專利名稱：樣品的預(yù)處理方法及hcv的免疫測定方法
樣品的預(yù)處理方法及HCV的免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HCV核心蛋白檢測用樣品的預(yù)處理方法，HCV核心蛋白檢測用試劑盒， 判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法，及HCV的免疫測定方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)引起的傳染性的疾病。不僅尚未確立丙型肝炎的 予防法，感染者(攜帶者)的多是被推定為經(jīng)10 30年向肝硬化或肝癌轉(zhuǎn)移，HCV感染的 早期發(fā)現(xiàn)和早期治療非常重要。作為丙型肝炎的病原體的HCV是直徑約60nm的RNA病毒，具有包膜。HCV的RNA 是單鏈正鏈，由約9500個堿基序列構(gòu)成?；蚪Y(jié)構(gòu)類似于黃病毒，5’末端和3’末端有非翻 譯區(qū)(UTR)，其間存在編碼約3000個氨基酸的翻譯區(qū)。翻譯區(qū)從5’側(cè)有編碼結(jié)構(gòu)蛋白的核 心區(qū)，包膜區(qū)1，包膜區(qū)2，接著存在非結(jié)構(gòu)區(qū)。作為HCV檢測用方法，已知以核心區(qū)編碼的HCV核心蛋白作為抗原，使用免疫學(xué)手 法來檢測的方法。其中，HCV核心蛋白存在于具有包膜的HCV的內(nèi)部。因此，以HCV核心蛋 白作為抗原檢測時，需要將HCV核心蛋白從HCV游離。作為將HCV核心蛋白從HCV游離的 預(yù)處理方法，已知將HCV用堿性溶液處理后，用酸性溶液中和的預(yù)處理方法。例如，日本公 開號特開2001-004621號公報中公開了通過將疑似含丙型肝炎病毒的樣品用含非離子表 面活性劑，蛋白變性劑及堿性物質(zhì)的試劑處理的第1處理步驟，及將第1處理步驟中得到的 樣品用含酸性物質(zhì)的試劑處理的第2處理步驟來游離HCV核心蛋白的預(yù)處理方法。作為HCV檢查，已知以核心區(qū)編碼的HCV核心蛋白作為抗原使用的抗體測定法。 但是，利用上述抗體測定法的HCV檢查在感染HCV至抗體產(chǎn)生前不可檢測丙型肝炎。因此， HCV的早期發(fā)現(xiàn)困難。而且抗體檢查在原理上存在不可判別是感染后治愈者，還是活動性的 感染者的問題。其中，作為解決這樣的問題的HCV檢查，有直接檢測HCV抗原的方法。作為這樣的 方法，已知使用對于HCV的核心抗原有特異性的單克隆抗體來檢測血清中的核心抗原的方 法(日本授權(quán)專利第3176570號，日本授權(quán)專利第3623162號)。但是，由于HCV感染患者內(nèi)病毒粒子本身極少，因此盼望著比上述測定法更高靈 敏度的HCV的檢測法。確認(rèn)有無HCV感染時，需要檢測從被驗者采取的活體樣品中所含的微量的HCV。因 此，HCV的檢測要求靈敏度。其中，作為以高靈敏度檢測抗原的方法，已知免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移 測定法(日本公開特開平1-254868號，日本公開特開平2-28558號)。此免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移 測定法是以將含測定對象物質(zhì)的免疫復(fù)合物在2種以上的固相間移動后，測定固相上的免 疫復(fù)合物為特征的方法。通過將含測定對象物質(zhì)的免疫復(fù)合物在2種以上的固相間移動來 除去雜質(zhì)，可減少檢測系統(tǒng)中的非特異的信號。結(jié)果，通過使用免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移測定法，可 以高靈敏度檢測測定對象物質(zhì)。但是，已知作為丙型肝炎的病原體的HCV是RNA病毒，引起高度的變異。例如，在SEQ ID NO :2所示的HCV基因型Ib的核心區(qū)蛋白質(zhì)的第49位的氨基酸有變異時，即便用 使用了上述公知的抗體的上述免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移測定法測定HCV，也有無法以高靈敏度檢測 的情況(Journal Of Clinical Microbiology，S印t. 2000，ρ· ；3450_3452)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求確定，它不以任何方式受此發(fā)明內(nèi)容部分記載 的影響。S卩，本發(fā)明提供(1)利用使用粒子的免疫測定法預(yù)處理丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白檢測用樣 品的方法，包括將疑似含丙型肝炎病毒的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理；及將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性物質(zhì)的試劑處理；其中含堿性物質(zhì)的試劑及含酸性物質(zhì)的試劑中的至少一種含還原劑；(2) (1)的方法，其中還原劑是選自下列的至少1種巰基乙胺，巰基乙醇，二硫蘇 糖醇，半胱氨酸，二硫丁四醇，硼氫化鈉及膦；(3) (1)或O)的方法，其中第1處理步驟中使用的試劑還含非離子表面活性劑；(4) (3)的方法，其中非離子表面活性劑選自聚氧乙烯系非離子表面活性劑；(5)⑴ (4)中任一項的方法，其中第1處理步驟中使用的試劑還含離液劑；(6) (5)的方法，其中離液劑是選自下列的至少1種尿素，胍鹽酸鹽，水楊酸鈉，乙 酰胺及甲酰胺。(7)⑴ (6)中任一項的方法，其中堿性物質(zhì)是選自下列的至少1種氫氧化鈉， 氫氧化鉀及氫氧化鎂；(8) (1) (7)中任一項的方法，其中酸性物質(zhì)是選自下列的至少1種醋酸，乳 酸，檸檬酸，蘋果酸，琥珀酸，磷酸，蟻酸，富馬酸，酒石酸，鹽酸及硫酸；(9) (1) (8)中任一項的方法，其中粒子是磁性粒子；(10)⑴ (9)中任一項的方法，其中第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑 中的至少一種含無機(jī)鹽類；(11) (10)的方法，其中無機(jī)鹽類是選自下列的至少1種氯化鈉，氯化鉀，氯化鎂 及硫酸鈉；(12) (9)的方法，其中免疫測定法是將液相中形成的含HCV核心蛋白，抗HCV核心 蛋白抗體及磁性粒子的復(fù)合物通過磁分離來從液相分離而檢測HCV核心蛋白的免疫測定 法；(13)利用使用粒子的免疫測定法的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白檢測用試劑盒， 其含含堿性物質(zhì)的第1試劑；及含酸性物質(zhì)的第2試劑；其中第1試劑及第2試劑中的至少一種含還原劑；(14) (13)的試劑盒，其中第1試劑及第2試劑中的至少一種含無機(jī)鹽類；(15) (13)或(14)的試劑盒，其中第1試劑還含非離子表面活性劑；
(16) (13) (15)中任一項的試劑盒，其中第1試劑還含離液劑；(17) (13) (16)中任一項的試劑盒，其還含含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體的第3試劑；含結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體的第4試劑；含粒子的第5試劑；含與第1抗體及粒子結(jié)合的第2抗體的第6試劑；及固定有與第1抗體結(jié)合的物質(zhì)的固相；(18) (17)的試劑盒，其中標(biāo)記抗體及第1抗體分別結(jié)合到HCV核心蛋白的不同部 位，且結(jié)合部位中不含SEQ ID NO :2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸；(19) (18)的試劑盒，其中標(biāo)記抗體及第1抗體的結(jié)合部位是SEQ ID NO 2所示的 HCV核心蛋白的第21 30位的氨基酸序列或第41 48位的氨基酸序列；(20) (19)的試劑盒，其中用作標(biāo)記抗體及第1抗體的抗體是由選自獨立行政法人 制品評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心中保藏的保藏號NITE BP-844及NITE BP-843 的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。(21)判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法，包括將疑似含丙型肝炎病毒的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理；將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性物質(zhì)的試劑處理；在粒子上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體及第2處理步驟中得到的樣品中 所含的HCV核心蛋白的復(fù)合物；形成步驟后，將樣品中的粒子與樣品中所含的其他成分分離；將分離步驟中得到的粒子上形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相；測定轉(zhuǎn)移步驟中得到的轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相的復(fù)合物的標(biāo)記；及基于測定步驟的結(jié)果，判斷樣品中有無丙型肝炎病毒；其中含堿性物質(zhì)的試劑及含酸性物質(zhì)的試劑中的至少一種含還原劑；(22)丙型肝炎病毒(HCV)的免疫測定方法，包括在第1固相上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體，結(jié)合于HCV核心蛋白的第 1抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物；將第1固相上形成的復(fù)合物從第1固相游離，轉(zhuǎn)移到與第1固相不同的第2固相； 及測定轉(zhuǎn)移到第2固相的復(fù)合物的標(biāo)記；其中標(biāo)記抗體及第1抗體分別結(jié)合到HCV核心蛋白的不同部位，且結(jié)合部位不含 SEQ ID NO :2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸。根據(jù)(1)及(13)利用使用了粒子的免疫測定法的HCV核心蛋白的檢測中，可抑制 粒子的凝集。根據(jù)利用使用了粒子的免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移測定法的HCV核心蛋白的檢測 中不產(chǎn)生粒子的凝集，可更正確判斷樣品中有無丙型肝炎病毒。根據(jù)02)可以高靈敏度檢 測 HCV。

