃希氏菌屬細菌的染色體DNA文庫中通過雜交 選擇目的DNA片段來獲得?；蛘?，編碼GMP合成酶的DNA片段可以基于已知的堿基序列來 化學合成。而且，大腸桿菌的guaA基因可以使用SEQ ID NO :9和10的引物來進行克隆。
[0078] 此外，從埃希氏菌屬細菌以外的微生物也可以基于上述堿基序列獲取編碼具有與 GMP合成酶等同的功能的蛋白質的基因。
[0079] 作為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的GMP合成酶基因（guaA)，可以列舉出 具有SEQ ID NO :3的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所 示。作為谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)的GMP合成酶基因（guaA)，可以列 舉出具有SEQ ID NO :5的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :6 所示。
[0080] 作為產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes)的 GMP 合成酶基因（guaA)，可 以列舉出具有SEQ ID NO :7的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0081] 如上述，因微生物所屬的屬、種或菌株不同，guaA基因的堿基序列中有時會存在差 異，因此guaA基因可以是上述基因的變體。
[0082] guaA基因編碼的蛋白質只要具有GMP合成酶活性即可，可以是相對于SEQ ID NO :2、4、6或8的整個氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%、特別優(yōu) 選98%以上的同一性的蛋白質。氨基酸序列和堿基序列的同一性可以使用例如Karlin 和 Altschul 的算法 BLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA，90,5873 (1993))或 Pearson 的 FASTA(MethodsEnzymol.，183,63(1990))來確定?；谠撍惴˙LAST，已經(jīng)開發(fā)出稱為 BLASTN 或 BLASTX 的程序（參照 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov) 〇
[0083] 此外，本發(fā)明中使用的guaA基因并非僅限于野生型基因，在不損害所編碼的蛋白 質的功能即GMP合成酶活性的前提下，也可以是突變體或人工修飾體，所述突變體或人工 修飾體編碼具有在SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列中包含在1個或者多個位置上的1 個或數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列的蛋白質。這里，所謂"數(shù)個"，雖然 因氨基酸殘基的種類或其在蛋白質立體結構中的位置而異，但具體地是指2?20個、更優(yōu) 選2?10個、更優(yōu)選2?5個。上述取代優(yōu)選為保守取代。作為保守突變，當取代部位為 芳族氨基酸時，是指在Phe、Trp、Tyr之間相互取代的突變，當取代部位為疏水性氨基酸時， 是指在Leu、lie、Val之間相互取代的突變，當取代部位為極性氨基酸時，是指在Gin、Asn 之間相互取代的突變，當取代部位為堿性氨基酸時，是指在Lys、Arg、His之間相互取代的 突變，當取代部位為酸性氨基酸時，是指在Asp、Glu之間相互取代的突變，當取代部位為帶 有羥基的氨基酸時，是指在Ser、Thr之間進行相互取代的突變。作為保守取代，具體地可以 列舉出：從Ala到Ser或Thr的取代，從Arg到GlruHis或Lys的取代，從Asn到Glu、Gln、 Lys、His或Asp的取代，從Asp到Asn、Glu或Gln的取代，從Cys到Ser或Ala的取代，從 Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 的取代，從 Glu 到 Gly、Asn、Gin、Lys 或 Asp 的取代， 從 Gly 到 Pro 的取代，從 His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，從 lie 到 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Leu 到 lie、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，從Met到lie、Leu、Val或Phe的取代，從Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代， 從Ser到Thr或Ala的取代，從Thr到Ser或Ala的取代，從Trp到Phe或Tyr的取代，從 Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及從Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨 基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于攜帶guaA基因的微生物的個體差異、 種間差異等情形而天然發(fā)生的突變（mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添 加或倒位。
