一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-10b聯(lián)合檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了一種用于檢測血漿或血清中的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d及hsa-mir-10b的含量，來預(yù)測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的試劑或試劑盒、及其相應(yīng)的檢測方法。本發(fā)明為早期診斷肝癌的發(fā)生、預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移提供了新的手段，以便盡早進(jìn)行臨床干預(yù)，防止病情進(jìn)展，改善患者預(yù)后。
【專利說明】-種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mi r-135a、 hsa-m i r-302d和hsa-m i r-1 Ob聯(lián)合檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種用于檢測血漿或血清中的 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d及hsa-mir-10b的含量，來預(yù)測肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的試劑盒、及 其檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌嚴(yán)重威脅是我國人民生活健康的疾病之一，其致死率位居第三位。全世界每 年因肝癌死亡的患者中，約有40%來自中國。隨著治療方法和影像檢測技術(shù)水平的提高，早 期肝癌根治切除術(shù)后的五年生存率已大大提高。然而，由于大部分的肝癌患者在確診的時(shí) 候已經(jīng)處于晚期，肝癌患者的整體治療效果及病人預(yù)后都比較差。
[0003] 另外，在肝癌的治療過程中，癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是比較常見問題。大約90%的肝癌 死亡患者跟癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)。目前臨床應(yīng)用多種治療手段（手術(shù)切除、放療，化療及 聯(lián)合治療方法），仍無法徹底解決腫瘤治療中存在的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題。秉承早發(fā)現(xiàn)早治療 的原則，及早發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，對于改善患者預(yù)后，提高臨床治療效果至關(guān)重要。
[0004] 目前對于肝癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查、病理活檢結(jié)合甲胎蛋白（AFP)等分子 指標(biāo)檢測能夠反應(yīng)早期肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的檢測指標(biāo)還未有臨床應(yīng)用。
[0005] microRNA (miRNA)是一類長度約21?25堿基的非編碼小分子RNA，廣泛存在于 多細(xì)胞生物和病毒體內(nèi)。目前越來越多的研究顯示，miRNA廣泛參與了生物體多種生理 過程，其表達(dá)改變及功能失調(diào)能夠?qū)е履[瘤發(fā)生、白血病以及病毒感染等多種病理現(xiàn)象。 由于在血漿和血清中穩(wěn)定性好且表達(dá)具有組織特異性（Calin G A, Croce M C. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 2006, 6 (11) :857-866)，miRNA 在疾病的 血清學(xué)檢測應(yīng)用方便的到廣泛的關(guān)注。
[0006] 目前，諸多報(bào)道患者血清中miRNA能夠患者疾病診斷及預(yù)后分析的標(biāo)志分子。 Zhang ZQ等人報(bào)道肝癌患者外周血清中miR-143和miR-215能夠作為肝炎及肝癌的診 斷標(biāo)志物（Zhang ZQ，Meng H，Wang N，Liang LN，Liu LN, et al. Serum microRNA 143and microRNA 215as potential biomarkers for the diagnosis of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Diagn Pathol. 2014. 9:135)。Shen J 等人報(bào)道患者血清 中miR_148b和miR-133能夠作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物（Shen J，Hu Q，Schrauder M，Yan Lj Wang D，et al. Circulating miR_148b and miR_133a as biomarkers for breast cancer detection. Oncotarget 2014. 5:5284-5294)。另外，在前列腺癌、肺癌及結(jié)腸癌等 癌癥中都有不同的血清miRNA可以作為檢測標(biāo)記物（Cheng G. Circulating miRNAs:Roles in cancer diagnosis,prognosis and therapy.Adv Drug Deliv Rev 2014Sepl6. pii:S0169-409X(14) 00199-9)。說明血清miRNA作為腫瘤檢測標(biāo)志物的廣泛性。