圖1顯示本實施方式中至轉(zhuǎn)移步驟的狀態(tài)的圖。其中，A表示第2抗體結(jié)合抗原，B表示固相結(jié)合物質(zhì)，C表示標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合體，D表示固相固 定物質(zhì)。圖2顯示對SEQID NO :2所示的第49位的氨基酸不同的HCV核心蛋白 (HCV-JlbT49P及HCV-3bNE137)的抗HCV核心單克隆抗體(HCF4-801及HE25)的反應(yīng)性的 圖。圖3顯示對于HCV的各基因型的HCV-RNA量與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系的圖。實施方式以下將參照

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本實施方式中HCV核心蛋白檢測用樣品的預(yù)處理方法是用于利用使用粒子的免 疫測定法的HCV核心蛋白的檢測的樣品的預(yù)處理方法，包括將疑似含丙型肝炎病毒的樣 品用含堿性物質(zhì)的試劑處理的第1處理步驟，將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性物質(zhì) 的試劑處理第2處理步驟，第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種含還 原劑。本實施方式中，第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種含還原 劑。通過第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種含還原劑，從而可抑制 后述分離步驟中粒子的凝集。其中，“還原劑”只要是對后述形成步驟無影響的還原劑就不 特別限制。作為本實施方式中還原劑，尤其優(yōu)選解離蛋白質(zhì)的二硫鍵的還原劑。作為更具 體的還原劑，可例舉例如，巰基乙胺，巰基乙醇，二硫蘇糖醇，半胱氨酸，二硫丁四醇，硼氫化 鈉或膦等。作為本實施方式中還原劑，尤其優(yōu)選巰基乙胺，二硫蘇糖醇及半胱氨酸鹽酸鹽。第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種所含的還原劑的濃度 根據(jù)所用還原劑的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特別限定。例如，作為還原劑使用巰基乙胺時，第 1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種所含的巰基乙胺的濃度優(yōu)選10 60mM。本實施方式中，第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種還優(yōu)選 含無機(jī)鹽類。通過第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種還含無機(jī)鹽類， 從而可進(jìn)一步抑制后述分離步驟中粒子的凝集。其中，“無機(jī)鹽類”只要是對后述形成步驟 無影響的鹽類就不特別限制。作為本實施方式中鹽類，尤其優(yōu)選無機(jī)鹽。作為更具體的無 機(jī)鹽，可例舉例如，氯化鈉，氯化鉀，氯化鎂或硫酸鈉等。作為本實施方式中鹽類，優(yōu)選氯化 鈉，氯化鉀及硫酸鈉。第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種所含的無機(jī)鹽類的濃度 根據(jù)所用無機(jī)鹽類的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特別限定。例如，作為無機(jī)鹽類使用氯化鈉時， 第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種所含的氯化鈉的濃度優(yōu)選0. 1 1. OM0其中，“疑似含HCV的樣品”優(yōu)選活體樣品或從活體樣品制備的樣品。作為活體樣 品及從活體樣品制備的樣品，可例舉例如，尿，糞便，全血，血漿，血清，膽汁，胃腸分泌物，淋 巴液，精液，骨髓液，唾液，母乳，組織提取液，組織勻漿，細(xì)胞提取液，細(xì)胞勻漿等。本實施方式中，第1處理步驟中使用的試劑優(yōu)選還含非離子表面活性劑。其中，“非 離子表面活性劑”只要是可用于將上述HCV核心蛋白從HCV游離的方法的非離子表面活性 劑，就不特別限制。作為本實施方式中非離子表面活性劑，優(yōu)選聚氧乙烯系非離子表面活性
7劑。作為具體的聚氧乙烯系非離子表面活性劑，可例舉例如，聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100, Triton X-114及NP-40等)，聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯(Tween-20及Tween-80等)， 及聚氧乙烯烷基醚(Brij35及Brij45等)等。作為本實施方式中聚氧乙烯系非離子表面 活性劑優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚。第1處理步驟中，非離子表面活性劑的濃度根據(jù)所用非離子表面活性劑的種類適 宜調(diào)節(jié)即可，不特別限定。例如，作為非離子表面活性劑使用聚氧乙烯烷基醚時，第1處理 步驟中，聚氧乙烯烷基醚的濃度優(yōu)選為2 4%。另外，本實施方式中，第1處理步驟中使用的試劑還優(yōu)選含離液劑。其中，“離液 劑”是具有使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定化的性質(zhì)的物質(zhì)，可例舉例如尿素，胍鹽酸鹽，水楊 酸鈉，硫氰酸鈉，過氯酸鈉，乙酰胺及甲醛等。作為本實施方式中離液劑，優(yōu)選尿素。第1處理步驟中，離液劑的濃度根據(jù)所用離液劑的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特別限 定。例如，作為離液劑使用尿素時，第1處理步驟中，尿素的濃度優(yōu)選2 4M?！皦A性物質(zhì)”只要是可用于將上述HCV核心蛋白從HCV游離的方法的堿性物質(zhì)，就 不特別限制。其中，作為堿性物質(zhì)，可例舉例如，氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鎂及硫酸鈉等。 作為本實施方式中堿性物質(zhì)，優(yōu)選氫氧化鈉。第1處理步驟中，堿性物質(zhì)的濃度根據(jù)所用堿性物質(zhì)的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特 別限定。例如，作為堿性物質(zhì)使用氫氧化鈉時，第1處理步驟中氫氧化鈉的濃度優(yōu)選0. 15 0. 5N?！暗?處理步驟”只要是混合疑似含HCV的樣品和含堿性物質(zhì)的試劑的處理，就不 特別限制。通過進(jìn)行第1處理步驟，可從HCV游離HCV核心蛋白。其中，第1處理步驟中， 處理時間或處理溫度根據(jù)樣品和試劑的混合條件適宜設(shè)定即可，不特別限制。作為具體的 第1處理步驟中處理時間或處理溫度，例如，第1處理步驟中，使用聚氧乙烯系非離子表面 活性劑的濃度為2 4%，尿素的濃度為2 4M，氫氧化鈉的濃度為0. 1 0. 4N的試劑時， 可在20 30°C的處理溫度以6 10分鐘的處理時間進(jìn)行第1處理步驟。需要說明的是，本實施方式中，含堿性物質(zhì)的試劑包括含非離子表面活性劑和離 液劑的試劑，及將各成分分成2種以上的試劑而含有的試劑盒。其中，作為試劑盒，可例舉 例如，配備含非離子表面活性劑及離液劑的第1試劑，以及含堿性物質(zhì)的第2試劑的試劑盒寸。“第2處理步驟”中，將第1處理步驟中得到的樣品與含酸性物質(zhì)的試劑混合，中和 第1處理步驟中得到的樣品的堿性。第2處理步驟中得到的樣品的PH優(yōu)選對后述形成步 驟無影響的PH。作為更具體的第2處理步驟中得到的樣品的pH，優(yōu)選pH6.5 8。其中， 作為具體的第2處理步驟中處理時間或處理溫度，根據(jù)樣品和試劑的混合條件適宜設(shè)定即 可，不特別限制。作為具體的第1處理步驟中處理時間或處理溫度，是在20 30°C的處理 溫度處理3 15分鐘。“酸性物質(zhì)”不特別限制，可例舉例如，醋酸，乳酸，檸檬酸，蘋果酸，琥珀酸，磷酸， 蟻酸，富馬酸，酒石酸，鹽酸，硫酸等。作為本實施方式中酸性物質(zhì)優(yōu)選檸檬酸。其中，第2處 理步驟中使用的含酸性物質(zhì)的試劑中，酸性物質(zhì)的濃度根據(jù)所用酸性物質(zhì)或上述第1步 驟中使用的堿性物質(zhì)等適宜調(diào)節(jié)即可，不特別限制。含酸性物質(zhì)的試劑中，作為酸性物質(zhì)的 濃度，例如，當(dāng)酸性物質(zhì)是檸檬酸時，試劑中的檸檬酸的濃度優(yōu)選0. 1 0. 3M。
疑似含HCV的樣品通過上述第1處理步驟及第2處理步驟而被稀釋。其中，第1 處理步驟及第2處理步驟后，疑似含HCV的樣品的稀釋根據(jù)疑似含HCV的樣品的種類適宜 調(diào)節(jié)即可。例如，當(dāng)疑似含HCV的樣品是血清時，出于調(diào)至抑制對免疫測定的血清成分等的 影響，且可檢測HCV核心蛋白的濃度的觀點，第1處理步驟及第2處理步驟后，血清的稀釋 優(yōu)選3 5倍。需要說明的是，作為利用使用粒子的免疫測定法的丙型肝炎病毒的檢測，將HCV 核心蛋白使用公知的使用粒子的免疫測定法來檢測即可。另外，粒子也只要是免疫測定法 中使用的公知的粒子即可，可例舉例如，磁性粒子，膠乳粒子，紅細(xì)胞，明膠粒子等，優(yōu)選磁 性粒子。其中，作為磁性粒子，只要是含有磁性的材料作為基材，在通常的免疫測定中用到 的粒子即可。已知例如，使用了 Fe2O3及/或狗304，鈷，鎳，葉石，磁石等作為基材的磁性粒 子。用使用磁性粒子的免疫測定法檢測丙型肝炎病毒時，液相中形成的含HCV核心蛋 白、抗HCV核心蛋白抗體及磁性粒子的復(fù)合物可通過磁分離來從液相分離而檢測HCV核心 蛋白。更具體而言，在液相中形成含HCV核心蛋白、標(biāo)記抗HCV核心蛋白抗體(以下，也單稱 為標(biāo)記抗體)及磁性粒子的復(fù)合物。接下來，液相中的復(fù)合物通過磁分離從液相分離。接 下來，分離的復(fù)合物分散到液相，測定復(fù)合物的標(biāo)記。然后，基于測定的結(jié)果，可判斷樣品中 有無丙型肝炎病毒。本實施方式中，使用第2處理步驟中得到的樣品來形成含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體 及磁性粒子的復(fù)合物時，第2處理步驟后，將含標(biāo)記抗體及第2處理步驟中得到的樣品中所 含的HCV核心蛋白的復(fù)合物在粒子上形成即可。