[0084] 此外，guaA基因也可以是下述DNA，所述DNA與SEQ ID N0:l、3、5或7的堿基序列 的互補堿基序列或能夠由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有GMP合成酶活 性的蛋白質。這里，"嚴格條件"是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條 件。將該條件明確地數(shù)值化是困難的，舉一實例，有這樣的條件：在該條件下，具有高同一性 的DNA，例如具有80%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選具有98%以上同一 性的DNA之間相互雜交，而同一性較之為低的DNA之間則不互相雜交；或者是這樣的條件： 在與常規(guī) Southern 雜交的洗滌條件即 60°C，I X SSC、0. 1 % SDS，優(yōu)選 0· I X SSC、0. 1 % SDS， 更優(yōu)選68°C，0. I X SSC、0. 1% SDS相當?shù)柠}濃度和溫度下，洗滌一次，更優(yōu)選兩次至三次的 條件。
[0085] 上述的關于基因的變體的描述對于后述的nagD基因、ushA基因、aphA基因以及其 它基因也同樣適用。
[0086] 將 DNA 導入微生物可以通過 C. T. chung 的方法（0.1'.(：11111^6七31.，？1'〇(3.似1:1· Acad. Sci.USA，86, 2172-2175 (1989))、D.M. Morrison 的方法（Methods in Enzymology， 68,326(1979))、或者用氯化鈣處理受體菌細胞來增加 DNA的透過性的方法（Mandel，M. and Higa，A.，J. Mol. Biol.，53,159 (1970))等來進行。
[0087] 提高GMP合成酶基因的表達量，除了利用上述的基因擴增以外，還可以通過將染 色體DNA上或質粒上的GMP合成酶基因的啟動子等表達調節(jié)序列更換成強力的啟動子等表 達調節(jié)序列來實現(xiàn)。例如，Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子等是已知的強 力啟動子。此外，如國際公開W000/18935所披露的，也可以在基因的啟動子區(qū)域導入數(shù)個 堿基的堿基取代，將其修飾得更為強力。通過所述啟動子取代或修飾，GMP合成酶基因的表 達得到強化，蛋白質的活性增大。
[0088] guaA基因的表達量的增大可以采用Northern法、RT-PCR法等來檢測。
[0089] 對在諸如上述的微生物中進行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能的方法進 行說明。
[0090] 在本發(fā)明中，"進行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能"是指：nagD基因所編 碼的蛋白質的活性降低或消失，或者所述基因的轉錄降低或消失，或者所述基因的翻譯效 率降低。
[0091 ] 已知大腸桿菌（E. coli)的nagD基因存在于參與N-乙酰葡糖胺的同化的 nagBA⑶操縱子內，且該nagBA⑶操縱子基因的表達可以通過在培養(yǎng)基中添加 N-乙酰葡 糖胺（一種構成細菌細胞壁的主成分的糖）來誘導（Plumbridge JA.，Mol. Micobiol. (1989)3. 505-515)。E. coli的nagD所編碼的NagD蛋白質從保守結構上的特征來看可知 其屬于鹵酸脫鹵酶（HAD)家族，有報告稱其在試管內實驗中具有針對GMP和5' -尿苷酸 (尿苷-5' - 一磷酸，以下也稱"UMP"）的核苷酸酶活性（Tremblay LW.，Biochemistry， (2006)45. 1183-1193)。但是，E. coli的基因組上存在23種HAD家族蛋白質，它們的底物 特異性范圍非常廣泛（Kuznetsova et al.，J. Biol. Chem.，（2006)281. ,36149-36161)，因 此并不清楚NagD蛋白質在細胞內的生理作用。
[0092] 進行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能，可以采用諸如以下的方法來實 現(xiàn)。例如，可以通過采用利用基因重組法的同源重組法（Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory press (1972) ；Matsuyama,S. and Mizushima, S.，J.Bacteriol.，162,1196 (1985))將染色體上的nagD基因替換成無法正常發(fā)揮功能的 nagD基因（以下也稱為"破壞型nagD基因"）來進行。在同源重組方面，如果將攜帶與染 色體上的序列具有同源性的序列的質粒等導入菌體內，則以某種頻率在具有同源性的序列 的位置上引發(fā)重組，導入的質粒整體整合到染色體上。然后，如果再于染色體上的具有同源 性的序列的位置引發(fā)重組，則質粒會再次脫落，此時有些情況下，通過引發(fā)重組的位置，被 破壞的基因在染色體上固定下來，而原來的正?；蚺c質粒一起從染色體上脫落。通過選 擇這樣的菌株，可以獲得染色體上的正常nagD基因被破壞型nagD基因取代的菌株。
[0093] 這樣的利用同源重組的基因取代包括：組合使用稱為"Red驅動整合（Red-driven integration)" 的方法（Proc.Natl.Acad. Sci. USA，2000, vol.97, No. 12, p6640-6645) 與λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)（J.Bacteriol. 2002S印；184(18) :5200-3.)的方法（參照 ?02005/010175號）等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型復制起點的質粒的方法 等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645,美國專利第 6303383 號， 或特開平05-007491號公報）。
