一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法和裝置。這種方法和裝置是以十字通道上引入輔助聚焦通道的微流控芯片為操作平臺(tái)，以芯片通道末端五個(gè)寬貯液池中一定體積比的樣品或電泳緩沖液提供的靜壓力和四路程控直流電壓提供的電動(dòng)為流體操控手段,來(lái)實(shí)現(xiàn)微流控芯片上多個(gè)微通道內(nèi)樣品和試劑的平行化處理、皮升級(jí)進(jìn)樣體積控制和連續(xù)進(jìn)樣操作。特別是，所公開(kāi)的這種方法和裝置，不僅可以提供微流控芯片上一次單細(xì)胞進(jìn)樣的3步操作即細(xì)胞上樣、單細(xì)胞裝載/捕獲、單細(xì)胞溶膜及電泳分離，而且一次進(jìn)樣完成后，自動(dòng)重復(fù)上述3步操作，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣。
【專利說(shuō)明】一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法及裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于單細(xì)胞分析【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種可以提供微流控芯片上"細(xì)胞上樣、單 細(xì)胞捕獲/裝載、單細(xì)胞溶膜和胞內(nèi)組分電泳分離"等操作的進(jìn)樣方法和裝置，尤其涉及一 種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法和裝置。

【背景技術(shù)】：
[0002] 單細(xì)胞定量分析是一類在單個(gè)細(xì)胞尺度上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞進(jìn)樣、多參數(shù)測(cè)量和胞內(nèi)組 分信息定量獲取的全新實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)展與完善，不僅可以在單細(xì)胞層面、分子水平 上為生命科學(xué)、醫(yī)藥健康等學(xué)科的分析和研究提供重要的技術(shù)支撐，而且可以為生命奧妙 的詮釋以及疾病機(jī)制與診療手段的探索提供全新的信息，從根本上推動(dòng)疾病早期診斷、新 藥創(chuàng)制等相關(guān)領(lǐng)域的跨越式發(fā)展。
[0003] 單細(xì)胞進(jìn)樣作為單細(xì)胞定量分析不可或缺的關(guān)鍵步驟，其作用是從群體細(xì)胞中 精確捕獲單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，將其受控裝載/送入分離通道或預(yù)定位點(diǎn)，并完成觀測(cè)、溶膜、電 泳分離等操作。良好的進(jìn)樣方法除了包括對(duì)分析結(jié)果重要影響的因素如超小體積（單細(xì) 胞）樣品的獲取與進(jìn)樣體積的可控、連續(xù)進(jìn)樣與較高通量等特征外，進(jìn)樣方法的簡(jiǎn)單、可重 復(fù)、易于其他操作集成等特征不能忽視。
[0004] 受細(xì)胞尺度小、受試進(jìn)樣體積下降、檢測(cè)精度和分析速度提升等條件的限制，目前 用于單細(xì)胞分析研究的進(jìn)樣操作還高度依賴于傳統(tǒng)的生命化學(xué)分析手段和操作者的細(xì)致 程度。例如顯微鏡下的微管吸吮、光鑷、磁鑷、膜片鉗及流式細(xì)胞術(shù)等。這些操作雖然可行， 但是缺點(diǎn)明顯：（1)大量的操作都是在開(kāi)放環(huán)境中進(jìn)行，操作過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，極難進(jìn)行樣品污 染的控制，而對(duì)于單細(xì)胞定量分析而言，由于樣品量極少，極其微量的污染將導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié) 果錯(cuò)誤；（2)大多數(shù)操作存在細(xì)胞樣品與試劑操作的不平行現(xiàn)象，不僅減緩了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，而 且很難保證單細(xì)胞進(jìn)樣與樣品進(jìn)樣體積的操控精度；（3)大量的耗時(shí)操作，不僅導(dǎo)致實(shí)驗(yàn) 通量無(wú)法上升，同時(shí)還導(dǎo)致很多對(duì)操作時(shí)間要求較高的實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)；(4)盡管流式細(xì)胞 