其中，“標(biāo)記抗體”只要是由免疫測定法中一般用到的公知的標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗 體，就不特別限制。另外，標(biāo)記抗體通過抗原抗體反應(yīng)與HCV核心蛋白結(jié)合。其中，作為標(biāo) 記物質(zhì)，可例舉例如，酶，螢光物質(zhì)，放射性同位元素等。作為酶，可例舉例如，堿性磷酸酶， 過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，酪氨酸酶，酸性磷酸酶等。作為螢光物質(zhì)，可例舉異硫氰酸熒 光素(FITC)，綠色螢光蛋白(GFP)，螢光素等。作為放射性同位素，可例舉125I，14C，32P等。 需要說明的是，作為標(biāo)記物質(zhì)，優(yōu)選酶。標(biāo)記物質(zhì)是酶時，針對該酶的底物根據(jù)作為標(biāo)記物質(zhì)使用的酶，適宜選擇公知的 底物即可。例如，對于作為酶使用堿性磷酸酶時的底物可例舉=CDP-Mar (注冊商標(biāo))， (4-氯-3-(甲氧基螺{1，2_二氧雜環(huán)丁烷-3，2，-(5，_氯)三環(huán)[3. 3. 1. I3'7]癸烷}_4_基) 苯基磷酸2鈉)，CSPD (注冊商標(biāo))(3-(4-甲氧基螺{1，2- 二氧雜環(huán)丁烷_3，2_(5’ -氯) 三環(huán)[3. 3. 1.13’7]癸烷}-4_基)苯基磷酸2鈉)等的化學(xué)發(fā)光底物；磷酸對硝基苯酯， 5-溴-4-氯-3-吲哚啉磷酸(BCIP)，氯化4-氮藍(lán)四唑(NBT)，碘硝基四唑(INT)等的發(fā) 光底物；磷酸4-甲基傘酮(4MUP)等的螢光底物；5-溴-4-氯-3-吲哚啉磷酸(BCIP)， 5-溴-6-氯-吲哚啉磷酸2鈉，磷酸對硝基苯酯等的發(fā)色底物。需要說明的是，標(biāo)記抗體可通過本領(lǐng)域公知的方法制成。已知例如，使用抗體的巰 基(-SH)來將上述標(biāo)記物質(zhì)與抗體結(jié)合的方法。更具體而言，通過將可與巰基反應(yīng)的官能 團(tuán)，例如導(dǎo)入了馬來酰亞胺基的上述標(biāo)記物質(zhì)與抗體反應(yīng)，從而可將抗體用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。要想在粒子上形成含標(biāo)記抗體及第2處理步驟中得到的樣品中所含的HCV核心蛋 白的復(fù)合物，只要使標(biāo)記抗體，磁性粒子和第2處理步驟中得到的樣品中所含的HCV核心蛋
9白在液相中接觸即可。由此形成含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的復(fù)合物。其中，標(biāo) 記抗體與HCV核心蛋白通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物。而且， 標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物可通過可結(jié)合于HCV核心蛋白復(fù)合物和磁性粒子的物質(zhì)結(jié) 合于磁性粒子。其中，作為可結(jié)合于HCV核心蛋白復(fù)合物和磁性粒子的物質(zhì)，可例舉例如， 結(jié)合于HCV核心蛋白和磁性粒子的粒子結(jié)合抗體。使用了結(jié)合于HCV核心蛋白和磁性粒子 的粒子結(jié)合抗體時，磁性粒子上形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-粒子結(jié)合抗體復(fù)合物。其中，“結(jié)合于HCV核心蛋白和粒子的粒子結(jié)合抗體”與不同于上述標(biāo)記抗體的 HCV核心蛋白的表位通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，且只要是可結(jié)合粒子的抗體就不特別限制。需 要說明的是，可結(jié)合粒子的抗體可使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法來制成。例如，可通過使抗體 與粒子結(jié)合部位結(jié)合，將可結(jié)合粒子結(jié)合部位的結(jié)合物質(zhì)固定于粒子來制成可結(jié)合粒子的 抗體。即，利用粒子結(jié)合部位和結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合能力，可使抗體與粒子結(jié)合成為可能。上述粒子結(jié)合部位和結(jié)合物質(zhì)只要是形成步驟中可特異結(jié)合的物質(zhì)的組合就不 特別限制。作為這些組合，可例舉例如生物素和親和素類，半抗原和抗半抗原抗體，鎳和組 氨酸標(biāo)簽，谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等。作為粒子結(jié)合部位和結(jié)合物質(zhì)的組合，優(yōu)選 生物素和親和素類的組合。粒子結(jié)合部位和結(jié)合物質(zhì)的組合中用到的各種物質(zhì)是將任何一 方用作粒子結(jié)合部位或結(jié)合物質(zhì)均可。作為更優(yōu)選組合，可例舉粒子結(jié)合部位含生物素，結(jié) 合物質(zhì)含親和素類的組合。需要說明的是，“親和素類”的含義包括親和素及鏈霉親和素。需要說明的是，本技術(shù)領(lǐng)域公知使粒子結(jié)合部位與抗體結(jié)合的方法。例如，當(dāng)粒 子結(jié)合部位含生物素時，可通過與抗體中的氨基或巰基等有反應(yīng)性的基將生物素與抗體結(jié) 合。作為與氨基有反應(yīng)性的基可例舉N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基，作為與巰基有反應(yīng)性的 基可例舉馬來酰亞胺基等。另外，本技術(shù)領(lǐng)域也公知將結(jié)合物質(zhì)固定于粒子的方法。該固定化可通過例如 物理吸附法，共價鍵合法，離子鍵合法，這些的組合等進(jìn)行。例如，結(jié)合物質(zhì)是親和素類 時，可通過物理吸附將親和素直接固定于粒子。另外，可與親和素類結(jié)合的物質(zhì)，也可通 過例如向結(jié)合生物素的粒子結(jié)合親和素類，將親和素類固定于粒子。另外，也可根據(jù)特開 2006-2^689號公報中記載的方法將親和素類固定于粒子。需要說明的是，也可使用市售 的結(jié)合了親和素類的粒子。也可從例如，JSR株式會社或Dynal Biotech公司等購買結(jié)合 了親和素類的粒子。接下來，將液相中的含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的復(fù)合物通過磁分離 從液相分離。更具體而言，使磁石靠近裝有含有含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的復(fù) 合物的液的容器的壁面。由此，使用磁石來將復(fù)合物固定于容器的壁面。然后，可通過將復(fù) 合物固定在容器的壁面的狀態(tài)下吸引除去液相來進(jìn)行分離步驟。通過進(jìn)行此分離，從而可 除去存在于液相中的，未在非離子表面活性劑，離液劑，及復(fù)合物的形成中使用的標(biāo)記抗體 等，后述復(fù)合物的標(biāo)記的測定中不需要或帶來不良影響的成分。需要說明的是，通過磁分離從液相分離含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的 復(fù)合物時，也可洗滌復(fù)合物。例如，可通過向上述分離的復(fù)合物添加洗滌液來懸浮復(fù)合物， 再將復(fù)合物從洗滌液磁分離來洗滌復(fù)合物。可通過進(jìn)行此洗滌步驟來進(jìn)一步除去復(fù)合物的 標(biāo)記的測定中不需要或帶來不良影響的成分。此洗滌也在使用磁性粒子的免疫測定法中 公知。其中，作為洗滌液，優(yōu)選對含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的復(fù)合物無影響的緩沖液。另外，洗滌液尤其優(yōu)選含表面活性劑的緩沖液。作為更具體的洗滌液，可例舉例 如，TBS-T (0. 05% Tween20)及 PBS_T(0. 05% Tween20)等。需要說明的是，HISCL 洗滌液 (Sysmex公司制)等的，也可使用市售的洗滌液。接下來，將分離的復(fù)合物分散到液相，測定復(fù)合物的標(biāo)記。對于向液相分散分離的 復(fù)合物，只要將分離的復(fù)合物向底物液或緩沖液等的液相分散即可。其中，對于標(biāo)記的測 定，根據(jù)用于上述標(biāo)記抗體的標(biāo)記物質(zhì)的種類，用適當(dāng)?shù)臏y定方法適宜進(jìn)行即可，不特別限 制。例如，該標(biāo)記物質(zhì)是酶時，可通過使用適當(dāng)?shù)难b置測定通過使與針對該酶的底物反應(yīng)產(chǎn) 生的光，色等來進(jìn)行。作為該裝置，可例舉分光光度計，光度計等。另外，標(biāo)記物質(zhì)是放射性 同位體時，可通過使用閃爍計數(shù)器等的以往公知的裝置測定來進(jìn)行。然后，基于測定的結(jié)果，判斷樣品中有無丙型肝炎病毒。判斷有無丙型肝炎病毒 基于所述測定的結(jié)果進(jìn)行。具體而言，上述測定中，檢測到含HCV核心蛋白，標(biāo)記抗體及磁 性粒子的復(fù)合物來源的標(biāo)記時，判斷為樣品中有HCV。相反，上述測定中未檢測到含HCV核 心蛋白，標(biāo)記抗體及磁性粒子的復(fù)合物來源的標(biāo)記時，判斷為樣品中無HCV。例如，將測得 的測定值與預(yù)先設(shè)定的閾值比較。然后，測定值在閾值以上時，可判斷為樣品中有HCV。相 反，測定值小于閾值時，可判斷為樣品中無HCV。其中閾值根據(jù)公知的方法適宜設(shè)定即可。 作為閾值的設(shè)定方法，例如，對于多個預(yù)先已知含HCV的樣品和多個預(yù)先已知不含HCV的樣 品取得各測定值。然后，可將可二等分含HCV的樣品之集和不含HCV的樣品之集的中位值 作為閾值設(shè)定。需要說明的是，作為利用使用粒子的免疫測定法的丙型肝炎病毒的檢測，說明了 使用磁性粒子的免疫測定法，HCV核心蛋白檢測用樣品的預(yù)處理方法的適用不限于此。作 為磁性粒子以外的粒子，可例舉膠乳粒子，紅細(xì)胞，及明膠粒子等。使用了磁性粒子以外的 粒子時，代替磁分離，可通過進(jìn)行離心分離將復(fù)合物從液相分離。