[0094] 此外，基于諸如上述的利用了同源重組的基因取代的定點突變導入，也可以使用 在宿主中不具有復制能力的質粒來進行。此外，通過使用下述質粒也可以進行nagD基因的 破壞，所述質粒包含內部插入有藥物抗性等標記基因的nagD基因，且不能在目的微生物內 復制。即，用所述質粒轉化后獲得了藥物抗性的轉化體在染色體DNA中導入了標記基因。該 標記基因有很高的可能性是通過其兩端的nagD基因序列與染色體上的所述基因之間的同 源重組而導入的，因此能夠有效地選擇基因破壞株。
[0095] 用于基因破壞的破壞型nagD基因具體地可以這樣獲?。豪孟拗泼赶驮龠B 接使nagD基因的一定區(qū)域缺失，或者在所述基因中插入其它DNA片段（標記基因等），或 者利用定點突變法（Kramer，w.and Frits，H.J. ,Methods in Enzymology，154,350(1987)) 或利用次氯酸鈉、輕胺等化學藥物進行處理（Shortle，D. and Nathans，D.，Proc.，Natl.， Acad.，Sci.，U.S. A.，75, 270 (1978))，來在nagD基因的編碼區(qū)域或啟動子區(qū)域等的堿基序 列中引發(fā)1個或多個堿基取代、缺失、插入、添加或倒位，從而使所編碼的NagD蛋白質的活 性降低或消失，或者使nagD基因的轉錄降低或消失。
[0096] nagD基因的序列本身是公知的，基于這些序列，能夠容易地通過PCR法或雜交法 等獲得nagD基因。例如，作為大腸桿菌的nagD基因，可以列舉出編碼SEQ ID NO :12的氨 基酸序列的基因。nagD基因例如可以從大腸桿菌的染色體DNA通過使用SEQ ID NO: 13和 14所示的引物進行PCR來獲得。
[0097] 其它微生物的nagD基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的nagD基因之間 的序列同源性來獲取，并用于微生物的修飾。
[0098] nagD基因只要與進行修飾的微生物的染色體上的nagD基因之間具有能夠引發(fā)同 源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID NO :12的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選 80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。
[0099] 目的基因被破壞的事實可以通過采用Southern印跡、PCR法對染色體上的基因進 行解析來確認。
[0100] 此外，對微生物進行紫外線照射或者使用N-甲基-Ν' -亞硝基胍（NTG)或亞硝酸 等常規(guī)突變處理中使用的突變劑進行處理，也可以獲得不產(chǎn)生有活性的NagD蛋白質的突 變株。
[0101] 本發(fā)明的方法所使用的細菌中，優(yōu)選還經(jīng)過修飾而使得UShA基因和/或aphA基 因無法正常發(fā)揮功能。所述基因的突變株或基因重組株可以通過進行修飾而使得所述基因 編碼的5' -核苷酸酶的活性降低或消失，或者使得所述基因的轉錄降低或消失來進行。這 樣的突變株或基因重組株可以采用與前述的nagD基因無法正常發(fā)揮功能的突變株或基因 重組株相同的方法來獲得。
[0102] ushA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于這些序列采用PCR法或雜交法等 獲得ushA基因。例如，作為大腸桿菌的ushA基因，可以列舉出編碼SEQ ID NO :16的氨基 酸序列的基因。其它微生物的ushA基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的ushA基 因之間的序列同源性來獲取，并用于修飾。
[0103] 而且，ushA基因只要與進行修飾的微生物的染色體上的ushA基因之間具有能夠 引發(fā)同源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID N0:16的氨基酸序列具有70%以上、 優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。
[0104] aphA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于這些序列采用PCR法或雜交法等 獲得aphA基因。例如，作為大腸桿菌的aphA基因，可以列舉出編碼SEQ ID NO :18的氨基 酸序列的基因。其它微生物的aphA基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的aphA基 因之間的序列同源性來獲取，并用于修飾。
[0105] aphA基因只要與進行修飾的微生物的染色體上的aphA基因之間具有能夠引發(fā)同 源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID NO :18的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選 80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。
