交聯(lián)聚合固載β-葡萄糖苷酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種交聯(lián)聚合固載β-葡萄糖苷酶的方法，以β-葡萄糖苷酶為來源，經(jīng)硫酸銨沉淀、戊二醛交聯(lián)，與氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球形成酶交聯(lián)自聚體，增強(qiáng)了酶的生化性質(zhì)，并用于水解纖維二糖，大大加快了纖維二糖的水解速率。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，制備耗時(shí)短，對(duì)酶的活性影響小，水解纖維二糖快。
【專利說明】交聯(lián)聚合固載β-葡萄糖苷酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物酶的固載【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種以飽和硫酸銨為沉淀劑，戊二 醛為交聯(lián)劑，采用交聯(lián)聚合的方法制備固載β -葡萄糖苷酶。

【背景技術(shù)】
[0002] 酶作為一種天然的高分子催化劑，因具有極高的專一性、催化反應(yīng)條件溫和、催化 反應(yīng)速度快、無污染等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在食品加工、醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)中有著極為廣闊的應(yīng)用前 景。近年來，酶被人們廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)與檢測(cè)、生物傳感器、醫(yī)藥工程、環(huán)保技術(shù)、生物 技術(shù)等領(lǐng)域。但在實(shí)際應(yīng)用中，酶對(duì)環(huán)境敏感、反應(yīng)后難以回收等缺點(diǎn)限制了酶制劑產(chǎn)品的 開發(fā)和應(yīng)用，在這種情況下，固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂固定化酶是指在一定空間內(nèi)呈閉 鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。與游離酶相比，固定 化酶具有的優(yōu)點(diǎn)有：可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)利用，反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有助于提高酶的 穩(wěn)定性，酶易于與底物和產(chǎn)物分開，增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量，提高酶的使用效率， 成本降低等。
[0003] 目前關(guān)于固定化酶的方法主要有以下幾種：（1)包埋法，該方法操作步驟簡(jiǎn)單，成 本低，污染少，但是此法只適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)，且固載酶易從包埋材 料中漏出導(dǎo)致失活；（2)吸附法，其操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起酶變性或失活，且載體廉 價(jià)易得，可反復(fù)使用，但酶與載體結(jié)合不牢，極易脫落；(3)共價(jià)鍵合法，此方法研宄較為成 熟，其優(yōu)點(diǎn)是酶與載體間連接牢固，即使用高濃度底物或離子強(qiáng)度的溶液進(jìn)行反應(yīng)，也不會(huì) 導(dǎo)致酶和載體的分離，因此具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，缺點(diǎn)是反應(yīng)步驟較為繁瑣，反 應(yīng)條件較為苛刻，常常會(huì)引起酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶的活性中心受損。
[0004] 現(xiàn)有的固載技術(shù)對(duì)于β-葡萄糖苷酶的固載量、耐酸堿性、熱穩(wěn)定性以及貯存穩(wěn) 定性等性能都有提升，但對(duì)纖維二糖的水解速率卻提升不明顯。Wei等通過將β-葡萄糖 苷酶固載到功能化的二氧化鈦表面上，提高了其耐酸堿性、熱穩(wěn)定性以及貯存穩(wěn)定性，但 對(duì)纖維二糖的水解速率較低，需要水解6小時(shí)才能達(dá)到90%的水解率（Immobilization ofβ -glucosidase on mercaptopropyl-functionalized mesoporous titanium dioxide， Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013,97, 303-310) D Verma等將 β-葡 萄糖苷酶固載到磁性納米顆粒上，70°C下4小時(shí)內(nèi)酶活性仍然保留67%，但其對(duì)纖維二 糖的水解速率也較低，需要水解5小時(shí)才能達(dá)到90%左右的水解率（Immobilization of β -glucosidase on a magnetic nanoparticle improves thermostability:Application in cellobiose hydrolysis，Bioresource Technology，2013,135,2_6)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有固定化酶技術(shù)中關(guān)于酶失活所存在的 不足，提供一種以硫酸銨為沉淀劑，戊二醛為交聯(lián)劑，通過交聯(lián)固載β -葡萄糖苷酶的方 法，該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，固載效率高，酶活性損失小，且水解纖維二糖的速率高。
[0006] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：將β -葡萄糖苷酶完全溶解于20mmol/L pH值為4. 8的醋酸鈉緩沖液中，加入氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球，混合 均勻，加入沉淀劑，常溫震蕩20?40分鐘，離心洗滌，所得沉淀加入20mmol/L pH值為4. 8 的醋酸鈉緩沖液中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%戊二醛水溶液，所得混合液中戊二醛的質(zhì)量分 數(shù)為0.2%?1%，室溫震蕩1?5小時(shí)，離心洗滌，得到固載β-葡萄糖苷酶。