本實施方式中判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法包括將疑似含丙型肝炎病毒 的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理的第1處理步驟；將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性 物質(zhì)的試劑處理第2處理步驟；在粒子上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體及第2處 理步驟中得到的樣品中所含的HCV核心蛋白的復(fù)合物的步驟；形成步驟后，將樣品中的粒 子與樣品中所含的其他成分分離的步驟；將分離步驟中得到的粒子上形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到 與所述粒子不同的固相的步驟；測定轉(zhuǎn)移步驟中得到的轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相的復(fù) 合物的標(biāo)記的步驟；及基于測定步驟的結(jié)果，判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的步驟，第1處 理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種含還原劑?！傲Ｗ印敝灰敲庖邷y定法中使用的公知的粒子，就不特別限制。作為具體的粒子， 如同上述。本實施方式中的形成步驟中，通過接觸標(biāo)記抗體，粒子，第2處理步驟中得到的樣 品中所含的HCV核心蛋白，在粒子上形成含標(biāo)記抗體和HCV核心蛋白的復(fù)合物。其中，標(biāo)記 抗體與HCV核心蛋白通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物。再者，標(biāo) 記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物可通過可結(jié)合HCV核心蛋白復(fù)合物和粒子的物質(zhì)與粒子結(jié)合。 由此，可在粒子上形成含標(biāo)記抗體和HCV核心蛋白的復(fù)合物。其中，作為可結(jié)合HCV核心蛋 白復(fù)合物和粒子的物質(zhì)，可例舉例如，結(jié)合于HCV核心蛋白和粒子的粒子結(jié)合抗體。使用了 結(jié)合于HCV核心蛋白和粒子的粒子結(jié)合抗體時，粒子上形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-粒子結(jié)合抗體復(fù)合物。本實施方式中的判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法是，在形成步驟后，將樣品 中的粒子與樣品中所含的其他成分分離(以下也稱分離步驟)。此分離步驟中分離的樣品 中的粒子包括形成上述含標(biāo)記抗體和HCV核心蛋白的復(fù)合物的粒子。通過進(jìn)行此分離步 驟，從而可從樣品中的粒子除去未在非離子表面活性劑，離液劑，及復(fù)合物的形成中使用的 標(biāo)記抗體等，后述測定步驟中不需要或帶來不良影響的成分。此分離步驟中將樣品中的粒 子與其他成分分離的方法在使用粒子的免疫測定法中公知，可根據(jù)所用粒子適宜設(shè)定。例 如，作為粒子使用了磁性粒子時，可通過磁分離將樣品中的粒子與樣品中所含的其他成分 分離。更具體而言，使磁石靠近裝有第2處理步驟中得到的樣品的容器的壁面。由此，使用 磁石將樣品中的粒子固定于容器的壁面。然后，可通過將粒子固定在容器壁面的狀態(tài)下吸 引除去液相來進(jìn)行分離步驟。另外，作為粒子使用了明膠粒子或膠乳粒子時，可通過離心分 離將樣品中的粒子與樣品中所含的其他成分分離。更具體而言，通過離心分離第2處理步 驟中得到的樣品來通過離心力沉淀粒子。然后，可通過吸引除去上清來進(jìn)行分離步驟。需要說明的是，分離步驟也可包括洗滌步驟。其中，作為洗滌步驟，可例舉向上述 分離步驟中分離的粒子添加洗滌液來懸浮粒子，再將粒子從洗滌液分離的步驟。通過進(jìn)行 此洗滌步驟，可進(jìn)一步除去測定步驟中不需要或帶來不良影響的成分。洗滌步驟也如同分 離步驟，在使用粒子的免疫測定法中公知，根據(jù)所用粒子適宜設(shè)定即可。例如，作為粒子使 用了磁性粒子時，可使用磁分離從洗滌液分離洗滌液中懸浮的粒子。同樣，作為粒子使用了 明膠粒子或膠乳粒子時，可使用離心分離從洗滌液分離洗滌液中懸浮的粒子。其中，作為 洗滌液，優(yōu)選對粒子上形成的復(fù)合物無影響的緩沖液。另外，洗滌液尤其優(yōu)選含表面活性 劑的緩沖液。作為更具體的洗滌液，可例舉例如，TBS-T(0. 05% Tween20)及PBS_T(0. 05% Tween20)等。需要說明的是，也可使用HISCL洗滌液(Sysmex公司制)等市售的洗滌液。本實施方式中，將分離步驟中得到的粒子上形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同 的固相(以下也稱轉(zhuǎn)移步驟)。其中，將粒子上形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相 可基于公知的方法進(jìn)行。例如，形成步驟中，將粒子與含標(biāo)記抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物 通過游離劑以可分離結(jié)合的方式結(jié)合。然后，使用游離劑來，從分離步驟中分離的粒子游離 出含標(biāo)記抗體和HCV核心蛋白的復(fù)合物。然后，可通過接觸游離的復(fù)合物與游離的復(fù)合物 可結(jié)合的固相來將含標(biāo)記抗體和HCV核心蛋白的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到與粒子不同的固相上。“與粒子不同的固相”只要是形成步驟中用到的與粒子不同的固相即可，不特別 限制。作為固相的材料，可例舉例如，膠乳，橡膠，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，苯乙烯-丁二 烯共聚物，聚氯乙烯，聚醋酸乙烯，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸酯，苯乙烯-甲基丙烯酸酯 共聚物，聚甲基丙烯酸縮水甘油酯，丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物，聚偏氟乙烯 (PVDF)，硅酮等的聚合物材料；瓊脂糖；明膠；紅細(xì)胞；硅膠，玻璃，惰性氧化鋁，磁體等的無 機(jī)材料等。也可為這些的1種或2種以上的組合。另外，固相的形狀也只要是免疫測定中 用到的通常的固相的形狀，就不特別限制。可例舉例如，微孔板，試驗管，珠，粒子，納米粒子寸?！坝坞x劑”根據(jù)粒子與含標(biāo)記抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物的結(jié)合的種類適宜選擇 即可，不特別限制。例如，當(dāng)粒子與復(fù)合物通過物理吸附結(jié)合時，可將表面活性劑作為游離 劑使用。另外，當(dāng)粒子與復(fù)合物通過半抗原-抗半抗原抗體結(jié)合時，可將半抗原或半抗原衍生物作為游離劑使用。另外，當(dāng)粒子與復(fù)合物通過離子鍵結(jié)合時，作為游離劑可使用含離 子的溶液。另外，當(dāng)粒子和復(fù)合物通過作為可分離的結(jié)合的配體-受體結(jié)合時，作為游離劑 可使用配體或配體類似體。另外，當(dāng)粒子和復(fù)合物通過作為可分離的結(jié)合的凝集素-糖鏈 結(jié)合時，作為游離劑可使用糖質(zhì)。另外，當(dāng)粒子和復(fù)合物通過生物素-親和素結(jié)合時，作為 游離劑可使用生物素。需要說明的是，當(dāng)粒子和復(fù)合物通過DNA雜交體結(jié)合時，可通過溫度 升高來從粒子游離復(fù)合物。本實施方式中，更具體而言，作為粒子和復(fù)合物的結(jié)合，可例舉通過脫硫生物 素-抗生物素抗體的結(jié)合，及通過DNP-抗DNP抗體的結(jié)合。其中，當(dāng)粒子和復(fù)合物的結(jié)合 是通過脫硫生物素-抗生物素抗體的結(jié)合時，作為游離劑可使用生物素。當(dāng)粒子和復(fù)合物 的結(jié)合是通過DNP-抗DNP抗體的結(jié)合時，作為游離劑可使用DNP-Lys。本實施方式中，作為 粒子和復(fù)合物的結(jié)合，優(yōu)選通過DNP-抗DNP抗體的結(jié)合。本實施方式中，轉(zhuǎn)移到與粒子不同的固相的復(fù)合物的標(biāo)記的，至更具體的測定步 驟的實施方式的模式圖示于圖1。首先，形成步驟中，通過使固定了標(biāo)記抗體，HCV核心蛋 白，結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體，及與第1抗體結(jié)合的第2抗體的粒子接觸，在粒子上形 成標(biāo)記抗體，HCV核心蛋白，第1抗體及第2抗體含的復(fù)合物(標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第 1抗體-第2抗體復(fù)合物)。接下來，通過游離粒子上形成的復(fù)合物中第1抗體及第2抗體 的結(jié)合，將游離的標(biāo)記抗體，HCV核心蛋白及第1抗體含的復(fù)合物(標(biāo)記抗體-HCV核心蛋 白-第1抗體復(fù)合物)從粒子轉(zhuǎn)移到固定有與第1抗體結(jié)合的物質(zhì)的固相。然后，測定轉(zhuǎn) 移到固相的復(fù)合物中所含的標(biāo)記抗體的標(biāo)記。更具體而言，第1抗體被第2抗體識別的抗 原(第2抗原結(jié)合抗原)和可與固定于固相的物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)(固相結(jié)合物質(zhì))修飾。然 后，第1抗體及第2抗體的結(jié)合的游離，可向形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體-第2 抗體復(fù)合物的粒子作用作為游離劑的第2抗體識別的抗原來進(jìn)行。即，可通過第1抗體與 第2抗體的結(jié)合和作為游離劑的抗原與第2抗體的結(jié)合的競爭來將標(biāo)記抗體-HCV核心蛋 白-第1抗體復(fù)合物從粒子游離。再者，第1抗體被可與固定于固相的物質(zhì)(固相固定物 質(zhì))結(jié)合的物質(zhì)修飾。因此，可通過使標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與固相接 觸，將標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到固相。