術(shù)能對(duì)完整的細(xì)胞進(jìn)行快速檢測(cè)和分類，但由于不能對(duì)單細(xì)胞內(nèi)的組分進(jìn)行電泳分離，難 以得到精確的定量信息；（5)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)器具不僅需要較大的受試細(xì)胞樣本，而且很難適 合干細(xì)胞、元祖細(xì)胞等珍稀樣本，導(dǎo)致較高的空載率以及假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果的較大系統(tǒng) 誤差，使得精細(xì)的定量結(jié)果掩蓋在設(shè)備帶來(lái)的噪音中。
[0005] 微流控技術(shù)作為近年來(lái)能夠精確操控微尺度生化流體的一種新興手段，其微米 級(jí)的通道尺度與細(xì)胞直徑具有良好的相符性，為實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的操縱和微環(huán)境調(diào)控提供了 極為便捷的條件，因而該技術(shù)已成為單細(xì)胞進(jìn)樣與定量分析研究的重要手段。微流控單 細(xì)胞進(jìn)樣通常包括微流控芯片上的"細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲/裝載、單細(xì)胞溶膜及電泳分 離"等多步復(fù)雜操作。迄今為止，微流控單細(xì)胞進(jìn)樣按進(jìn)樣策略可以分為：（1)閥控泵進(jìn) 樣（Science. 2007, 315, 81-84.); (2)電動(dòng)進(jìn)樣，主要模式有簡(jiǎn)單進(jìn)樣（J. Chromatogr. A，2005, 1063, 227 - 233.)、夾流進(jìn)樣（J. Chromatogr. A. 2009, 1216, 6746 - 6751.)和門 式進(jìn)樣（Lab Chip, 2011，11，1144 - 1150.); (3)負(fù)壓進(jìn)樣（Lab Chip, 2010, 10, 1472 - 1475.) ; (4)壓力結(jié)合電動(dòng)的進(jìn)樣（Electrophoresis 2010, 31，1630 - 1636.)。閥控泵進(jìn) 樣需要機(jī)械微泵驅(qū)動(dòng)細(xì)胞流體，外部氣泵與芯片上多個(gè)微閥的聯(lián)動(dòng)來(lái)控制單細(xì)胞的捕獲和 溶膜。這類方法的不足為：所用芯片加工復(fù)雜，方法實(shí)施高度依賴于復(fù)雜操作，并不適合大 規(guī)模的商業(yè)化使用。電動(dòng)進(jìn)樣通過(guò)切換施加到芯片液池上的電壓，可以在簡(jiǎn)單"十字"或雙 "T"結(jié)構(gòu)芯片上完成細(xì)胞上樣、單個(gè)細(xì)胞的捕獲、溶膜及電泳分離。這類方法簡(jiǎn)便靈活、易于 與芯片耦合和整個(gè)儀器系統(tǒng)的小型化；但是電動(dòng)進(jìn)樣也存在樣品歧視效應(yīng)，同時(shí)過(guò)高的電 壓（電場(chǎng)強(qiáng)度）會(huì)造成細(xì)胞樣品的不可逆損傷。負(fù)壓進(jìn)樣利用施加到"十"字芯片樣品廢 液端（SW)和緩沖液廢液端（BW)的負(fù)壓，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞上樣和單細(xì)胞裝載。該類方法可以在一 定程度上解決電動(dòng)進(jìn)樣中樣品歧視效應(yīng)的問(wèn)題，但其控制進(jìn)樣體積的能力有限，方法實(shí)施 依賴于多個(gè)儀器設(shè)備的聯(lián)動(dòng)和多步復(fù)雜操作；同時(shí)該方法也存在一個(gè)難以解決的矛盾，即 如果采用玻璃基質(zhì)芯片有利于電泳分離，但與氣動(dòng)器件耦合困難，而采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS)彈性體芯片有利于與氣動(dòng)器件的耦合，但電泳分離困難。壓力結(jié)合電動(dòng)的進(jìn)樣則是 利用施加到"十"字芯片樣品廢液端（SW)上的負(fù)壓或靜壓力，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞上樣，然后撤銷負(fù)壓 或靜壓力，在分離通道兩邊施加一個(gè)電場(chǎng)，并借助顯微鏡觀察實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲與裝載。