豬偽狂犬病毒毒株及由其制備的滅活疫苗和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株豬偽狂犬病毒毒株及由其制備的滅活疫苗和應用，屬于豬偽狂犬病毒毒株的分離和應用領域。本發(fā)明首先公開了一株豬偽狂犬病毒PRV-JL株，其微生物保藏編號是：CGMCC No.9903。本發(fā)明還公開了一種應用所述PRV-JL株制備豬偽狂犬病滅活疫苗的方法，包括：(1)擴增豬偽狂犬病毒PRV-JL株，收獲病毒液；(2)加入滅活劑滅活病毒液，濃縮；(3)制備水相和油相；(4)將水相和油相混合，乳化，即得。動物實驗結果表明，本發(fā)明PRV-JL株制備的滅活疫苗安全性高，免疫原性好，免疫保護率高，對新分離變異株強毒株及PRV閩A株強毒均能提供完全保護，能夠對目前流行的豬偽狂犬病實現(xiàn)有效防治。CGMCC No 990320141028
【專利說明】豬偽狂犬病毒毒株及由其制備的滅活疫苗和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬偽狂犬病毒毒株，尤其涉及一株性能優(yōu)異的豬偽狂犬病毒 (Pseudorabies Virus)強毒株，本發(fā)明還涉及由所述豬偽狂犬病毒強毒株制備的滅活疫苗 及其應用，屬于豬偽狂犬病毒毒株的分離和應用領域。

【背景技術】
[0002] 豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒引起的，往往以爆發(fā)流行的方式流行。初生仔豬感 染本病毒后死亡率極高，成年豬感染該病毒多呈隱性狀態(tài)，死亡率較低，但懷孕母豬容易發(fā) 生流產(chǎn)、弱胎、死和木乃伊胎。健康豬與帶毒豬、病豬直接接觸可感染本病毒。該病毒的免疫 抑制作用可增強受感染成年豬對其他病原的易感性，結果導致受病毒感染豬死亡率增加。 近年來，豬偽狂犬發(fā)病的季節(jié)性不明顯，發(fā)病率上升，除豬藍耳病以外，豬偽狂犬病已成為 危害母豬繁殖功能的第二大疾病。
[0003] 預防該病最行之有效的辦法是接種疫苗。目前，市售的豬偽狂犬病疫苗絕大多數(shù) 為豬偽狂犬病的常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗。由于流行毒株不斷發(fā)生變異，與市售疫苗在免 疫原性方面存在差異，導致傳統(tǒng)毒株制備的疫苗不能很好的防控當今流行的豬偽狂犬病。 因此，亟待開發(fā)新的免疫原性好的豬偽狂犬病疫苗，實現(xiàn)對目前流行的豬偽狂犬病的有效 防治。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株分離的豬偽狂犬病毒毒株，采用該毒株制 備的滅活疫苗免疫原性好，能夠有效防治目前流行的豬偽狂犬病。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明首先公開了一株分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株。
[0007] 本發(fā)明將分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株提交專利認可的機構進行保藏，其微生 物保藏編號為=CGMCC No. 9903 ;分類命名是：豬偽狂犬病毒；保藏時間是：2014年10月28 日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0008] 本發(fā)明從吉林某發(fā)病豬群母豬死胎的腦組織、扁桃體等組織中分離出一株豬偽狂 犬病毒PRV-JL株。將分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株空斑純化后，測定豬偽狂犬病毒PRV-JL 株的病毒含量為IO7 96TCID5tlA). lmL。采用PCR方法擴增PRV-JL株的gE基因，結果擴增出 一條1740bp的條帶，完全符合gE基因的大小。免疫熒光法檢測結果表明，分離病毒PRV-JL 株感染的蓋玻片培養(yǎng)物，在細胞質中存在許多綠色的熒光灶，而未接種分離病毒的陰性對 照蓋玻片培養(yǎng)物沒有特異性熒光出現(xiàn)。病毒PRV-JL株gE基因的進化樹分析結果可見，基 因進化樹分析圖中，新分離毒株PRV-JL株位于一個相對獨立的分支中。gE基因推導的氨基 酸序列比對發(fā)現(xiàn)，新分尚株PRV-JL株與大多數(shù)毒株相比，在54位、448位和512位發(fā)生了 54位（G-D)、448位（V-I)和512位（G-S)突變，在第48位插入一個D，同時第492-495位 的4個D之間也插入一個D，變成了 5個連續(xù)的D。本發(fā)明分離的PRV-JL株是一株豬偽狂 犬病毒變異株強毒。
[0009] 本發(fā)明豬偽狂犬病毒PRV-JL株能夠應用于制備預防豬偽狂犬病的疫苗或藥物。
[0010] 本發(fā)明進一步公開了一種預防豬偽狂犬病的疫苗組合物，包括：免疫上有效量的 豬偽狂犬病毒PRV-JL株和藥學上可接受的佐劑。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種豬偽狂犬病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：（1)擴增 所述的豬偽狂犬病毒PRV-JL株，收獲病毒液；（2)加入滅活劑滅活病毒液，濃縮；(3)制備 水相和油相；（4)將水相和油相混合，乳化，即得。