需要說明的是，第1抗體與 固相的結(jié)合是，可利用上述的結(jié)合于HCV核心蛋白和粒子的粒子結(jié)合抗體中，與粒子結(jié)合 部位的與結(jié)合物質(zhì)同樣的結(jié)合能力來進(jìn)行。即，可利用通過例如生物素和親和素類，半抗原 和抗半抗原抗體，鎳和組氨酸標(biāo)簽，谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等的組合的結(jié)合能力。其中，作為固定于固相的物質(zhì)和可與所述物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的結(jié)合，只要是與在所 述標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物和粒子的結(jié)合中用到的結(jié)合不同的結(jié)合，就不特別限制。 具體而言，可例舉例如，半抗原-抗半抗原抗體結(jié)合，DNA雜交體結(jié)合，離子鍵合，生物素-親 和素結(jié)合等。本實施方式中，作為固定于固相的物質(zhì)和可與所述物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的結(jié)合，優(yōu) 選生物素-親和素結(jié)合。本實施方式中，測定轉(zhuǎn)移步驟中得到的轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相的復(fù)合物的 標(biāo)記(以下也稱測定步驟)。其中，測定步驟根據(jù)用于上述標(biāo)記抗體的標(biāo)記物質(zhì)的種類，通 過適當(dāng)?shù)臏y定方法適宜進(jìn)行即可，不特別限制。例如，該標(biāo)記物質(zhì)是酶時，可通過使用適當(dāng) 的裝置測定通過使與針對該酶的底物反應(yīng)產(chǎn)生的光，色等來進(jìn)行。作為該裝置，可例舉分光 光度計，光度計等。另外，標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位體時，可通過使用閃爍計數(shù)器等的以往公
13知的裝置來進(jìn)行測定。本實施方式中判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法基于所述測定步驟的結(jié)果進(jìn) 行(以下也稱判斷步驟)。具體而言，判斷步驟是，當(dāng)測定步驟中檢測到含標(biāo)記抗體及HCV 核心蛋白的復(fù)合物來源的標(biāo)記時，判斷為樣品中有HCV。相反，當(dāng)測定步驟中未檢測到含標(biāo) 記抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物來源的標(biāo)記時，判斷為樣品中無HCV。例如，比較測定步驟 中得到的測定值與預(yù)先設(shè)定的閾值。然后，測定值在閾值以上時，可判斷為樣品中有HCV。 相反，測定值小于閾值時，可判斷為樣品中無HCV。其中閾值根據(jù)公知的方法適宜設(shè)定即可。 作為閾值的設(shè)定方法，例如，本實施方式中，根據(jù)至測定步驟的順序，對于多個預(yù)先已知含 HCV的樣品和多個預(yù)先已知不含HCV的樣品，取得各測定值。然后，可將可二等分含HCV的 樣品之集和不含HCV的樣品之集的中位值作為閾值設(shè)定。本實施方式中免疫測定方法是丙型肝炎病毒(HCV)的免疫測定方法，包括在第1 固相上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體，結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體及HCV核 心蛋白的復(fù)合物的步驟；將第1固相上形成的復(fù)合物從第1固相游離，轉(zhuǎn)移到與第1固相不 同的第2固相的步驟；測定轉(zhuǎn)移到第2固相的復(fù)合物的標(biāo)記的步驟，標(biāo)記抗體及第1抗體分 別結(jié)合到HCV核心蛋白的不同部位，且結(jié)合部位不含SEQ ID NO :2所示的HCV核心蛋白的 第49位的氨基酸。其中，本實施方式中標(biāo)記抗體是與HCV核心蛋白結(jié)合的部位不含SEQ ID NO :2所 示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸的抗體。本實施方式中，作為優(yōu)選標(biāo)記抗體的結(jié)合部 位，可例舉SEQ ID NO 2所示的第21位 第30位或第41位 第48位的氨基酸序列。另外，本實施方式中第1抗體是與HCV核心蛋白結(jié)合的部位不含SEQ ID NO :2所 示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸的抗體。作為優(yōu)選第1抗體的結(jié)合部位，可例舉SEQ ID NO 2所示的第21位 第30位或第41位 第48位的氨基酸序列。即，例如，作為標(biāo)記 抗體，使用了結(jié)合部位是SEQ ID NO :2所示的第21位 第30位的氨基酸序列的抗體時，作 為第1抗體，可使用結(jié)合部位是SEQ ID NO 2所示的第41位 第48位的氨基酸序列的抗 體。另外，作為標(biāo)記抗體，使用了結(jié)合部位是SEQ ID NO :2所示的第41位 第48位的氨基 酸序列的抗體時，作為第1抗體，可使用結(jié)合部位是SEQ ID NO :2所示的第21位 第30位 的氨基酸序列的抗體。本實施方式中，作為標(biāo)記抗體，使用結(jié)合部位是SEQ ID N0:2所示的 第21位 第30位的氨基酸序列的抗體，作為第1抗體，優(yōu)選使用結(jié)合部位是SEQ IDNO 2 所示的第41位 第48位的氨基酸序列的抗體。本實施方式中免疫測定方法在第1固相上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗 體，結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物(以下也稱形成步驟)。第1固相只要是以往的免疫測定方法中使用的通常的第1固相就不特別限制。作 為第1固相的材料，與上述“與粒子不同的固相”的固相的材料相同。作為本實施方式中第1固相，優(yōu)選粒子。其中，粒子只要是免疫測定法中使用的公 知的粒子，就不特別限制。作為具體的粒子，如同上述。其中，標(biāo)記抗體與HCV核心蛋白通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，形成標(biāo)記抗體-HCV核心 蛋白復(fù)合物。再者，結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體與標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白復(fù)合物通過 抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，形成標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。需要說明的是，第1 抗體與HCV核心蛋白通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，形成HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物，HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，也可形成標(biāo)記抗體-HCV核心 蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，本實施方式中形成步驟中，通過將標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合 物結(jié)合到第1固相，從而在第1固相上形成含標(biāo)記抗體、HCV核心蛋白和第1抗體的復(fù)合 物。其中，標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第1固相的結(jié)合是可將標(biāo)記抗 體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第1固相結(jié)合，且通過后述轉(zhuǎn)移步驟可解離地結(jié)合即 可，不特別限制。例如，第1固相與標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物可通過物理 吸附結(jié)合。另外，粒子與標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物可通過離子鍵結(jié)合。另 外，使第1抗體與第1固相結(jié)合部位結(jié)合，將可結(jié)合到第1固相結(jié)合部位的結(jié)合物質(zhì)固定于 第1固相，也可將第1固相與標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物結(jié)合。本實施方式 中標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第1固相的結(jié)合優(yōu)選通過第1固相結(jié)合部 位與結(jié)合物質(zhì)結(jié)合。作為第1固相結(jié)合部位與結(jié)合物質(zhì)的組合，只要是第1固相結(jié)合部位與結(jié)合物質(zhì) 可特異結(jié)合，且于所定條件可解離的物質(zhì)的組合就不特別限制。作為這樣的物質(zhì)的組合，可 例舉例如配體和受體，凝集素和糖鏈，生物素和親和素，DNA雜交體，及抗原和抗體(第2抗 體)等。作為本實施方式中上述物質(zhì)的組合，優(yōu)選抗原和抗體(第2抗體)。其中，作為抗原和抗體(第2抗體)的組合，可例舉半抗原和抗半抗原抗體，脫硫 生物素和抗生物素抗體，及DNP和抗DNP抗體等。本實施方式中，作為抗原和抗體(第2抗 體)的組合，優(yōu)選DNP和抗DNP抗體。本實施方式中的免疫測定方法是將第1固相上形成的復(fù)合物(標(biāo)記抗體-HCV核 心蛋白-第1抗體復(fù)合物)從第1固相游離，轉(zhuǎn)移到與第1固相不同的第2固相(以下也 稱轉(zhuǎn)移步驟)。將標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物從第1固相游離的方法根據(jù)標(biāo)記抗 體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第1固相的結(jié)合的種類適宜選擇即可，不特別限制。 