用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-m1的分子標(biāo)記的引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-m1的分子標(biāo)記的引物，引物是具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記與現(xiàn)有的大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的分子標(biāo)記相比，它具有與恢復(fù)基因Rf-m1連鎖更緊密的分子標(biāo)記，可減少由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定，而且在操作上高效、快捷。
【專利說明】用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-m1的 分子標(biāo)記的引物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆分子育種【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù) 基因（Rf-ml)區(qū)段的分子標(biāo)記，可用于分子標(biāo)記輔助恢復(fù)基因的選擇育種。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS)，是指植物不能產(chǎn)生花 粉或產(chǎn)生的花粉無活力，導(dǎo)致雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一種母性遺傳現(xiàn)象 (Schnable等，1998)。王曙明等（2009)認(rèn)為利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行三系配套育種是作 物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑，而雜種優(yōu)勢利用是大幅度提高大豆產(chǎn)量的有效措施之一。大 豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育最早是由Davis(1985)獲得的質(zhì)核互作雄性不育的不育系和保持系，但 未見進(jìn)一步的報道。2004年，趙麗梅等研宄培育出世界上第一個比對照增產(chǎn)20. 8%的三系 大豆雜交種"雜交豆1號"，該品種不僅品質(zhì)優(yōu)良，抗病性強(qiáng)，而且促使大豆產(chǎn)量大幅度的提 高（趙麗梅等，2004)。目前，國內(nèi)多個研宄單位報道育成多個不育系并實現(xiàn)三系配套，使我 國的大豆雜種優(yōu)勢利用研宄處于國際前列（張磊等，2007 ;彭寶等，2008, 2010, 2013)。
[0003] 優(yōu)良恢復(fù)系是利用CMS系統(tǒng)配制雜交種的基礎(chǔ)，但育性恢復(fù)性易受環(huán)境影響，并 且需通過測交才能確定。定位恢復(fù)基因，利用分子標(biāo)記對恢復(fù)基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可 提高育種效率。目前，已有研宄者利用分子標(biāo)記對大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行了定 位，這在一定程度上提尚了選擇的可靠性（許占友等，1999 ;趙_梅等，2007 ;Yang等，2007 ; Wang等，2010 ;李曙光等，2010 ;Dong等，2012)，但卻并不能滿足國內(nèi)雜交大豆育種對恢復(fù) 系輔助選育的需求。
[0004] M型大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系W931A是張磊等（1997)利用栽培大豆品種間 雜交、回交育成的不育材料，不育性徹底，并獲農(nóng)業(yè)部植物新品種權(quán)保護(hù)（品種權(quán)號 CNA20010017. 3)。利用該不育系，先后育成了世界上第一個雜交夏大豆雜優(yōu)豆1號（張磊 等，2007)和雜交大豆雜優(yōu)豆2號（黃志平等，2013)。育性的遺傳分析表明，大豆M型不育 系統(tǒng)為單基因配子體不育，育性恢復(fù)受1對顯性基因恢復(fù)（張磊等，2007 ;湯復(fù)躍等，2009)。 湯復(fù)躍等（2009)雖然獲得了與恢復(fù)基因連鎖的分子標(biāo)記，這在一定程度上提高了恢復(fù)系 選擇的速度，且操作簡單，但是這些標(biāo)記大都與恢復(fù)基因的連鎖距離較遠(yuǎn)，選擇的準(zhǔn)確性一 般較低?；诖?，Wang等利用連鎖分析的方法對大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行精 細(xì)定位，在大豆的16號染色體上發(fā)現(xiàn)了與恢復(fù)基因（Rf-ml)緊密連鎖的分子標(biāo)記。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢 復(fù)基因Rf-ml的分子標(biāo)記的引物。
[0006] 本發(fā)明要解決的另外一個技術(shù)問題是提供一種上述引物用于制備鑒定大豆恢復(fù) 性材料分子標(biāo)記的方法。
[0007] 本發(fā)明要解決的還有一個技術(shù)問題是提供一種上述引物在大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性 不育恢復(fù)基因分子標(biāo)記輔助轉(zhuǎn)育中的應(yīng)用。
[0008] 對于用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-ml的分子標(biāo)記的引物， 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：引物是具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有 如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