[0007] 上述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球與β-葡萄糖苷酶的量比 為1:0. 2?0. 8,優(yōu)選氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球與β -葡萄糖苷酶的質(zhì) 量比為1:0. 6,其中氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球的粒徑為2?5 μ m，根據(jù) 文獻(xiàn) Improved performance of a -amylase immobilized on poly (glycidyl methacryla te-co-ethylenedimethacrylate) beads (J Int Biol Macromol 2014;65:492-499)中的方 法制備而成。
[0008] 上述的β-葡萄糖苷酶與戊二醛的質(zhì)量比為1:0. 0005?0.01，優(yōu)選β-葡萄糖苷 酶與戊二醛質(zhì)量1:0. 002?0. 01。
[0009] 上述的沉淀劑為異丙醇、丙酮、飽和硫酸銨水溶液中的任意一種，優(yōu)選飽和硫酸銨 水溶液。
[0010] 上述方法中，優(yōu)選所得混合液中戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 5 %。
[0011] 本發(fā)明采用酶交聯(lián)技術(shù)，將葡萄糖苷酶與氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙 酯樹脂微球形成酶交聯(lián)自聚體，操作簡(jiǎn)單，制備耗時(shí)短，對(duì)酶的活性影響小，增強(qiáng)了酶的生 化性質(zhì)，并用于水解纖維二糖，大大加快了纖維二糖的水解速率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是70°C下固載β -葡萄糖苷酶與可溶性β -葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性對(duì)比圖。
[0013] 圖2是固載β -葡萄糖苷酶與可溶性β -葡萄糖苷酶的貯存穩(wěn)定性對(duì)比圖。
[0014] 圖3是固載β -葡萄糖苷酶的重復(fù)利用率對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限 于下述的實(shí)施例。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 1、沉淀
[0018] 將6mg|3 -葡萄糖苷酶完全溶解于ImL 20mmol/L pH值為4. 8的磷酸緩沖液中，然 后加入IOmg氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球，常溫震蕩15分鐘，再加入5mL 飽和硫酸銨水溶液，常溫震蕩30分鐘，將沉淀離心洗滌3次。
[0019] 2、交聯(lián)固載
[0020] 將步驟1離心洗滌后的沉淀加入5mL 20mmol/L pH值為4. 8的醋酸鈉緩沖液中， 再加入60 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛水溶液，常溫震蕩4小時(shí)后，離心洗滌3次，得到固 載β-葡萄糖苷酶，測(cè)得β-葡萄糖苷酶的固載率為95%、相對(duì)活性為93%。
[0021] 實(shí)施例2
[0022] 本實(shí)施例中，葡萄糖苷酶的用量變?yōu)?mg，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到固載 β -葡萄糖苷酶，測(cè)得β -葡萄糖苷酶的固載率為90%、相對(duì)活性為91 %。
[0023] 實(shí)施例3
[0024] 本實(shí)施例中，β-葡萄糖苷酶的用量變?yōu)?mg，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到固載 β -葡萄糖苷酶，測(cè)得β -葡萄糖苷酶的固載率為93%、相對(duì)活性為88%。
[0025] 實(shí)施例4
[0026] 本實(shí)施例中，β-葡萄糖苷酶的用量變?yōu)?mg，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到固載 β -葡萄糖苷酶，測(cè)得β -葡萄糖苷酶的固載率為98%、相對(duì)活性為78%。
[0027] 實(shí)施例5
[0028] 在實(shí)施例1中，所用的飽和硫酸銨水溶液用等體積的異丙醇替換，其他步驟與實(shí) 施例1相同，得到固載β-葡萄糖苷酶，測(cè)得β-葡萄糖苷酶的固載率為75%、相對(duì)活性為 90%〇
[0029] 實(shí)施例6
[0030] 在實(shí)施例1的交聯(lián)固載步驟2中，震蕩時(shí)間縮短至3小時(shí)，其他步驟與實(shí)施例1相 同，得到固載葡萄糖苷酶，測(cè)得葡萄糖苷酶的固載率為78%。
[0031] 實(shí)施例7
[0032] 在實(shí)施例1的交聯(lián)固載步驟2中，震蕩時(shí)間延長(zhǎng)至5小時(shí)，其他步驟與實(shí)施例1相 同，得到固載葡萄糖苷酶，測(cè)得葡萄糖苷酶的固載率為85%。
[0033] 實(shí)施例8
[0034] 在實(shí)施例1中的步驟1中，所用的飽和硫酸銨水溶液用等體積的丙酮替換，在實(shí)施 例1的步驟2中，震蕩時(shí)間延長(zhǎng)至5小時(shí)，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到固載β -葡萄糖 苷酶，測(cè)得β -葡萄糖苷酶的固載率為92%、相對(duì)活性為60%。
[0035] 實(shí)施例9
[0036] 在實(shí)施例8中，所用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的戊二醛水溶液用等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的戊二醛水溶液替換，其他步驟與實(shí)施例7相同，得到固載β-葡萄糖苷酶，測(cè)得β-葡萄 糖苷酶的固載率為99%、相對(duì)活性為99%。
[0037] 實(shí)施例10
[0038] 在實(shí)施例8中，所用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5 %的戊二醛水溶液用等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 2 %的戊二醛水溶液替換，其他步驟與實(shí)施例7相同，得到固載β -葡萄糖苷酶，測(cè)得 β -葡萄糖苷酶的固載率為85%、相對(duì)活性為85%。