例如，上述結(jié)合如果是通過物理吸附的結(jié)合，可通過使用表面活性劑游離標(biāo)記抗體-HCV核 心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是離子鍵合，可通過使用含離子的溶液游離 標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是第1固相結(jié)合部位與結(jié) 合物質(zhì)的結(jié)合，則通過第1固相結(jié)合部位與結(jié)合物質(zhì)的組合適宜選擇即可，不特別限制。例 如，上述結(jié)合如果是配體-受體結(jié)合，可通過使用配體或配體類似體游離標(biāo)記抗體-HCV核 心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是凝集素-糖鏈結(jié)合，可通過使用糖質(zhì)游離 標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是生物素-親和素結(jié)合， 可通過使用生物素游離標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是 DNA雜交體結(jié)合，可通過升高溫度游離標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上 述結(jié)合如果是半抗原-抗半抗原抗體結(jié)合，可通過使用半抗原或半抗原衍生物游離標(biāo)記抗 體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如果是脫硫生物素-抗生物素抗體結(jié) 合，可通過使用生物素游離標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物。另外，上述結(jié)合如 果是DNP-抗DNP抗體結(jié)合，可通過使用DNP-Lys游離標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體 復(fù)合物。
接下來，可將游離的標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第2固相結(jié)合。第2固相只要是以往的免疫測定方法中使用的通常的第2固相就不特別限制。作 為第2固相的材料，可使用例如，與第1固相相同的材料。另外，第2固相的形狀也可使用 與第1固相的形狀相同的形狀。作為本實施方式中第2固相，優(yōu)選微孔板。其中，標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物與第2固相的結(jié)合只要是與標(biāo)記 抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合物和第1固相的結(jié)合不同的結(jié)合，就不特別限制。例如， 上述復(fù)合物與第1固相的結(jié)合是DNP-抗DNP抗體結(jié)合時，作為上述復(fù)合物與第2固相的結(jié) 合，可例舉半抗原-抗半抗原抗體結(jié)合，DNA雜交體結(jié)合，離子鍵合，生物素-親和素結(jié)合 等。當(dāng)上述復(fù)合物與第1固相的結(jié)合是DNP-抗DNP抗體結(jié)合時，本實施方式中，作為上述 復(fù)合物與第2固相的結(jié)合，優(yōu)選生物素-親和素結(jié)合。本實施方式中的免疫測定方法測定轉(zhuǎn)移到第2固相的復(fù)合物的標(biāo)記(以下也稱測 定步驟)。其中，測定步驟根據(jù)用于上述標(biāo)記抗體的標(biāo)記物質(zhì)的種類，用適當(dāng)?shù)臏y定方法適 宜進(jìn)行即可，不特別限制。例如，該標(biāo)記物質(zhì)是酶時，可通過使用適當(dāng)?shù)难b置測定通過使與 針對該酶的底物反應(yīng)產(chǎn)生的光，色等來進(jìn)行。作為該裝置，可例舉分光光度計，光度計等。 另外，標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位體時，可通過使用閃爍計數(shù)器等的以往公知的裝置來進(jìn)行測 定。本實施方式中免疫測定方法，當(dāng)?shù)?固相是粒子時，還包括將疑似含HCV的樣品 用含堿性物質(zhì)的試劑處理的第1處理步驟，將經(jīng)含堿性物質(zhì)的試劑處理的樣品用含酸性物 質(zhì)的試劑處理的第2處理步驟，洗滌形成復(fù)合物的粒子的洗滌步驟，第1處理步驟及第2處 理步驟中使用的試劑中的至少1種可含還原劑。其中，第1處理步驟及第2處理步驟與上述第1處理步驟及第2處理步驟相同。洗滌步驟中收集液體中分散的粒子，除去液體，其后，添加洗滌液而再將粒子分散 到液體中。通過進(jìn)行此洗滌步驟，從而可除去未在標(biāo)記抗體-HCV核心蛋白-第1抗體復(fù)合 物的形成中使用的標(biāo)記抗體，非離子表面活性劑，及離液劑等的測定步驟中不需要或帶來 不良影響的成分。洗滌步驟中，收集液體中分散的粒子的方法在使用粒子的免疫測定法中公知，可 根據(jù)所用粒子適宜設(shè)定。例如，作為粒子使用了磁性粒子時，可通過磁分離收集液體中分散 的粒子。更具體而言，首先，使磁石靠近裝有第2處理步驟中得到的樣品的容器的壁面，使 用磁石將樣品中的粒子固定于容器的壁面。然后，以將粒子固定在容器的壁面的狀態(tài)吸引 除去液體。作為粒子使用了磁性粒子時，可通過以上處理，收集液體中分散的粒子。另外， 作為粒子使用了明膠粒子或膠乳粒子時，可通過離心分離收集液體中分散的粒子。更具體 而言，首先，通過將第2處理步驟中得到的樣品離心分離，通過離心力沉淀粒子。然后，以沉 淀粒子的狀態(tài)吸引除去液體。作為粒子使用了明膠粒子或膠乳粒子時，可通過以上處理收 集液體中分散的粒子。需要說明的是，洗滌步驟中添加洗滌液而懸浮粒子，再將粒子分散到液體中。其 中，作為洗滌液，優(yōu)選對粒子上形成的復(fù)合物無影響的緩沖液。另外，洗滌液尤其優(yōu)選含 表面活性劑的緩沖液。作為更具體的洗滌液，可例舉例如，TBS-T (0. 05% Tween20)及 PBS-T (0. 05% Tween20)等。需要說明的是，也可使用HISCL洗滌液(Sysmex公司制)等市 售的洗滌液。
另外，洗滌步驟進(jìn)行次數(shù)只要是對粒子上形成的復(fù)合物無影響的次數(shù)就不特別限 制?？稍偻ㄟ^反復(fù)洗滌步驟除去測定步驟中不需要或帶來不良影響的成分。本實施方式中，第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種可含還 原劑。第1固相是粒子時，優(yōu)選上述試劑中的至少一種含還原劑。第1固相是粒子時，通過 上述試劑中的至少一種含還原劑，洗滌步驟中，將收集的粒子再分散到液體中時，可防止 粒子凝集。其中，還原劑只要是對形成步驟無影響的還原劑，就不特別限制。本實施方式中作 為還原劑，尤其優(yōu)選解離蛋白的二硫鍵的還原劑。作為更具體的還原劑，與上述還原劑相 同。上述試劑所含的還原劑的濃度根據(jù)所用還原劑的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特別限 定。例如，作為還原劑使用巰基乙胺時，巰基乙胺的濃度優(yōu)選10 60mM。本實施方式中，第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑中的至少一種還優(yōu)選 含無機(jī)鹽類。作為本實施方式中無機(jī)鹽類，與上述無機(jī)鹽類相同。上述試劑所含的無機(jī)鹽類的濃度根據(jù)所用無機(jī)鹽類的種類適宜調(diào)節(jié)即可，不特別 限定。例如，作為無機(jī)鹽類使用氯化鈉時，氯化鈉的濃度優(yōu)選0. 1 1.0M。需要說明的是，與HCV核心蛋白結(jié)合的部位不含SEQ ID NO 2所示的HCV核心蛋 白的第49位的氨基酸抗體可從使用本身公知的方法作制的雜交瘤得到。S卩，用根據(jù)需要與適當(dāng)?shù)淖魟┗旌系腍CV核心蛋白免疫適當(dāng)?shù)牟溉閯游?例如小 鼠，大鼠等)。然后，通過將該動物的脾臟細(xì)胞，淋巴節(jié)細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等的抗體產(chǎn)生細(xì)胞 與適當(dāng)?shù)牟溉閯游?例如小鼠，大鼠等)來源的骨髓瘤細(xì)胞融合，從而可得到雜交瘤。通常， 抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞是同種的動物來源的。細(xì)胞融合可通過在例如適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，在聚乙二醇等的存在下融合抗體產(chǎn)生細(xì) 胞和骨髓瘤細(xì)胞的PEG法等來進(jìn)行。細(xì)胞融合后，在HAT培養(yǎng)基等的選擇培養(yǎng)基中選擇雜 交瘤，就產(chǎn)生識別雜交瘤的HCV核心蛋白的抗體的能力，根據(jù)常規(guī)方法(例如酶聯(lián)免疫測定 法(EIA))進(jìn)行篩選。接下來，根據(jù)常規(guī)方法(例如限界稀釋法)克隆產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w的雜 交瘤，選擇產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。如上所述可得雜交瘤，則其后進(jìn)行雜交瘤產(chǎn)生的抗體的表位分析。由此可得到與 HCV核心蛋白結(jié)合的部位不含SEQ ID N0:2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸的抗 體。更具體的產(chǎn)生與HCV核心蛋白結(jié)合的抗體的雜交瘤的制備方法如下所示。<免疫抗原HCV來源的多肽的表達(dá)及純化>(A)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建合并編碼SEQ ID NO :1所示的HCV核心區(qū)的第1 160位的氨基酸序列的DNA而 得到以下質(zhì)粒。pUC · pR-160 =SEQ ID NO 1 所示的 HCV 核心區(qū)蛋白(pR-160)的質(zhì)粒SEQ ID NO 1MSTNPKPQRKTKRNANRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKD RRSTGKSWGKPGYPffPLYGNEGCGWAGffLLSPRGSRPTffGLTDPRHRSRNLGKVIDTITCGFADLMGYIPVVGAPV GGVARALAHGVRVLED