[0012] 其中，步驟（1)所述擴增為采用Vero細胞培養(yǎng)豬偽狂犬病毒PRV-JL株；優(yōu)選的， 將分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株按病毒維持液量的1 %接入形成單層的Vero細胞培養(yǎng)物 中；所述培養(yǎng)條件優(yōu)選為37 °C旋轉培養(yǎng)。
[0013] 步驟⑵按照質量g/體積mL計，滅活劑與病毒液的比例為0.02:100;所述滅活 劑為二乙烯亞胺溶液；優(yōu)選的，按照質量g/體積mL計，所述二乙烯亞胺溶液的濃度為2%。 所述滅活為在30°C滅活60h ;優(yōu)選的，在30°C、lOOr/min搖床上滅活60h，然后加入2%硫代 硫酸鈉溶液，終止滅活。
[0014] 步驟（2)所述濃縮優(yōu)選為濃縮5倍。
[0015] 步驟（3)所述制備水相包括：將吐溫-80與濃縮后的滅活病毒液按照體積比4 :96 混合均勻，得到水相；
[0016] 所述制備油相包括：將白油、司本-80、硬脂酸鋁按照體積比94 :6 :1. 5混合均勻。
[0017] 步驟（4)將水相和油相按照體積比I : 1. 5混合均勻。
[0018] 安全性試驗結果表明，本發(fā)明制備的豬偽狂犬病滅活苗對家兔和豬安全性好，免 疫后全部家兔或豬精神狀態(tài)良好，飲食正常，注射部位亦未見異常，均健康存活，無豬偽狂 犬病典型癥狀反應。免疫原性試驗結果表明，在斷奶仔豬免疫攻毒試驗中，本發(fā)明分離的豬 偽狂犬病毒PRV-JL株制備的滅活疫苗保護率為100%，高于市售Bartha-K61株弱毒疫苗 的保護率；在妊娠母豬攻毒保護試驗中，PRV-JL株滅活疫苗對新分離變異株強毒PRV-JL株 及PRV閩A株強毒均能提供完全保護。證明本發(fā)明分離的豬偽狂犬病毒PRV-幾株免疫原 性好，能夠對目前流行的豬偽狂犬病實現(xiàn)有效防治。
[0019] 本發(fā)明所渉及到的術語定義
[0020] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0021] 術語"分離的"意指所指代的材料從其天然環(huán)境中取出。因此，經(jīng)分離的生物材料 可以不含某些或所有細胞組分，即其中天然材料自然存在的細胞的組分（例如細胞質或膜 組分）。如果材料存在于細胞提取物或上清液中，那么它是經(jīng)分離的。
[0022] 可互換使用的術語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動物 中誘導免疫應答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護動物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進一步組分，包括 例如佐劑或免疫調節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領域技術人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時超 過一種上述組分。
[0023] 術語"佐劑"意指包括一種或多種物質的組合物，所述物質增強疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當緩慢釋放抗原的組織儲存，并且還充當非特異性增強免疫應答的淋巴樣 系統(tǒng)激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨抗原的初次疫苗接種將無法引發(fā)體液或細 胞免疫應答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質。
[0024] 術語"免疫有效量"是將引發(fā)針對豬偽狂犬病毒的免疫應答的無毒力豬偽狂犬病 毒毒株的量。"免疫有效量"將依賴于受體動物的物種、品種、年齡、大小、健康狀況等因素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為豬偽狂犬病毒PRV-JL株的PCR鑒定結果；其中，M :DNA Maker DL 2000 ;1 : PRV-JL株；2 :豬偽狂犬病毒閩A株；3 :陰性對照；
[0026] 圖2為豬偽狂犬病毒PRV-JL株感染細胞的免疫熒光法檢測結果；其中，A為未接 種分離病毒的陰性對照；B為PRV-JL病毒感染細胞；
[0027] 圖3為豬偽狂犬病毒PRV-JL株gE基因的進化樹分析；
[0028] 圖4為豬偽狂犬病毒PRV-JL株gE基因推導的氨基酸序列比對結果。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0030] 實施例1豬偽狂犬病毒毒株的分離
[0031] 1、實驗方法
[0032] I. 1病料采集
[0033] 病料采自吉林某發(fā)病豬群母豬死胎的腦組織、扁桃體等，以1 :10加入DMEM，研磨， 制備組織懸液，反復凍融3次，12, OOOrpm離心IOmin取上清經(jīng)0. 22 μ m濾器過濾。將濾出 液置-80°C冰箱凍結保存。
[0034] L 2分離培養(yǎng)
[0035] 將上述病料按病毒培養(yǎng)液的10%含量接入尚未形成單層的綠猴腎細胞系Vero細 胞培養(yǎng)物中，置于37°C感作lh，加入含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)5日。凍融2 次后第二代培養(yǎng)4天，收獲培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒；連續(xù)傳代5代，獲得原始毒種。
[0036] 1. 3病毒的基礎種子批建立