[0106] 本發(fā)明提供經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、而且還經(jīng)過修飾而 增加了 guaA基因的表達從而增大了鳥苷酸合成酶的活性的、具有將黃苷酸轉化為5'-鳥苷 酸的能力的微生物（但是，除了經(jīng)過了上述修飾以外，還經(jīng)過修飾從而通過增加 guaB基因 的表達增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物除外），作為新的微生物。在該微生物中，優(yōu)選還 經(jīng)過修飾從而使得選自ushA基因、aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功 能。
[0107] < II > GMP的生產(chǎn)方法
[0108] 使XMP與上述的經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾而增 大了 GMP合成酶活性的微生物反應，將XMP轉化為GMP，從而能夠得到GMP。
[0109] 作為進行該微生物的培養(yǎng)時的碳源，只要是上述微生物能夠同化的碳源即可，可 以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、廢糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇 等醇類，丙酮酸、乳酸、醋酸等有機酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作為 氮源，可以使用氨氣、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機以及有機 銨鹽，尿素、各種氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉 或其消化物等。作為無機物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈉、硫 酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、碳酸鈣等。當所使用的微生物的生長繁育需要氨基酸、核酸、維生 素等特定營養(yǎng)物質時，可以在培養(yǎng)基中適量添加所述物質。
[0110] 培養(yǎng)可以在pH5. 0?8. 5、15°C?45°C的適宜范圍內在需氧條件下進行5小時? 72小時左右。而且，pH調整可以使用無機或有機的酸性或者堿性物質，還可以使用氨氣等。
[0111] 直接將該微生物的培養(yǎng)液接種于含XMP的反應液中，或者離心后僅將菌體接種于 含XMP的反應液中，或者將菌體懸浮于適當?shù)娜芤褐性俳臃N于含XMP的反應液中，可以進行 從XMP到GMP的轉化。作為基質的XMP的濃度只要是能夠獲得充分量的GMP的濃度即可， 對其沒有特殊限制，但優(yōu)選1?200mM的范圍。
[0112] 而且，在本發(fā)明的GMP的生產(chǎn)方法中，還可以使用上述微生物的菌體處理物。作為 菌體的處理物，可以列舉出例如將菌體用丙烯酰胺、角叉藻聚糖等固定化而得到的固定化 菌體等。
[0113] 作為反應液的碳源，只要是上述微生物能夠同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果 糖、蔗糖、糖蜜、廢糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇等醇類，丙酮酸、乳 酸、醋酸等有機酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作為氮源，可以使用氨 氣、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機以及有機銨鹽，尿素、各種 氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉或其消化物等。 作為無機物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸 錳、硫酸鋅、碳酸鈣等。當所使用的微生物的生長繁育需要氨基酸、核酸、維生素等特定營養(yǎng) 物質時，可以在培養(yǎng)基中適量添加所述物質。
[0114] 而且，反應液中優(yōu)選加入有機溶劑來激活核苷酸的細胞透過性。
[0115] 作為核苷酸的膜透過性激活劑的有機溶劑優(yōu)選利用二甲苯、甲苯、苯、脂肪酸醇、 乙酸乙酯等，并通常優(yōu)選以0. 1?30ml/L的濃度使用。
[0116] 反應可以在pH5. 0?8. 5、15°C?45°C的適宜范圍以需氧條件或厭氧條件進行1 小時?7天左右。而且，pH調整可以使用無機或有機的酸性或堿性物質，還可以使用氨氣 等。
[0117] 而且，原料XMP可以使用化學合成品、市售品和通過發(fā)酵法生產(chǎn)的XMP等。
[0118] 從反應液收集GMP，通常通過組合離子交換樹脂法、沉淀法、其它公知方法來實施。
[0119] [實施例]以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。
[0120] 實施例1
[0121] < 1-1 > JM109株來源nagD基因破壞株的構建
[0122] 以作為常規(guī)DNA克隆用宿主使用的大腸桿菌JM109株作為親本株，首先進行了 NagD蛋白質非產(chǎn)生株的構建。NagD蛋白質由nagD基因（GenBank登錄號X14135SEQ ID NO: 11)編碼。