將pUC · pR-160的DNA Iyg在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20 μ 1〔 20mMTris-HCl (pH8. 5)，IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmM KCl，15 單位的 Bam Hl 及 15 單 位的Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。切出含約480bp 的DNA片段的部位，使用QIAquick凝膠提取試劑盒OiIAGEN公司制)用瓊脂糖純化編碼 pR-160 的 DNA 片段。接下來，將表達(dá)載體pQE_30(QIAGEN公司制)在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20μ 1〔 20mM Tris-HCl (pH8. 5), IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmM KC1，15 單位的 Bam Hl 及 15 單位的Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。切出含約 3000bp的DNA片段的部位，使用QIAquick凝膠提取試劑盒OjIAGEN公司制)用瓊脂糖純化 經(jīng)BamHI-HindIII處理的載體DNA。使用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1 (TakaraBio公司制)進(jìn)行連接得到的經(jīng) BamHI-HindIII處理的載體DNA Iyg與編碼pR-160的DNA片段約0. 3pmol的反應(yīng)。使用編碼pR-160的DNA片段的連接反應(yīng)中得到的反應(yīng)液10 μ 1來轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM-109株(TakaraBio公司制)。轉(zhuǎn)化中使用的感受態(tài)大腸桿菌株使用大腸桿菌JM109感 受態(tài)細(xì)胞(TakaraBio公司制)。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含100 μ g/ml氨芐西林的LB 平板(1 %胰蛋白酶，1.0% NaCl，0.5%酵母提取物，1.5%瓊脂)上，于37°C溫育過夜。平板 上生成的菌的集落用白金耳取1耳，移到含100 μ g/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白 酶，1. 0% NaCl, 0. 5%酵母提取物)，于37°C培養(yǎng)過夜。將1. 5ml的菌培養(yǎng)液離心集菌，使用 QIAprep SpinMiniprep Kit (Qiagen公司制)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的少量制備。得到的經(jīng)連接處理的DNA 1 μ g在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20 μ 1 (20mM Tris-HCl (pH8. 5)，IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmMKCl, 15 單位的 Bam Hl 及 15 單位的 Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，選擇產(chǎn)生約480bp的 BamHI-HindIII 片段的 pQE_30pR_160 表達(dá)質(zhì)粒。(B)pQE-30pR-160編碼的HCV核心來源的多肽(pR-160)的表達(dá)及純化將攜帶pQE-30pR_160表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌JM109株接種于含100 μ g/ml氨芐西 林的IOml的LB培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)液全量接種于含100 μ g/ml氨芐西林 的200ml的LB培養(yǎng)基，再于37°C培養(yǎng)。0D600為0. 5 0. 7時加入異丙基- β -D-硫代半 乳糖苷至終濃度Immol/mL，再于37°C培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)液離心分離來收集菌體。接下來進(jìn)行菌體沉淀的表面活性劑處理的操作。濕重量約Ig的菌體中加入2mL的BugBuster Reagent (Novagen公司制)(室溫)， 不使起泡地懸浮。使用旋轉(zhuǎn)式震動器于低速緩慢震動溫育10 20分鐘。以7500rpm離心 10分鐘，除去上清。離心后的不溶性的細(xì)胞殘渣中加入1. 8mL的BugBuster Reagent (室 溫)，不使起泡地再懸浮。懸浮液中加入溶菌酶至終濃度200 μ g/mL。使用旋轉(zhuǎn)式震動器于 低速緩慢震動溫育5分鐘。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。接下來進(jìn)行了不溶性級分的可溶化及純化。離心后，向得到的不溶性級分中加8M 尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlM Tris-Cl ； (pH = 8. 0)lmL，再懸浮。以 7500rpm 離心 10 分鐘，除
去上清。離心后的不溶性級分中加入8M尿素，0.IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH = 9. 0) ImL 來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。
離心后的不溶性級分中加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH =
10.0) ImL來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。離心后的不溶性級分中加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH =
11.0) ImL來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。離心后的不溶性級分中加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH =
12.0) ImL,可溶化提取HCV來源的多肽(pR-160)。通過使用了充鎳的瓊脂糖凝膠的金屬鰲合物親和層析進(jìn)行多肽的純化，從可溶化 的提取物得到pR-160?！措s交瘤的制備〉(A)小鼠的免疫向含pR-160抗原100 μ g 1000 μ g的磷酸緩沖液(PBS) 100 μ L混合弗氏完全佐 劑(FCA) 100 μ 1而乳化來制備FCA pR-160抗原溶液200 μ 1。另外，除代替FCA使用弗氏不 完全佐劑(FIA)以外，如同上述順序制備FIA pR-160抗原溶液200 μ L。通過將FCA pR-160抗原溶液200 μ 1給7 8周齡的雌Balb/c小鼠腹腔內(nèi)施用來 初次免疫。初次免疫后，每2 3周使用FIA pR-160抗原溶液200 μ L進(jìn)行追加免疫。脾 細(xì)胞分離的10日前及3日前，靜脈施用pR-160抗原200 μ 1。最后的施用起3日后分離脾 細(xì)胞，與P3)(63-Ag8 · 653小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過PEG法融合，從而制備雜交瘤。(B)雜交瘤的培養(yǎng)將雜交瘤懸浮于HAT培養(yǎng)基至2. 5X IO6細(xì)胞/ml，向96孔平板(Corning公司制； 以下稱為培養(yǎng)用平板)的各孔分注至2.5X105細(xì)胞/孔。將培養(yǎng)用平板于37°0，8%0)2的 恒溫槽內(nèi)靜置，開始雜交瘤的培養(yǎng)。培養(yǎng)10日以上至出現(xiàn)雜交瘤的集落時，進(jìn)行產(chǎn)生單克 隆抗體的雜交瘤的篩選。(C)雜交瘤的篩選向含 0. lw/v% NaN3 的 0. IM 磷酸緩沖液(PBS ρΗ7· 5)添加 pR-160 抗原至 pR-160 抗原的濃度達(dá)0. 5μ g/ml來制備固定用pR-160抗原溶液。將此固定用pR_160抗原溶液 100 μ 1分注于Immuno Module (NUNC公司制)的各孔中(以下稱為抗原固定平板)。于4°C 靜置過夜后，用以0. 05 %的濃度含Tween20的PBS緩沖液(以下，緩沖液A稱為)洗滌3 次。洗滌后，向抗原固定平板的各孔添加以的濃度含BSA的PBS(以下，緩沖液B稱 為)300μ 1，于2 8°C靜置保存4小時以上?？乖潭ㄆ桨逶谑褂们坝? 8°C保存。除去抗原固定平板中的緩沖液B。除去后，向抗原固定平板的各孔各添加75μ 1緩 沖液B。再者，從培養(yǎng)用平板的各孔取出上述雜交瘤的培養(yǎng)中的培養(yǎng)上清，向抗原固定平板 的各孔各添加25μ1。添加緩沖液B及培養(yǎng)上清后，于室溫攪拌一小時。攪拌后，用緩沖液 A進(jìn)行抗原固定平板的各孔的洗滌3次。洗滌后，向抗原固定平板的各孔各添加100 μ 1用 緩沖液B稀釋10000倍的經(jīng)辣根過氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗小鼠Ig多克隆抗體(DAK0公 司制；Code No.P0447)，于室溫反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，用緩沖液A進(jìn)行抗原固定平板的各孔 的洗滌3次。洗滌后，各加入100 μ L含作為對于POD的底物的對苯二胺(OPD)的底物液， 于室溫靜置10分鐘。接著，向抗原固定平板的各孔各加入100 μ L含2Ν H2SO4的反應(yīng)停止 液后，對于各孔中的反應(yīng)液，使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司制)測定492nm處的吸 光度。
將產(chǎn)生與可如上所述得到的SEQ ID NO 1所示的HCV核心蛋白結(jié)合的抗體的雜 交瘤命名為HCF4-801及HE25。HCF4-801以受領(lǐng)號NITE AP-844于2009年11月25日被 獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心受領(lǐng)，以保藏號NITE BP-844保 藏。以下，將該雜交瘤產(chǎn)生的抗體稱為HCF4-801抗體。HE25以受領(lǐng)號NITE AP-843于2009年11月25日被獨立行政法人制品評價技術(shù) 基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心受領(lǐng)，以保藏號NITEBP-843保藏。以下，將該雜交瘤產(chǎn)生的 抗體稱為HE25抗體。