[0007] 目前研究報(bào)道 miR-135a(Mature sequence MIMT0000428)參與了前列腺癌， 乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。KiOiss A等報(bào)道m(xù)iR-135a通過抑制R0CK1 和R0CK2的表達(dá)調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移（Kroiss A，Vincent S，Decaussin_Petrucci M，Meugnier E，Viallet J，et al. Androgen-regulated microRNA_135a decreases prostate cancer cell migration and invasion through downregulating ROCKland R0CK2. Oncogene. 2014)。Chen Y等報(bào)道m(xù)iR-135a通過調(diào)控H0XA10促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn) 移（Chen Yj Zhang Jj Wang Hj Zhao J，Xu C，et al. miRNA-135a promotes breast cancer cell migration and invasion by targeting HOXA10. BMC Cancer 2012.12:111)。發(fā) 明人早期研究發(fā)現(xiàn)miR-135a通過調(diào)控MTSSl促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移（Liu S，Guo W，Shi J，Li N，Yu X，et al. MicroRNA-135a contributes to the development of portal vein tumor thrombus by promoting metastasis in hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2012.56:389-396.)〇
[0008] miR-302d (Mature sequence MIMT 0000718)主要在胚胎干細(xì)胞中 表達(dá)(Li SSj Yu SL，Kao LPj Tsai ZY，Singh S，et al. Target identification of microRNAs expressed highly in human embryonic stem cells.J Cell Biochem. 2009. 106:1020-1030.)，能夠通過抑制 CDKNlA and CCL5 的表達(dá)促進(jìn) 間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、抑制其凋亡（Kim JY，Shin KK，Lee AL, Kim YS，Park HJ，et al. MicroRNA-302induces proliferation and inhibits oxidant-induced cell death in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cell Death Dis. 2014. 5:el385)。
[0009] miR-lOb (Mature sequence MIMT 0000254)調(diào)控不同的下游祀基因能夠促進(jìn)卵 巢癌細(xì)胞（Nakayama I，Shibazaki M，Yashima-Abo A，Miura F，Sugiyama T，et al. Loss of HOXDIOexpression induced by upregulation of miR-10b accelerates the migration and invasion activities of ovarian cancer cells. Int J Oncol. 2013. 43:63-71)和膠 質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移（Liu S，Sun J，Lan Q. TGF-beta-induced miRlOa/b expression promotes human glioma cell migration by targeting PTEN. Mol Med Rep 2013.8:1741-1746)。
[0010] 目前尚未見miR-302d與癌癥的發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，更未見應(yīng)用 miR-135a、miR-302d和miR-lOb聯(lián)合檢測來預(yù)測肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于尋找到能夠有效用于肝癌發(fā)生診斷、肝癌預(yù)后判斷的一組特異 性分子標(biāo)記物。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種特異性和敏感性都極好的早期檢測肝癌發(fā)生或 轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒。
[0013] 本發(fā)明的第三目的在于提供一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測方法。
[0014] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：
[0015] 本發(fā)明通過健康人群與肝癌患者血清中hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和hsa-mir-10b的含量比較；肝癌無癌栓患者與肝癌伴癌栓患者血中 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb的含量比較，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中 hsa-mil'-lSSa/SOSd/lOb三條miRNA分子的含量明顯高于健康人群，肝癌伴癌栓患者血清 中hsa-mir-135a/302d/10b三條miRNA分子的含量高于肝癌無癌栓患者。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn) 了 miR-302d與肝癌的發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)。
[0016] 進(jìn)一步地，本發(fā)明同時(shí)運(yùn)用 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d、hsa-mir-lOb 這三條 miRNA分子單獨(dú)檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移，以及聯(lián)檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示單獨(dú)采用三個(gè) 分子的檢測肝癌發(fā)生敏感性分別為0. 65、0. 59、0. 63,單獨(dú)檢測肝癌轉(zhuǎn)移即癌栓發(fā)生的敏感 性分別為0. 58、0. 68、0. 66。hsa-mir-135a/302d/10b三條miRNA分子聯(lián)合檢測肝癌發(fā)生的 敏感性為0. 81，檢測肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的敏感性為0. 85,均高于單個(gè)分子檢測。