[0037] 取原始毒種，按病毒維持液量的1%接入形成單層的Vero細胞培養(yǎng)物中，置37°C 培養(yǎng)，當病變達到80%時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒；連續(xù)傳代6代，獲得 病毒的基礎種子。
[0038] 1. 4病毒的生產(chǎn)種子批建立
[0039] 取基礎種子，按病毒維持液量的1%接入形成單層的Vero細胞培養(yǎng)物中，置37°C 培養(yǎng)，在5% C02,37°C條件下培養(yǎng)，每天對細胞病變效應（CPE)進行觀察。
[0040] 2、實驗結果
[0041] 細胞病變效應的觀察結果顯示：細胞膨大，圓縮，繼而開始脫落逐漸形成空斑病 灶，并且有"拉網(wǎng)"現(xiàn)象；當細胞病變達到80%時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收 毒。連續(xù)傳代11代，最終獲得一株豬偽狂犬病毒毒株，命名為PRV-JL株。
[0042] 實施例2豬偽狂犬病毒毒株的鑒定
[0043] 對本發(fā)明實施例1分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株進行鑒定。
[0044] 1、病毒的蝕斑克隆
[0045] 用維持液將分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株作10倍系列稀釋，取其中的1(Γ5、10' 10' KT8接種24孔細胞板，每個稀釋度接種4個孔，100 μ 1/孔。置于37°C溫箱孵育Ih 后，每孔加入ImL的44°C營養(yǎng)瓊脂，待營養(yǎng)瓊脂凝固后將細胞板翻轉，并置于含5% CO2的 細胞培養(yǎng)箱內，逐日觀察。培養(yǎng)4d后對每個稀釋度上的空斑進行計數(shù)，計算空斑形成單 位（PFU)，觀察空斑形態(tài)及大小，挑出小而孤立的空斑，加入0. 5mL營養(yǎng)液中，凍融2次， 3, 000r/min，離心IOmin,吸取上清，做病毒增殖，測定克隆株病毒的毒價。
[0046] 結果顯示，24孔細胞板中分離的病毒經(jīng)過4天培養(yǎng)，能產(chǎn)生空斑的最大稀釋 度為ΚΓ6,在KT 6稀釋度的細胞單層上可看到單個存在的可數(shù)空斑，直徑在2?5mm之 間，空斑形態(tài)不規(guī)則，4個孔內的空斑個數(shù)有差異，最多的空斑數(shù)為30個，最少的僅有10 個。最終PFU為I. 6X l〇7〇. lmL。按照Reed-Muench法計算得到克隆毒株的病毒含量為 IO7.96TCID50A). lmL。
[0047] 2、病毒PCR鑒定
[0048] 分離的豬偽狂犬病毒PRV-JL株空斑純化后，采用PCR方法擴增gE基因。
[0049] PCR擴增反應體系（50 μ 1體系）：
[0050]

【權利要求】
1. 一株分離的豬偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus)PRV-JL株，其特征在于，其微生物 保藏編號是：CGMCC No. 9903。
2. 權利要求1所述豬偽狂犬病毒PRV-JL株在制備預防豬偽狂犬病疫苗中的應用。
3. -種預防豬偽狂犬病的疫苗組合物，其特征在于，包括：免疫上有效量的權利要求1 所述豬偽狂犬病毒PRV-幾株和藥學上可接受的佐劑。
4. 一種豬偽狂犬病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)擴增權利要求1所述的豬偽狂犬病毒PRV-JL株，收獲病毒液；（2)加入滅活劑滅活 病毒液，濃縮；（3)制備水相和油相；（4)將水相和油相混合，乳化，即得。
5. 按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)所述擴增為采用Vero細胞 培養(yǎng)豬偽狂犬病毒PRV-幾株。
6. 按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟⑵按照質量g/體積mL計，滅 活劑與病毒液的比例為〇. 02 :100 ;所述滅活劑為二乙烯亞胺溶液；優(yōu)選的，按照質量g/體 積mL計，所述二乙烯亞胺溶液的濃度為2%。
7. 按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述濃縮優(yōu)選為濃縮5倍。
8. 按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于： 步驟（3)所述制備水相包括：將吐溫-80與濃縮后的滅活病毒液按照體積比4 :96混合 均勻； 所述制備油相包括：將白油、司本-80、硬脂酸鋁按照體積比94 :6 :1. 5混合均勻。
9. 按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（4)將水相和油相按照體積比 1 :1. 5混合均勻。
10. 權利要求4至9任何一項所述制備方法制備得到的豬偽狂犬病滅活疫苗。
【文檔編號】C12R1/93GK104388396SQ201410707320
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權日:2014年11月28日
【發(fā)明者】王全杰, 張智明, 丁國杰, 步帆, 王彬, 竇海燕, 楊朋欣, 李來旭, 張鳳強, 張祎, 馮聞迪 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司