該 類方法無(wú)樣品歧視效應(yīng)，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。但是該方法實(shí)施依賴于人工的多步操作，同時(shí)由于 其靜壓力采用傳統(tǒng)貯液池（即貯液池的高度大于其內(nèi)徑），貯液池的液面隨著流體的流出 而下降，使得流速隨液面下降而明顯減少，難以適應(yīng)進(jìn)樣體積精確調(diào)控和較長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù) 進(jìn)樣操作。總體而言，現(xiàn)有的微流控單細(xì)胞進(jìn)樣方法仍存在以下共性問(wèn)題：（1)難以實(shí)現(xiàn)連 續(xù)進(jìn)樣。目前的進(jìn)樣方法在完成一次進(jìn)樣及分析后，通常需要中斷分析過(guò)程，然后進(jìn)行流體 操控手段及樣品、試劑的移出，清洗芯片，新樣品、試劑注入，操控手段重新施加等大量的耗 時(shí)操作，導(dǎo)致系統(tǒng)的分析通量無(wú)法上升。（2)進(jìn)樣效率低。目前進(jìn)樣的操控手段多是采用多 個(gè)獨(dú)立儀器設(shè)備的簡(jiǎn)單組合，且單個(gè)細(xì)胞的捕獲往往需要借助顯微鏡，使得樣品、試劑的操 作難以平行或同步，不僅導(dǎo)致進(jìn)樣體積可控性差，還影響分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有微流控單細(xì)胞進(jìn)樣技術(shù)的不足，目的之一是提供一種微流 控芯片上一次單細(xì)胞進(jìn)樣所涉及的細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲/裝載、單細(xì)胞溶膜及電泳分離 等多步操作，尤其是在一次單細(xì)胞進(jìn)樣完成后，可以自動(dòng)重復(fù)上述操作，實(shí)現(xiàn)連續(xù)單細(xì)胞進(jìn) 樣，具有多次進(jìn)樣連續(xù)可控、進(jìn)樣體積可調(diào)、效率高、重現(xiàn)性好的用于單細(xì)胞定量分析的微 流控連續(xù)進(jìn)樣方法；目的之二是提供為實(shí)現(xiàn)目的之一的方法所使用的裝置簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單 的用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣裝置。
[0007] 本發(fā)明的目的之一可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法，以微流控芯片作為操作平臺(tái)， 以靜壓力和電動(dòng)作為流體操控手段；一次進(jìn)樣包括細(xì)胞上樣、單細(xì)胞裝載/捕獲、單細(xì)胞溶 膜及電泳分離三步操作；一次進(jìn)樣完成后，自動(dòng)重復(fù)上述三步操作，即可實(shí)現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn) 樣；
[0009] 所述的微流控芯片，其通道末端的五個(gè)寬貯液池分別定義為樣品池 S、輔助聚焦液 池 A、樣品廢液池 SW、緩沖液池 B和緩沖液廢液池 BW ;其通道之間的二個(gè)交叉口分別定義為 "聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，樣品池 S經(jīng)過(guò)交叉口 J、交叉口 C到樣品廢液池 SW之 間的通道S-J-C-SW定義為細(xì)胞上樣通道，交叉口 J與交叉口 C之間的通道J-C定義為單細(xì) 胞捕獲/裝載通道，交叉口 C與緩沖液廢液BW之間的通道C-BW定義為單細(xì)胞溶膜和電泳 分離通道；
[0010] 所述的靜壓力，包括分別依次在樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢 液池BW中加入等體積的樣品或電泳緩沖液，樣品廢液池SW中加入一定體積的電泳緩沖液， 并保證樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢液池BW中樣品或電泳緩沖液與樣品 廢液池SW中電泳緩沖液的體積比為1. 3?1. 5 :1而形成的液壓差；