[0123] nagD基因的缺失通過Datsenko和Wanner最先開發(fā)的稱為"Red驅動整合 (Red-driven integration) " 的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000，vol. 97，No. 12， P6640-6645)以及 λ 噬菌體來源的切出系統(tǒng)（J.Bacteriol.2002S??；184(18) :5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotem complex. Cho EH，Gumport RI，Gardner JF.)來進行。根據(jù)"Red 驅動整合" 方法，使用將目的基因的一部分設計在合成寡核苷酸的5'側、將抗生素抗性基因的一部分 設計在Y側而得到的合成寡核苷酸作為引物來獲得PCR產(chǎn)物，使用該PCR產(chǎn)物能夠一步式 地構建基因破壞株。而且，通過組合使用λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)，能夠將整合入基因破 壞株的抗生素抗性基因除去。
[0124] 作為 PCR 的模板，使用 了質粒 pMW118-attL-Cm-attR。pMW118-attL-Cm-attR( W02006078039)是在pMW118(寶生物公司制造）中插入作為λ噬菌體附著位點的attL和 attR基因、以及作為抗生素抗性基因的cat基因而得到的質粒，其中按attL-cat-attR的順 序插入。
[0125] 使用SEQ ID NO :19和20所示的合成寡核苷酸引物進行了 PCR，其中，引物的:V 末端具有與attL和attR的兩端對應的序列，引物的5'末端具有與作為目的基因的nagD 基因的一部分對應的序列。
[0126] 將擴增得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行純化，通過電穿孔將其導入包含具有溫 度敏感型的復制能力的質粒PKD46的大腸桿菌JM109株中。質粒pKD46(Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)包含 λ 噬菌體的總計 2154 個堿基的 DNA 片段 (GenBank/EMBL登錄號J02459、第31088位?33241位），該DNA片段中包含受阿拉伯糖誘 導型？"@啟動子調控的編碼入1^(1同源重組系統(tǒng)的1^(1重組酶的基因（丫、|3、以 〇基因）。 質粒PKD46對于將PCR產(chǎn)物整合到JM109株的染色體上是必要的。
[0127] 電穿孔用感受態(tài)細胞如下述地制備。即，將在含100mg/L氨芐西林的LB培養(yǎng)基 中30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌JM109株用含氨芐西林（20mg/L)和L-阿拉伯糖（ImM)的5mL 的 SOB 培養(yǎng)基（Molecular Cloning :A LaboratoryManual，第 2 版，Sambrook，J 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989年））稀釋100倍。使所得稀釋物于30°C通氣條 件下生長繁育至0D600約0. 6后，濃縮100倍，再用10%甘油洗滌3次，從而使得其能夠在 電穿孔中使用。電穿孔使用70 μ L的感受態(tài)細胞和約IOOng的PCR產(chǎn)物來進行。在電穿孔 后的杯子中加入 ImL 的 SOC 培養(yǎng)基（Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版， Sambrook，J.等，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 年）），37°C培養(yǎng) 2.5 小時 后，于37 °C在包含Cm (氯霉素）（25mg/L)的L-瓊脂培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)，選擇出Cm抗性 重組體。然后，為了除去PKD46質粒，在含Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C傳代2次，測試所 得菌落的氨芐西林抗性，獲得了 PKD46脫落的氨芐西林敏感型株。
[0128] 采用PCR確認了通過氯霉素抗性基因甄別出的突變體的nagD基因的缺失。將所 得nagD缺損株命名為JM109 Δ nagD : :att_cat株。
[0129] 然后，為了除去導入nagD基因內的att-cat基因，使用了輔助質粒即上述的 pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts攜帶編碼λ B莖菌體的整合酶（Int)的基因、編碼切除酶 (Xis)的基因，是具有溫度敏感型的復制能力的質粒。通過導入pMW-intxis-ts，識別染色 體上的attL或attR并引發(fā)重組，從而將attL與attR之間的基因切出，染色體上形成僅殘 留attL或attR序列的結構。
[0130] 按照常規(guī)方法制作了上述所得的JM109 Δ nagD : :att_cat株的感受態(tài)細胞，用輔 助質粒pMW-intxis-ts進行轉化，于30°C在含50mg/L氨節(jié)西林的L-瓊脂培養(yǎng)基上進行平 板培養(yǎng)，選擇出氨芐西林抗性株。
[0131] 然后，為了除去pMW-intxis-ts質粒，在L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C傳代2次，測試所 得菌落的氨節(jié)西林抗性以及氯霉素抗性，獲得了 att-cat和pMW-intxis-ts脫落的nagD破 壞株即氯霉素、氨芐西林敏感型株。將該株命名為JM109 Λ nagD。
[0132] < 1-2 > GMP合成酶表達強化質粒pSTV29-Ptac_guaA的構建以及將該質粒導入 JM109 株和 JM109 Δ nagD 株