[0009] 對于上述引物用于制備鑒定大豆恢復(fù)性材料分子標(biāo)記的方法本發(fā)明采用的技術(shù) 方案是包括以下步驟：
[001 0] (1)大材料基因組DNA的提取；
[0011] ⑵對大豆基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012] ?〇?擴(kuò)增反應(yīng)體系為：41^139父]\&18七61?〇?1^1，2.0 1^濃度為讓?111〇1/1上述 的上下游引物，20ng/yL模板DNA3yL，ddH201 yL ;反應(yīng)總量10yL ;PCR反應(yīng)在PTC-2225 熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序包括：94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)95°C變性60s，55°C退火50s， 72°C延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，12°C保存；
[0013] (3)反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色并于凝 膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。
[0014] 上述引物在大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因分子標(biāo)記輔助轉(zhuǎn)育中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] (1)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記與現(xiàn)有的大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的分子標(biāo) 記相比，它具有與恢復(fù)基因Rf-ml連鎖更緊密的分子標(biāo)記，可減少由于遺傳交換而造成的 錯誤鑒定，而且在操作上高效、快捷。
[0017] (2)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記方法能實現(xiàn)對大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因資 源的快速鑒定，能從大豆中準(zhǔn)確篩選出含恢復(fù)基因Rf-ml的品種，這些具有育性恢復(fù)能力 的大豆品種在育種中可以作為優(yōu)異親本來選育新的恢復(fù)系，有效的拓寬現(xiàn)有恢復(fù)系遺傳基 礎(chǔ)，增強(qiáng)雜交大豆的組合優(yōu)勢。
[0018] (3)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記方法能有效用于大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的輔 助育種。早期恢復(fù)系成型后，還必須對其恢復(fù)基因進(jìn)行測交鑒定，這一方法不僅需要兩個生 長季節(jié)，同時還要對大量單株進(jìn)行雜交，其過程相當(dāng)煩瑣。而利用與恢復(fù)基因共分離的分子 標(biāo)記則可以克服上述缺點，在苗期就可進(jìn)行基因型篩選，有效降低恢復(fù)系選育的時間和強(qiáng) 度，大大提高育種工作的預(yù)見性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例的大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因與分子標(biāo)記的連鎖圖， 其標(biāo)記與恢復(fù)基因Rf-ml之間的距離僅有0. 35cM。

【具體實施方式】
[0021] 以下是一種鑒別大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-ml的分子標(biāo)記方法，其具 體實施步驟如下：
[0022] -、試驗材料
[0023] 大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因分離群體：W931A/WR016經(jīng)自交獲得的356個 F2單株。
[0024] 二、分子標(biāo)記開發(fā)
[0025] (1)分子標(biāo)記的錨定
[0026] 根據(jù)Song等（2004和2010)提供的引物序列以及從大豆的基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www. phytozome. net/soybean)上得到的目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的DNA序列，獲得與大豆M型 細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-ml相連鎖的分子標(biāo)記。
[0027] ⑵引物設(shè)計
[0028] 利用恢復(fù)基因Rf-ml區(qū)段內(nèi)的核苷酸序列在大豆基因組網(wǎng)站（http://www. phytozome. net/soybean)下載其位于大豆第16染色體上的核酸序列，并對相關(guān)序列進(jìn)行 分析；然后，利用 PrimerPremier5.0(http://www.premierbiosoft. com)設(shè)計引物，合成引 物的名稱及序列如下：
[0029] 標(biāo)記名稱：GmAH1607
[0030] 退火溫度：55°C
[0031] 產(chǎn)物大?。?27bp
[0032] 上游引物（5，一 3'）：GCGTGCCTAAAAAITCATCGCCC
[0033] 下游引物（5' - 3'）：GCGAGGGGITTTACTCTTCATGT
[0034] 三、分子標(biāo)記驗證
[0035] (1)大豆植株基因組DNA的提取
[0036] 以苗期新鮮葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，詳細(xì)步驟如下：