[0011] 所述的電動(dòng)則由施加到輔助聚焦液池A、樣品廢液池SW、緩沖液池B和緩沖液廢液 池BW上的獨(dú)立或/和同步輸出的四組程控直流電壓（Vi、V 2、V3、V4)組成；所述的細(xì)胞上樣， 采用靜壓力操控即樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢液池BW與樣品廢液池 SW之間存在液壓差，在交叉口 C處形成水力門控，此時(shí)從樣品池S流出的細(xì)胞樣品經(jīng)過(guò)從輔 助聚焦液池A流出電泳緩沖液流的擠壓在通道J-C處形成二相層流的線狀細(xì)胞流，并經(jīng)交 叉口 C流向樣品廢液池SW ;與此同時(shí)從緩沖液池B和緩沖液廢液池BW流出的電泳緩沖液 流與交叉口 C處的線狀細(xì)胞流匯合形成三相層流（兩邊為電泳緩沖液流，中間為線狀樣品 流）后流向樣品廢液池SW，從而避免上樣通道S-J-C-SW內(nèi)的細(xì)胞樣品向分離通道C-BW的 擴(kuò)散；
[0012] 所述的單細(xì)胞捕獲/裝載，采用電動(dòng)操控即樣品池S不施加電壓，輔助聚焦液池 A施加低電壓，緩沖廢液池BW施加OV電壓（接地），樣品廢液池SW和緩沖液池B為"懸空 (既不施加電壓，也不接地）"，此時(shí)在電壓（電場(chǎng)）的作用下捕獲通道J-C中的單個(gè)細(xì)胞， 并裝載送入分離通道C-BW，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲/裝載與樣品進(jìn)樣體積的控制；
[0013] 所述的單細(xì)胞溶膜及電泳分離，采用電動(dòng)操控即樣品池S不施加電壓，輔助聚焦 液池A "懸空"，緩沖液池B、樣品廢液池SW、緩沖液廢液池BW分別施加2500V、1500V、0V的 電壓，在交叉口 C處形成電動(dòng)門控，此時(shí)在電動(dòng)作用下從緩沖液池B引出的電泳緩沖液流經(jīng) 交叉口 C后分成兩股流體：一股流向緩沖液廢液池BW的流體將被捕獲/裝載到分離通道 C-BW中的單細(xì)胞進(jìn)行溶膜和胞內(nèi)組分電泳分離，而另一股流體則流向樣品廢液池SW，以避 免上樣通道S-J-C-SW中的細(xì)胞向分離通道泄露而影響單細(xì)胞分析結(jié)果的有效性。
[0014] 至此,一次單細(xì)胞進(jìn)樣完成，自動(dòng)重復(fù)上述3步操作（細(xì)胞上樣,單細(xì)胞裝載/捕 獲，單細(xì)胞溶膜及電泳分離），即可實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣。
[0015] 本發(fā)明的目的之一還可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0016] 本發(fā)明所述的樣品為細(xì)胞懸液或其他生化液體樣品；所述的單細(xì)胞捕獲/裝載與 樣品進(jìn)樣體積的控制也可以通過(guò)優(yōu)化調(diào)節(jié)靜壓力、細(xì)胞密度、單細(xì)胞捕獲/裝載操作的電 壓及運(yùn)行時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0017] 本發(fā)明的目的之二可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0018] 該用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣裝置包括微流控芯片、四路程控直流電 壓；
[0019] 所述的微流控芯片，結(jié)構(gòu)為"十字"通道上引入輔助聚焦通道，通道之間有兩個(gè)交 叉口即"聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，兩個(gè)交叉口將微流控芯片的通道分成S-J (細(xì)胞 懸液通道）、A-J(輔助聚焦通道）、J-C (單細(xì)胞捕獲/裝載通道）、C-B (電泳緩沖液通道）、 C-SW (細(xì)胞懸液及電泳緩沖廢液通道）、C-BW (單細(xì)胞溶膜和電泳分離通道）六個(gè)隔段；其 通道的末端分別安裝有五個(gè)相同結(jié)構(gòu)的寬貯液池，每個(gè)寬貯液池的結(jié)構(gòu)為上下同心圓筒， 上部圓筒的內(nèi)徑大于其高度2?3倍，下部圓筒與芯片通道末端鏈接；
[0020] 所述的四路程控直流電壓，包括串行通信接口（RS232)、單片機(jī)（MCS-51)、DA轉(zhuǎn)換 器（DAC7614)、DC - DC高壓電源模塊、外接鍵盤和數(shù)碼顯示；其對(duì)外接口有2個(gè)即串行通 信接口和四路直流電壓（Vi、V2、V 3、V4);每路直流電壓（"電壓/接通"、"0V/接地"、"懸空 /斷開(kāi)"）的輸出設(shè)定由外接鍵盤或者串行通信接口 RS232連接的計(jì)算機(jī)（上位機(jī)）實(shí)現(xiàn)， 每路直流電壓的輸出顯示則由數(shù)碼管或上位機(jī)實(shí)現(xiàn)；基于預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，單片機(jī)控 制四路直流電壓的獨(dú)立或/和同步的可編程輸出流程與連續(xù)進(jìn)樣的操作步驟對(duì)應(yīng)一致。