[0017] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示外周血hsa-mir_135a/302d/10b三條miRNA分子的含量 在健康人群、肝癌患者、肝癌伴癌栓患者中呈現(xiàn)依次升高的趨勢。三個(gè)miRNA在外周血中含 量可以作為肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的早期檢測手段，三個(gè)分子一致升高作為聯(lián)合檢測指標(biāo)，能夠 增加該試劑盒檢測的特異性。單獨(dú)miRNA分析檢測敏感性較低，容易導(dǎo)致陽性患者漏診，三 個(gè)分子聯(lián)合檢測敏感性較高，減少了漏診患者。
[0018] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物，該分子 標(biāo)記物為 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d 和 hsa-mir-10b。
[0019] hsa-mir-135a 成熟體序列：UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG(SEQ ID N0:1)
[0020] hsa-mir-302d 成熟體序列：UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU(SEQ ID N0:2)
[0021] hsa-mir-10b 成熟體序列：UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG(SEQ ID NO :3)
[0022] 即，本發(fā)明提供了 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和 hsa-mir-lOb 在制備檢測肝癌 發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0023] 所述的檢測試劑，為檢測生物樣品中hsa-mir_135a含量、hsa-mir_302d含量，和 hsa-mir-10b含量的試劑的組合。
[0024] 所述的試劑盒，包含了檢測生物樣品中hsa-mir_135a含量的試劑、hsa-mir_302d 含量的試劑，和hsa-mir-10b含量的試劑。
[0025] 所述的檢測生物樣品中hsa-mir_135a含量的試劑，選自：對hsa-mir_135a具有檢 測特異性的PCR引物等。
[0026] 所述的檢測生物樣品中hsa-mir_302d含量的試劑，選自：對hsa-mir_135a具有檢 測特異性的PCR引物等。
[0027] 所述的檢測生物樣品中hsa-mir-10b含量的試劑，選自：對hsa-mir_135a具有檢 測特異性的PCR引物等。
[0028] 所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細(xì)胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織或細(xì)胞、血液或體液。較佳地，為血漿或血清。
[0029] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a、 hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb聯(lián)合檢測試劑盒。
[0030] 本發(fā)明的試劑盒也稱為hsa-mir_135a/302d/10b聯(lián)合檢測試劑盒，該試劑盒是通 過檢測血楽或血清中hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b的含量的變化，檢測早 期肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移，以便盡早采取干預(yù)措施或藥物治療，防止肝癌的進(jìn)一步發(fā)展。
[0031] 本發(fā)明的早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a/302d/10b聯(lián)合檢測試劑盒， 是由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、引物系統(tǒng)和擴(kuò)增系統(tǒng)組成。
[0032] 所述的引物系統(tǒng)由通用的反轉(zhuǎn)錄引物及通用實(shí)時(shí)定量PCR引物和三條特異性實(shí) 時(shí)定量PCR引物組成，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的引物系統(tǒng)具體為：
[0033] 通用的反轉(zhuǎn)錄引物序列：TGCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTT TTTTTTTTT(SEQ ID NO:4)；
[0034] 通用實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TGCTGTCAACGATACGCTACG(SEQ ID N0:5);
[0035] 三條特異性實(shí)時(shí)定量PCR引物：
[0036] hsa-mir-l35a 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TATGGCTTTTTATTCCTATGTG(SEQ ID NO:6)
[0037] hsa-mir_3〇2d特異實(shí)時(shí)定量PCR 引物：TAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGT(SEQ ID NO:7)
[0038] hsa-mir-10b 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG(SEQ ID N0:8)。
[0039] 本發(fā)明試劑盒的引物是根據(jù)已知的生物信息學(xué)查得hsa-mir_135a/302d/10b的 成熟體序列而設(shè)計(jì)的（詳見http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)，實(shí)時(shí)定量PCR 引物均通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。
[0040] 本發(fā)明的試劑盒中，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域的常規(guī)選擇。
[0041] 所述的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成；