[0133] 如下地進行了 GMP合成酶表達強化質粒pSTV29-Ptac_guaA的構建。對于guaA 基因，使用SEQ ID NO:9和SEQ ID N0:10所示的引物進行PCR，擴增了大腸桿菌的guaA 基因。純化擴增片段后，將兩端形成的限制酶位點用EcoRI和PstI切割。將切割片段與 同樣用EcoRI和PstI切割的pKK223-3 (GenBank登錄號M77749)相連接，選擇出在緊隨 tac啟動子之后的位置引入guaA基因而得到的質粒pKK223-guaA。將所得質粒用BamHI 和HindIII切割，使得切割片段包含tac啟動子。將切割片段與同樣用BamHI和HindIII 切割的PSTV29相連接，選擇出在緊隨tac啟動子之后的位置引入guaA基因而得到的質 粒pSTV29-Ptac-guaA。將其導入JM109株和所述JM109AnagD株，分別得到了 JM109/ pSTV29-Ptac-guaA 株和 JM 109 Δ nagD/pSTV29-Ptac-guaA 株。
[0134] < 1-3 >利用 JM109/pSTV29-Ptac_guaA 株和 JM109 Δ nagD/pSTV29-Ptac_guaA 株 菌體進行從XMP到GMP的轉化反應
[0135] 對于上述菌株，實施了從XMP到GMP的轉化反應評價。用于進行從XMP到GMP的 轉化反應評價的菌體制備方法、反應方法、反應溶液組成、分析方法如下所示。
[0136] [菌體的制備方法]
[0137] 在 LB 培養(yǎng)基平板上均勻涂布 JM109/pSTV29-Ptac_guaA 株和 JM109 Δ nagD/ pSTV29-Ptac-guaA株，37°C培養(yǎng)過夜。第二天，將1/32平板量的菌體接菌在裝有LB培養(yǎng)基 120ml的500ml容量坂口燒瓶中，37°C培養(yǎng)過夜。將LB 600ml量的培養(yǎng)液經(jīng)離心后而得的 菌體用于60ml的反應溶液。
[0138] [反應方法]
[0139] 用藥匙刮取前述的LB 600ml量的培養(yǎng)后菌體，將其接種于后述的反應液60ml中， 開始反應。反應于42°C在添加氨水維持pH為7. 2的條件下實施。
[0140] [反應溶液組成]

【權利要求】
1. 一種生產(chǎn)5'-鳥苷酸的方法，該方法中使黃苷酸作用于下述微生物來生成5'-鳥苷 酸，并收集5' -鳥苷酸，所述微生物具有將黃苷酸轉化為5' -鳥苷酸的能力，且經(jīng)過修飾從 而使得nagD基因不能正常地發(fā)揮功能，而且還經(jīng)過修飾從而增大了 5'-鳥苷酸合成酶的活 性。
2. 根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中，所述微生物經(jīng)過修飾而增加 了 guaA基因的表達，從而增大了 5' -鳥苷酸合成酶的活性。
3. 根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中，所述guaA基因編碼下述（A) 或⑶的蛋白質： (A) 具有SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的蛋白質； (B) 具有在SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列中包含1個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺 失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5' -鳥苷酸合成酶活性的蛋白質。
4. 根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中， 所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自ushA基因和aphA基因中的1種以上的基因不能 正常發(fā)揮功能。
5. 根據(jù)權利要求1?4中任一項所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中， 所述微生物是屬于腸桿菌科的細菌、芽孢桿菌屬細菌或棒狀桿菌型細菌。
6. 權利要求5所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中， 所述微生物是埃希氏菌屬細菌。
7. 根據(jù)權利要求6所述的生產(chǎn)5' -鳥苷酸的方法，其中， 所述微生物是大腸桿菌。
8. -種微生物，所述微生物具有將黃苷酸轉化為5' -鳥苷酸的能力，且經(jīng)過修飾而增 加了 guaA基因的表達，從而增大了 5' -鳥苷酸合成酶的活性，而且還經(jīng)過修飾從而使得 nagD基因不能正常發(fā)揮功能；但上述微生物中不包括除了經(jīng)過上述修飾以外，還經(jīng)過修飾 而增加了 guaB基因的表達，從而增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物。
9. 根據(jù)權利要求8所述的微生物，所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自ushA基因和 aphA基因中的1種以上的基因不能正常發(fā)揮功能。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的微生物，其中，該微生物是屬于腸桿菌科的細菌、芽孢桿 菌屬細菌或棒狀桿菌型細菌。
11. 根據(jù)權利要求10所述的微生物，其中，該微生物是埃希氏菌屬細菌。
12. 根據(jù)權利要求11所述的微生物，其中，該微生物是大腸桿菌。
【文檔編號】C12R1/19GK104480169SQ201410707725
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2010年8月10日 優(yōu)先權日:2009年8月10日
【發(fā)明者】深田寬朗, 淺原貴之, 橋口賢一 申請人:味之素株式會社