[0021] 將本發(fā)明應(yīng)用于細(xì)胞或其他生化樣品的連續(xù)進(jìn)樣及定量分析，實(shí)施裝置還包括激 光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)或者其他檢測(cè)單元，以便進(jìn)行進(jìn)樣流形觀察、進(jìn)樣條件優(yōu)化、測(cè)定電泳 分離的有關(guān)組分及其含量。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1、樣品池S中始終不加電壓的進(jìn)樣方法，可以有效避免單細(xì)胞溶膜、電泳分離階 段高電壓對(duì)樣品池內(nèi)細(xì)胞的損傷；
[0024] 2、芯片液池采用寬貯液池的設(shè)計(jì)，在保持液池液面下降緩慢的同時(shí)，可以保證較 長(zhǎng)時(shí)間的流速穩(wěn)定，便于提高進(jìn)樣體積控制和連續(xù)進(jìn)樣操作的穩(wěn)定性；
[0025] 3、芯片結(jié)構(gòu)采用"十字"通道引入輔助聚焦通道的設(shè)計(jì)，不僅可以提供細(xì)胞上樣、 單細(xì)胞捕獲/裝載操作的聚焦層流控制，提高進(jìn)樣體積與單細(xì)胞進(jìn)樣的有效性，而且可以 通過(guò)在輔助聚焦液池中添加預(yù)溶膜試劑來(lái)減少后續(xù)單細(xì)胞溶膜操作的時(shí)間，以保證單細(xì)胞 的原始特性和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；
[0026] 4、本發(fā)明可以提供微流控芯片上一次單細(xì)胞進(jìn)樣所涉及的細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲 /裝載、單細(xì)胞溶膜及電泳分離等多步操作，尤其可以提供一次單細(xì)胞進(jìn)樣完成后，自動(dòng)重 復(fù)上述操作，實(shí)現(xiàn)連續(xù)單細(xì)胞進(jìn)樣，具有多次進(jìn)樣連續(xù)可控、進(jìn)樣體積可調(diào)、效率高、重現(xiàn)性 好、裝置簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
[0027] 本發(fā)明不僅可以實(shí)現(xiàn)一次單細(xì)胞進(jìn)樣所涉及的細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲/裝載、單 細(xì)胞溶膜及電泳分離等操作，而且具有多次單細(xì)胞進(jìn)樣連續(xù)可控、操作簡(jiǎn)便、便于單細(xì)胞定 量分析等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例的方法原理圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例的裝置示意圖；
[0030] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例的裝置應(yīng)用示意圖；
[0031] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例的控制進(jìn)樣體積及其對(duì)應(yīng)的電泳圖和流形圖；
[0032] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例用于連續(xù)進(jìn)樣的電泳圖及重現(xiàn)性；
[0033] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例用于細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲/裝載、單細(xì)胞溶膜及電泳分離的 流形圖；
[0034] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例用于單個(gè)PC-12細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣與胞內(nèi)NO連續(xù)檢測(cè)的電泳圖；