[0042] 所述的擴(kuò)增系統(tǒng)由SYBR Premix Ex TaqTM試劑組成。
[0043] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒，具體組成如下：
[0044] A)反轉(zhuǎn)錄引物（SEQ ID NO: 4)，1 管，濃度：10 μ M，100 μ 1/ 管；
[0045] Β)實(shí)時(shí)定量 PCR 通用引物（SEQ ID N0:5)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0046] miR-135a 特異引物（SEQ ID N0:6)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0047] miR-302d 特異引物（SEQ ID N0:7)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0048] miR-lOb特異引物（SEQ ID N0:8)，l 管，濃度：10μΜ，100μ1/管；
[0049] C) Trizol reagent (總 RNA 提取試劑），1 管，2ml/ 管
[0050] D)氯仿 1 管，500 μ 1/管；
[0051] Ε)異丙醇 1 管，I. 500ml/ 管
[0052] F)無水乙醇 1管，7ml/管；
[0053] G)DEPC H20(經(jīng)焦炭酸乙二酯處理的純水）1管，Iml/管
[0054] H)dd H20(雙蒸水）1 管，2ml/管。
[0055] 本發(fā)明還提供了上述hsa-mir-135a/302d/10b檢測試劑盒在肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診 斷中的應(yīng)用。
[0056] 使用本發(fā)明試劑盒檢測早期肝癌發(fā)生或者轉(zhuǎn)移，檢測健康人血清中 hsa-mir-135a/302d/10b的含量作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。再用相同的方法檢測未知患者血清中 hSa-mir-135a/302d/10b含量，對照上述標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，即可初步確定該患者是否發(fā)生肝癌或轉(zhuǎn) 移，以便作進(jìn)一步檢查確診。
[0057] 本發(fā)明的第三方面，提供了利用上述的早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b聯(lián)合檢測試劑盒的檢測方法。
[0058] 所述的檢測方法具體為：按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血 清或血漿，加氯仿離心后取上層水相，經(jīng)異丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血漿中的小 RNA ;由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄小RNA成cDNA ;用擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，測定 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d 和 hsa-mir-10b 的含量。
[0059] 本發(fā)明所述的早期檢測，是指在患者鏡下微癌栓（但影像學(xué)不能檢測到）或出現(xiàn) 肉眼癌栓之前。
[0060] 本發(fā)明通過臨床收集肝癌無癌栓確診患者（45例）和肝癌伴癌栓確診患者（35 例）外周血，用上述檢測方法檢測血清中hsa-mir-135a/302d/10b的含量。統(tǒng)計(jì)分析評價(jià) 單個(gè)分子檢測及三個(gè)分子聯(lián)合檢測效能。如表1所示，hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和 hsa-mir-10b這三個(gè)分子聯(lián)合檢測敏感性及特異性均高于單個(gè)分子單獨(dú)檢測。
[0061] 本發(fā)明通過檢測血漿或血清中的hsa-mir_135a/302d/10b含量的變化，檢測早期 肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移，以便盡早進(jìn)行臨床干預(yù)，防止病情進(jìn)展，改善患者預(yù)后。本發(fā)明為早期診 斷肝癌及轉(zhuǎn)移的發(fā)生、改善肝癌的預(yù)后提供了新的手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1 :健康人和肝癌確診患者血清hsa-mir_135a/302d/10b含量檢測；
[0063] 圖2 :肝癌無癌栓確診患者和肝癌伴癌栓確診患者血清hsa-mir_135a/302d/10b 含量檢測；
[0064] 圖3 :健康人、肝癌無癌栓確診患者和肝癌伴癌栓確診患者血清 hsa-mir-135a/302d/10b 含量比較；
[0065] 圖4 :疑似肝癌伴癌栓血清hsa-mir_135a/302d/10b含量檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0067] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0068] 實(shí)施例1 :制備本發(fā)明的試劑盒（供一人用）
[0069] 本發(fā)明的試劑盒組成如下：
[0070] 1)反轉(zhuǎn)錄引物（SEQ ID NO: 4)，1 管，濃度：10 μ M，100 μ 1/ 管；
[0071] 2)實(shí)時(shí)定量 PCR 通用引物（SEQ ID N0:5)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0072] miR-135a 特異引物（SEQ ID N0:6)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0073] miR-302d 特異引物（SEQ ID N0:7)，l 管，濃度：10μΜ，100μ 1/管；
[0074] miR-lOb特異引物（SEQ ID N0:8)，l 管，濃度：10μΜ，100μ1/管；
[0075] 3) Trizol reagent (總 RNA 提取試劑），1 管，2ml/ 管
[0076] 4)氯仿 1 管，500 μ 1/管；
[0077] 5)異丙醇 1 管，1.500ml/管
[0078] 6)無水乙醇 1管，7ml/管；
[0079] 7)DEPC H20(經(jīng)焦炭酸乙二酯處理的純水）1管，Iml/管
[0080] 8)dd H20(雙蒸水）1 管，2ml/管。