[0039] 為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人對(duì)實(shí)施例1得到的固載葡萄糖苷酶的性 能進(jìn)行了測(cè)試，具體測(cè)試方法如下：
[0040] 1、動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
[0041] 將可溶性β-葡萄糖苷酶在pH值為5.0、溫度為50°C，固載β-葡萄糖苷酶在pH 值為5. 5、溫度為60°C，底物濃度均為0. 5?50mmol/L下分別測(cè)量心與Vmax。實(shí)驗(yàn)測(cè)得可溶 性β-葡萄糖苷酶與固載β-葡萄糖苷酶的K m分別為11·97μπι〇1/1和7·67μπι〇1/1，Vmax 分別為〇· 314 μ mol · mL 1 · min 1和0· 639 μ mol · mL 1 · min \證明了固載β -葡萄糖苷酶 具有比可溶性β-葡萄糖苷酶更高的催化活性。
[0042] 2、熱穩(wěn)定性測(cè)定
[0043] 將可溶性β -葡萄糖苷酶與固載β -葡萄糖苷酶在70°C、pH值為4. 8的醋酸鈉緩 沖液中靜置10小時(shí)，間隔測(cè)量酶活性。由圖1可知，可溶性β -葡萄糖苷酶在1小時(shí)之內(nèi) 失去全部活性，固載β -葡萄糖苷酶3小時(shí)和5小時(shí)后仍然保留了 70%和50%的活性。
[0044] 3、貯存穩(wěn)定性測(cè)定
[0045] 將可溶性β -葡萄糖苷酶與固載β -葡萄糖苷酶在4°C、pH值為4. 8的醋酸鈉緩 沖液中貯存60天，間隔測(cè)量酶活性。由圖2可知，放置9天后，可溶性β-葡萄糖苷酶失去 了 70 %的活性，固載β -葡萄糖苷酶保持95%的活性；放置45天后，可溶性β -葡萄糖苷 酶無活性，固載β -葡萄糖苷酶的活性仍然保持在95%左右。
[0046] 4、重復(fù)利用率測(cè)定
[0047] 將固載β-葡萄糖苷酶在60 °C、pH值為4. 8的醋酸鈉緩沖液中與4-硝基苯 基-β -D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)5分鐘，離心后取上清液測(cè)量酶活性。之后離心分離固載 β -葡萄糖苷酶，再加入新的4-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷與之反應(yīng)。此過程重復(fù)9 次。由圖3可以看出，固載β -葡萄糖苷酶在9次連續(xù)反應(yīng)之后保持了 90%的活性，保持了 較高的催化活性。
[0048] 為了進(jìn)一步證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用實(shí)施例1?10得到的固載葡 萄糖苷酶進(jìn)行纖維二糖的水解，具體試驗(yàn)方法如下：
[0049] 將可溶性β -葡萄糖苷酶（以下簡(jiǎn)稱可溶性酶）和固載β -葡萄糖苷酶分別與纖 維二糖在60°C下反應(yīng)5小時(shí)，控制β -葡萄糖苷酶與纖維二糖的質(zhì)量比為1:10,間隔30分 鐘測(cè)量纖維二糖的水解率，測(cè)試結(jié)果見表1。
[0050] 表1纖維二糖水解試驗(yàn)結(jié)果
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種交聯(lián)聚合固載e -葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：將e -葡萄糖苷酶完全溶 解于20mmol/L pH值為4. 8的醋酸鈉緩沖液中，加入氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯 樹脂微球，混合均勻，加入沉淀劑，常溫震蕩20?40分鐘，離心洗滌，所得沉淀加入20mmol/ L pH值為4. 8的醋酸鈉緩沖液中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %戊二醛水溶液，所得混合液中戊 二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%?1%，室溫震蕩1?5小時(shí)，離心洗滌，得到固載0-葡萄糖苷 酶； 上述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球與葡萄糖苷酶的量比為 1:0. 2?0.8, 0-葡萄糖苷酶與戊二醛的質(zhì)量比為1:0. 0005?0.01 ;其中沉淀劑為異丙 醇、丙酮、飽和硫酸銨水溶液中的任意一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合固載0 _葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的 氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球與葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為1:0.6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的交聯(lián)聚合固載0 -葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所 述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂微球的粒徑為2?5 ym。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合固載0 _葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的 0-葡萄糖苷酶與戊二醛質(zhì)量1:0. 002?0.01。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合固載0 _葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所得混 合液中戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 5%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合固載0 _葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的 沉淀劑為飽和硫酸按水溶液。
【文檔編號(hào)】C12N11/08GK104480096SQ201410706930
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】張志琪, 賀天, 張婧 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)