[0035] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例用于定量分析186個(gè)PC-12細(xì)胞內(nèi)NO含量的統(tǒng)計(jì)直方圖；
[0036] 圖9為本發(fā)明的進(jìn)樣工程示意圖。

【具體實(shí)施方式】：
[0037] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0038] 參見(jiàn)附圖1 :
[0039] 圖中：（1)細(xì)胞上樣；(2)單細(xì)胞捕獲/裝載；（3)單細(xì)胞溶膜及電泳分離；S樣品 池，SW樣品廢液池，A輔助聚焦液池，B緩沖液池，BW緩沖液廢液池；黑色虛線箭頭為靜壓力 驅(qū)動(dòng)的液流方向，黑色實(shí)線箭頭為電場(chǎng)方向；淺灰色實(shí)心圓點(diǎn)為細(xì)胞懸液，黑色實(shí)心圓點(diǎn)為 捕獲/裝載和溶膜的（目標(biāo)）單細(xì)胞；天藍(lán)色為電泳緩沖液。
[0040] 本發(fā)明的方法包括如下步驟：
[0041] 第一步，細(xì)胞上樣。首先在樣品池S與輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢液池 BW中分別依次加入等體積的樣品（細(xì)胞懸液或其他生化液體樣品）和電泳緩沖液，樣品廢 液池SW中加入一定體積的電泳緩沖液，并保證樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖 液廢液池BW中樣品或電泳緩沖液與樣品廢液池SW中電泳緩沖液的體積比為1. 3-1. 5:1。 隨后將四路程控直流電壓（Vi、V2、V3、V4)的鉬絲電極對(duì)應(yīng)插入輔助聚焦液池A、樣品廢液池 SW、緩沖液池B和緩沖液廢液池BW，并按表1的輸出方式啟動(dòng)四路程控直流電壓的輸出。此 時(shí)，由于四路程控直流電壓的輸出均為"懸空"，樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖 液廢液池BW與樣品廢液池SW之間存在液壓差，芯片內(nèi)的流體（樣品和電泳緩沖液）只受 靜壓力操控，并在交叉口 C處形成水力門控（附圖1，（1))，使得從樣品池S中流出的細(xì)胞 樣品經(jīng)過(guò)從輔助聚焦液池A流出的電泳緩沖液流的擠壓在通道J-C處形成二相層流的線狀 細(xì)胞流，并經(jīng)交叉口 C流向樣品廢液池SW ;與此同時(shí)從緩沖液池B和緩沖液廢液池BW流出 的電泳緩沖液流與交叉口 C處的線狀細(xì)胞流匯合形成三相層流后流向樣品廢液池SW，從而 避免上樣通道S-J-C-SW內(nèi)的細(xì)胞向分離通道擴(kuò)散。
[0042] 表1 :四路程控直流電壓用于連續(xù)進(jìn)樣的典型輸出

【權(quán)利要求】
1. 一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法，其特征在于：以微流控芯片作為 操作平臺(tái)，以靜壓力和電動(dòng)作為流體操控手段；一次進(jìn)樣包括細(xì)胞上樣、單細(xì)胞裝載/捕 獲、單細(xì)胞溶膜及電泳分離三步操作；一次進(jìn)樣完成后，自動(dòng)重復(fù)上述三步操作，即可實(shí)現(xiàn) 多次連續(xù)進(jìn)樣； 所述的微流控芯片，其通道末端的五個(gè)寬貯液池分別定義為樣品池S、輔助聚焦液池 A、樣品廢液池SW、緩沖液池B和緩沖液廢液池BW ;其通道之間的二個(gè)交叉口分別定義為"聚 焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，樣品池S經(jīng)過(guò)交叉口 J、交叉口 C到樣品廢液池SW之間 的通道S-J-C-SW定義為細(xì)胞上樣通道，交叉口 J與交叉口 C之間的通道J-C定義為單細(xì)胞 捕獲/裝載通道，交叉口 C與緩沖液廢液BW之間的通道C-BW定義為單細(xì)胞溶膜和電泳分 離通道； 所述的靜壓力，包括分別依次在樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢液池 BW中加入等體積的樣品或電泳緩沖液，樣品廢液池SW中加入一定體積的電泳緩沖液，并保 證樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢液池BW中樣品或電泳緩沖液與樣品廢液 池SW中電泳緩沖液的體積比為1. 3?1. 