[0037] 1)取大豆嫩葉2-3g，在液氮中研成粉末，倒入65°C預(yù)熱30min左右的CTAB提取緩 沖液中，65°C水浴60min左右，其間輕搖3-5次；
[0038] 2)加等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1/v : v)溶液，并充分搖勻，放在搖床上輕搖 20min ；
[0039] 3)經(jīng)lOOOOrpm離心15min，將上清夜轉(zhuǎn)入一個新的離心管中；
[0040] 4)加入10ml冰凍的異丙醇，上下?lián)u勻；
[0041] 5)離心倒掉液體，加入2-3ml TE緩沖液，待完全溶解后，等體積氯仿：異戊醇再抽 提一次；
[0042] 6)經(jīng)8000rpm離心5min，吸取上清液轉(zhuǎn)到另一個新的離心管中；
[0043] 7)用1000 y 1體積的冰凍無水乙醇，在-20°C下靜置20min以沉淀DNA ;
[0044] 8) lOOOOrpm 離心 5min，棄去上清夜；
[0045] 9) 70%乙醇800 y 1清洗兩次，真空干燥機(jī)上吹干；
[0046] 10)將DNA溶于TE中，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于-20 °C待用。
[0047] (2)分子標(biāo)記的擴(kuò)增和電泳檢測：
[0048] 將上述的分子標(biāo)記引物加入PCR反應(yīng)體系，并對大豆育種群體植株的DNA進(jìn)行擴(kuò) 增；1〇111?0?反應(yīng)體系包括 ：41^139\]\&18七61?0?1^1，2.〇1^濃度為讓口111〇1/1上下 游引物，20ng/yL 模板 DNA3yL，ddH201 yL ;反應(yīng)總量 10yL。
[0049] PCR反應(yīng)程序包括：94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)95°C變性60s，55°C退火50s，72°C 延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10min，12°C保存；
[0050] (3)反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色并于凝 膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。
[0051] (4)結(jié)果分析
[0052] 通過對W931A/WR016F2分離群體的356個單株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳產(chǎn)物呈 現(xiàn)2種類型的條帶，即恢復(fù)系WR016 (Rf-ml Rf-ml)及雜種FI (Rf-mlrf-ml)的帶型。經(jīng)統(tǒng) 計，該標(biāo)記在F2群體中共檢測到Rf-ml Rf-ml基因型單株174個，Rf-ml rf-ml基因型單 株182個，2種基因型符合1 : 1的比例（x2=〇. 70，PaQ5=0.40)。通過對大豆細(xì)胞質(zhì)雄 性不育系及其恢復(fù)系后代單株進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)所篩選到的標(biāo)記與雄性不育恢復(fù)基因緊 密連鎖，遺傳距離僅有0. 35cM(圖1)。因此，通過緊密連鎖標(biāo)記的PCR擴(kuò)增能準(zhǔn)確區(qū)分恢復(fù) 基因Rf-ml位點的不同基因型，達(dá)到輔助育種的目的。
[0053] 以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明 的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 用于輔助鑒定大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因 Rf-ml的分子標(biāo)記的引物，其特征 在于：所述引物是具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO :2 所示核苷酸序列的下游引物。
2. 如權(quán)利要求1所述引物用于制備鑒定大豆恢復(fù)性材料分子標(biāo)記的方法，包括以下步 驟： (1) 大豆材料基因組DNA的提?。? (2) 對大豆基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：4 y L TaqXMaster PCR Mix，2. 0 y L濃度為lppmol/L如權(quán)利要 求1所述的上下游引物，20ng/yL模板DNA3yL，ddH201 yL ;反應(yīng)總量10yL ;PCR反應(yīng)在 PTC-2225熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序包括：94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)95°C變性60s，55°C 退火50s，72°C延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10min，12°C保存； (3) 反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色并于凝膠成 像系統(tǒng)下觀察，記載。
3. 如權(quán)利要求1所述引物在大豆M型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因分子標(biāo)記輔助轉(zhuǎn)育中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450900SQ201410707704
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】王大剛, 黃志平, 張磊, 李杰坤, 胡國玉 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所