[0081] 本發(fā)明根據(jù)已知的生物信息學(xué)查得hsa-mir_135a成熟體序 列：UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG(SEQ ID N0:l);hsa-mir-302d成熟體序 列：UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU(SEQ ID N0:2);hsa-mir-10b 成熟體序列： UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG (SEQ ID NO: 3)，反轉(zhuǎn)錄引物及實(shí)時(shí)定量PCR引物均通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由美國invitrogen公司負(fù)責(zé)引物合成。
[0082] 設(shè)計(jì)的引物序列如下：
[0083] 1)通用反轉(zhuǎn)錄引物序列：TGCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTT TTTTTTTTTT(SEQ ID NO:4)
[0084] 2)通用實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TGCTGTCAACGATACGCTACG(SEQ ID N0:5)
[0085] 3)hsa-mir-135a 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TATGGCTTTTTATTCCTATGTG(SEQ ID NO :6)
[0086] hsa-mir_3〇2d特異實(shí)時(shí)定量PCR 引物：TAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGT(SEQ ID NO:7)
[0087] hsa-mir-10b 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物：TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG(SEQ ID N0:8)
[0088] 制備包括下列組成成分的試劑盒：總RNA提取試劑（Invitrogen公司）、氯仿、 異丙醇、無水乙醇、通用反轉(zhuǎn)錄引物（100μ 1/管濃度：10μ M)、通用實(shí)時(shí)定量PCR引物 (1〇〇μ 1/管濃度：10yM)、miRNA特異性引物（100μ 1/管濃度：10yM)、DEPC Η20(1000μ 1/ 管）、ddH20 (2000 μ 1/ 管）
[0089] DEPC H20的配置：用購買的DEPC(焦碳酸二乙酯），純度>99%，密度為I. 12g/ml， 配置DEPC H20。IOOmlMiliQ純水中加0. lmlDEPC，放在100ml干烤過的容量瓶中靜置4小 時(shí)后高壓滅菌，制成千分之一濃度的DEPC H20,經(jīng)檢測不含RNase、DNase和proteinase。 用來溶解合成的反轉(zhuǎn)錄引物，并作為反轉(zhuǎn)錄時(shí)的稀釋用水。
[0090] dd H20的配置：MiliQ純水經(jīng)高壓滅菌后，配置成實(shí)時(shí)定量PCR用的dd H20。
[0091] 通用反轉(zhuǎn)錄引物：由美國invitrogen公司負(fù)責(zé)引物合成，純度為PAGE級，合成后 的引物用DEPC H20溶解，終濃度為10 μ M。
[0092] 通用實(shí)時(shí)定量PCR引物：通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由美國invitrogen公 司負(fù)責(zé)引物合成，純度為PAGE級，合成后的引物用dd H20溶解，終濃度為10μΜ。
[0093] 特異性實(shí)時(shí)定量PCR引物：通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由美國invitrogen 公司負(fù)責(zé)引物合成，純度為PAGE級，合成后的引物分別用dd H20溶解，終濃度為10μΜ。
[0094] 實(shí)施例2 :實(shí)施例1的試劑盒的檢測方法
[0095] 一、采集血清樣本及樣本準(zhǔn)備：
[0096] 由于血清具有取材方便、無創(chuàng)傷性、連續(xù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，從血清中檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn) 移的生物標(biāo)志物可以及早檢測發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生或轉(zhuǎn)移，將肝癌診斷提高到一個(gè)新的水平。
[0097] 血漿樣本在上海東方肝膽外科醫(yī)院采集：40例肝癌無癌栓患者、40例肝癌伴癌栓 患者、20例健康志愿者。樣品收集：收集約3?6ml病人的外周血放入含360 μ I EDTA的 抗凝管中，顛倒混勻，靜置約半小時(shí)，離心取上清得到血漿；收集約3?6ml病人的外周血放 入真空促凝管中，顛倒數(shù)次以便充分結(jié)合，靜置約半小時(shí)，1600g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到新 管。上清二次進(jìn)行12000g離心10min，取上清，加入新離心管中得到血清。
[0098] 二、采集血漿樣本的處理及提取其中的小RNA :
[0099] (1)血清中按照血楽：Trizol reagent = 0· 4:1 比例，加入 Trizol reagent LS(Invitrogen公司購買），劇烈搖晃混勻。
[0100] ⑵樣本放置冰上15min，1000g，4°C離心10min，取上清到新的離心管；每管加入 200μ 1氯仿，搖晃混勻，放置冰上10min，12000g、4°C離心15min，取上層水相；加500μ 1異 丙醇，輕輕搖勻5-6次，-20°C放置lh，12000g 4°C離心10min，離心后在管底出現(xiàn)白色沉淀， 棄上清；沉淀加 Iml 75 %乙醇洗漆，7500g 4°C離心5min，棄上清；沉淀室溫瞭干，加適量預(yù) 溫的DEPC水溶解。使用Eppendorf紫外分光光度儀測定RNA的A260值和A260/A280的比 值（1.8-2. 2)，以評估其濃度和質(zhì)量。符合定量檢測要求的樣本進(jìn)行下一步反應(yīng)。
[0101] 三、miRNA的實(shí)時(shí)定量
[0102] I. miRNA 加尾及反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行。
[0103] I)按照如下體系配制反轉(zhuǎn)錄體系：