5 :1而形成的液壓差； 所述的電動(dòng)則由施加到輔助聚焦液池A、樣品廢液池SW、緩沖液池B和緩沖液廢液池BW 上的獨(dú)立或/和同步輸出的四組程控直流電壓（Vi、V2、V3、V4)組成； 所述的細(xì)胞上樣，采用靜壓力操控即樣品池S、輔助聚焦液池A、緩沖液池B、緩沖液廢 液池BW與樣品廢液池SW之間存在液壓差，在交叉口 C處形成水力門控，此時(shí)從樣品池S流 出的細(xì)胞樣品經(jīng)過(guò)從輔助聚焦液池A流出電泳緩沖液流的擠壓在通道J-C處形成二相層流 的線狀細(xì)胞流，并經(jīng)交叉口 C流向樣品廢液池SW ;與此同時(shí)從緩沖液池B和緩沖液廢液池 BW流出的電泳緩沖液流與交叉口 C處的線狀細(xì)胞流匯合形成三相層流后流向樣品廢液池 SW，從而避免上樣通道S-J-C-SW內(nèi)的細(xì)胞樣品向分離通道C-BW的擴(kuò)散； 所述的單細(xì)胞捕獲/裝載，采用電動(dòng)操控即樣品池S不施加電壓，輔助聚焦液池A施加 低電壓，緩沖廢液池BW施加0V電壓（接地），樣品廢液池SW和緩沖液池B為"懸空"，此時(shí) 在電壓（電場(chǎng)）的作用下捕獲通道J-C中的單個(gè)細(xì)胞，并裝載送入分離通道C-BW，從而實(shí)現(xiàn) 單細(xì)胞的捕獲/裝載與樣品進(jìn)樣體積的控制； 所述的單細(xì)胞溶膜及電泳分離，采用電動(dòng)操控即樣品池S不施加電壓，輔助聚焦液池 A "懸空"，緩沖液池B、樣品廢液池SW、緩沖液廢液池BW分別施加2500V、1500V、0V的電壓， 在交叉口 C處形成電動(dòng)門控，此時(shí)在電動(dòng)作用下從緩沖液池B引出的電泳緩沖液流經(jīng)交叉 口 C后分成兩股流體：一股流向緩沖液廢液池BW的流體將被捕獲/裝載到分離通道C-BW 中的單細(xì)胞進(jìn)行溶膜和胞內(nèi)組分電泳分離，而另一股流體則流向樣品廢液池SW，以避免上 樣通道S-J-C-SW中的細(xì)胞向分離通道泄露而影響單細(xì)胞分析結(jié)果的有效性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法，，其特征 在于：所述的樣品為細(xì)胞懸液或其他生化液體樣品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣方法，其特征在 于：所述的單細(xì)胞捕獲/裝載與樣品進(jìn)樣體積的控制也可以通過(guò)優(yōu)化調(diào)節(jié)靜壓力、細(xì)胞密 度、單細(xì)胞捕獲/裝載操作的電壓及運(yùn)行時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。
4. 一種用于單細(xì)胞定量分析的微流控連續(xù)進(jìn)樣裝置，其特征在于：該裝置包括微流控 芯片、四路程控直流電壓； 所述的微流控芯片，結(jié)構(gòu)為"十字"通道上引入輔助聚焦通道，通道之間有兩個(gè)交叉口 即"聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，兩個(gè)交叉口將微流控芯片的通道分成細(xì)胞懸液通 道、輔助聚焦通道、單細(xì)胞捕獲/裝載通道、電泳緩沖液通道、細(xì)胞懸液及電泳緩沖廢液通 道、單細(xì)胞溶膜和電泳分離通道六個(gè)隔段；其通道的末端分別安裝有五個(gè)相同結(jié)構(gòu)的寬貯 液池，每個(gè)寬貯液池的結(jié)構(gòu)為上下同心圓筒，上部圓筒的內(nèi)徑大于其高度2?3倍，下部圓 筒與芯片通道末端鏈接； 所述的四路程控直流電壓，包括串行通信接口（RS232)、單片機(jī)（MCS-51)、DA轉(zhuǎn)換器 (DAC7614)、DC - DC高壓電源模塊、外接鍵盤和數(shù)碼顯示；其對(duì)外接口有2個(gè)即串行通信接 口和四路直流電壓（Vi、V2、V3、V4);每路直流電壓的輸出（"電壓/接通"、"0V/接地"、"懸 空/斷開(kāi)"）設(shè)定由外接鍵盤或者串行通信接口 RS232連接的計(jì)算機(jī)（上位機(jī)）實(shí)現(xiàn)，每路 直流電壓的輸出顯示則由數(shù)碼管或上位機(jī)實(shí)現(xiàn)；基于預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，單片機(jī)控制四 路直流電壓的獨(dú)立或/和同步的可編程輸出流程與連續(xù)進(jìn)樣的操作步驟對(duì)應(yīng)一致。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104388300SQ201410707828
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】唐波, 李忠義, 李清嶺 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)