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物，其特征在于，該分子標(biāo)記物為 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和 hsa-mir-10b〇 2. hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-10b在制備檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制備檢測 肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測試劑為檢測生物 樣品中hsa-mir_135a含量、hsa-mir_302d含量，和hsa-mir-10b含量的試劑的組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制備檢測 肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑盒包含了檢測生 物樣品中hsa-mir_135a含量的試劑、hsa-mir_302d含量的試劑，和hsa-mir-10b含量的試 劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制備 檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測生物樣品中 hsa-mir_135a含量的試劑、hsa-mir_302d含量的試劑，和hsa-mir-10b含量的試劑，選自： 對 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 或 hsa-mir-lOb 具有檢測特異性的 PCR 引物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制備 檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的生物樣品選自：獲 自對象的新鮮組織或細(xì)胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組織或細(xì)胞、血液或體液。
7. 一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-lOb聯(lián)合 檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含了檢測血楽或血清中hsa-mir-135a含量的試劑、 hsa-mir_302d含量的試劑，和hsa-mir-10b含量的試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d和hsa-mir-10b聯(lián)合檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒是由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、弓丨 物系統(tǒng)和擴(kuò)增系統(tǒng)組成，所述的引物系統(tǒng)包括： 通用的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO:4所示； 通用實(shí)時(shí)定量PCR引物如SEQ ID NO: 5所示； hsa-mir-135a特異實(shí)時(shí)定量PCR引物如SEQ ID N0:6所示； 1^31111-302(1特異實(shí)時(shí)定量？〇?引物如3￡0 10勵(lì):7所示；hsa-mir-10b特異實(shí)時(shí)定量PCR引物如SEQ ID NO:8所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d和hsa-mir-10b聯(lián)合檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒，包含如下試劑： A) 通用的反轉(zhuǎn)錄引物序列（SEQ ID N0:4)，l管，濃度：10^，100111/管； B) 通用實(shí)時(shí)定量PCR引物（SEQ ID N0:5)，l管，濃度：1〇11]?，10〇111/管；hsa-mir-135a 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物（SEQ ID N0:6)，l 管，濃度：10iiM，100ii 1/管； hsa-mir-302d 特異實(shí)時(shí)定量 PCR 引物（SEQ ID N0:7)，l 管，濃度：10iiM，100iil/管； hsa-mir-10b特異實(shí)時(shí)定量 PCR引物（SEQ IDN0:8)，1 管，濃度：1〇11]?，10〇111/管； C) 總 RNA 提取試劑 Trizol reagent, 1 管，2ml/ 管； D) 氯仿，1管，500ia/管； E) 異丙醇，1管，1.500ml/管； F) 無水乙醇，1管，7ml/管； G) DEPC H20,1 管，lml/ 管； H) dd H20,1 管，2ml/ 管。
10. -種利用如權(quán)利要求7至9任一所述的早期檢測肝癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b聯(lián)合檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于， 所述的檢測方法為：按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿，加氯 仿離心后取上層水相，經(jīng)異丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血漿中的小RNA;由反轉(zhuǎn)錄 系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄小RNA成cDNA ;用擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，測定hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d 和 hsa-mir-lOb 的含量。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404150SQ201410707798
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】劉善榮, 程樹群, 劉淑鵬, 王錄美, 李明星, 郭衛(wèi)星, 余喜亞, 徐貴霞 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)