實施例實施例1<HCV來源的多肽的表達(dá)及純化>(A)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建合并編碼SEQ ID NO :2，3，或4所示的HCV核心區(qū)的第1 160位的氨基酸序列 的DNA而得到以下質(zhì)粒。pUC .HCV-Jlb =SEQ ID NO 2所示的HCV基因型Ib的核心區(qū)蛋白(HCV-Jlb)的質(zhì) 粒pUC -HCV-JlbT49P =SEQ ID NO 3所示的第49位的氨基酸蘇氨酸突變?yōu)楦彼岬?HCV基因型Ib的核心區(qū)蛋白(HCV-JltyT49P)的質(zhì)粒pUC · HCV-3bNE137 :SEQ ID NO :4 所示的 HCV 基因型 3bNE137 株的核心區(qū)蛋白 (HCV-3bNE137)的質(zhì)粒SEQ ID NO 2MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKA RRPEGRTWAQPGYPffPLYGNEGMGWAGffLLSPRGSRPSffGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPL GGAARALAHGVRVLEDSEQ ID NO 3MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRAPRKTSERSQPRGRRQPIPKA RRPEGRTWAQPGYPffPLYGNEGMGWAGffLLSPRGSRPSffGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPL GGAARALAHGVRVLEDSEQ ID NO 4MSTLPKPQRQTKRNTYRRPQNVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGPRLGVRAVRKTSERSQPRGRRQPIPKA RSREGRSWAQPGYPffPLYGNEGCGWAGffLLSPRGSRPSffGPNDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLIGAPV GGVARALAHGVRALED將pUC · HCV-Jlb的DNA Iyg在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20 μ 1〔 20mMTris-HCl (pH8. 5)，IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmM KCl，15 單位的 Bam Hl 及 15 單 位的Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。切出含約480bp 的DNA片段的部位，使用QIAquick凝膠提取試劑盒OjIAGEN公司制)通過瓊脂糖純化編碼 HCV-Jlb 的 DNA 片段。接下來，將表達(dá)載體pQE-30(QIAGEN公司制)在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20μ l〔20mM Tris-HCl (pH8. 5), IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmM KC1，15 單位的 Bam Hl 及 15 單位的Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。切出含約3000bp 的DNA片段的部位，使用QIAquick凝膠提取試劑盒OjIAGEN公司制)通過瓊脂糖純化經(jīng) BamHI-HindIII 處理的載體 DNA。使用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1 (TakaraBio公司制)進(jìn)行連接得到的經(jīng) BamHI-HindIII處理的載體DNA Iyg和編碼HCV-Jlb的DNA片段約0. 3pmol的反應(yīng)。使用編碼HCV-Jlb的DNA片段的連接反應(yīng)中得到的反應(yīng)液10 μ 1來轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM-109株(TakaraBio公司制)。轉(zhuǎn)化中使用的感受態(tài)大腸桿菌株使用大腸桿菌JM109感 受態(tài)細(xì)胞(TakaraBio公司制)。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含100 μ g/ml氨芐西林的LB 平板(1 %胰蛋白酶，1.0% NaCl，0.5%酵母提取物，1.5%瓊脂)上，于37°C溫育過夜。取1 耳平板上生成的菌的集落，移到含100 μ g/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基(1 %胰蛋白酶，1.0% NaCl,0. 5%酵母提取物)，于37°C培養(yǎng)過夜。將1. 5ml的菌培養(yǎng)液離心集菌，使用QIApr印 Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的少量制備。將得到的經(jīng)連接處理的DNA 1 μ g在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)液20 μ 1 (20mM Tris-HCl (pH8. 5)，IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇，IOOmMKCl, 15 單位的 Bam Hl 及 15 單位的 Hind III酶〕中于37°C消化1小時，然后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，選擇產(chǎn)生約480bp的 BamHI-HindIII 片段的 pQE_30HCV-Jlb 表達(dá)質(zhì)粒。需要說明的是，如同使用pUC · HCV-Jlb來選擇pQE-30HCV_Jlb表達(dá)質(zhì)粒的順序， 使用 pUC · HCV-JlbT49P 來選擇 ρ0Ε_30Η<:ν-1Μ49Ρ 表達(dá)質(zhì)粒，使用 pUC · HCV-3bNE137 來 選擇pQE-30HCV-3bNE137表達(dá)質(zhì)粒。(B)pQE-30HCV-Jlb編碼的HCV核心來源的多肽(HCV-Jlb)的表達(dá)及純化將攜帶pQE-30HCV_Jlb表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌JM109株接種于含100 μ g/ml氨芐西 林的IOml的LB培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)液全量接種于含100 μ g/ml氨芐西林 的200ml的LB培養(yǎng)基，再于37°C培養(yǎng)。0D600為0. 5 0. 7時加入異丙基- β -D-硫代半 乳糖苷至終濃度Immol/mL，再于37°C培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)液離心分離來收集菌體。接下來進(jìn)行了菌體沉淀的表面活性劑處理的操作。向濕重量約Ig的菌體中加入2mL的BugBuster Reagent (Novagen公司制)(室 溫)，不使起泡地懸浮。使用旋轉(zhuǎn)式震動器于低速緩慢震動溫育10 20分鐘。以7500rpm離 心10分鐘，除去上清。離心后的不溶性的細(xì)胞殘渣中加入1. 8mL的BugBuster Reagent (室 溫)，不使起泡地再懸浮。懸浮液中加入溶菌酶至終濃度200 μ g/mL。使用旋轉(zhuǎn)式震動器于 低速緩慢震動溫育5分鐘。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。接下來進(jìn)行了不溶性級分的可溶化及純化。離心后，向得到的不溶性級分加入8M 尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlM Tris-Cl ； (pH = 8. 0) ImL 來再懸浮。以 7500rpm 離心 10 分鐘，
除去上清。向離心后的不溶性級分加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlM Tris-Cl ； (pH =
9.0) ImL來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。向離心后的不溶性級分加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH =
10.0) ImL來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。向離心后的不溶性級分加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH =
11.0) ImL來再懸浮。以7500rpm離心10分鐘，除去上清。
向離心后的不溶性級分加入8M尿素，0. IM NaH2PO4,0. OlMTris-Cl ； (pH = 12. 0) ImL,可溶化提取HCV來源的多肽(HCV-Jlb)。通過使用了充鎳的瓊脂糖凝膠的金屬鰲合物親和層析進(jìn)行多肽的純化，從可溶化 的提取物得到HCV-Jlb。需要說明的是，如同使用pQE-30HCV_Jlb來得到HCV-Jlb的順序，使用 pQE-30HCV-JlbT49P 表達(dá)質(zhì)粒來得到 HCV_JlbT49P，使用 pQE-30HCV_;3bNE137 表達(dá)質(zhì)粒來得 到 HCV-3bNE137。實施例2<表位分析>使用實施例1中得到的HCV-Jlb及HCV-JltyT49P和表1所示的合成肽CDP-2， ⑶P-2-1，⑶P-3，及⑶P-3-1分析了作為抗HCV核心蛋白單克隆抗體的HCF4-801抗體及 HE25抗體的表位。需要說明的是，CDP-2，CDP-2-l，CDP-3，及CDP-3-1分別是綴合鑰孔戚血 藍(lán)素的合成肽，外部委托Operon Biotechnology株式會社制備而制成。表1 :HCV核心來源的的肽的氨基酸序列表
肽名氨基酸序列AA配置SEQ ID NO5CDP-2DVKFPGGGQIVGGVYLLPRR21 40SEQ ID NO6CDP-2-1DVKFPGGGQI21 30SEQ ID NO7CDP-3GPRLGVRATRKTSKRSQPRG41 60SEQ ID NO8CDP-3-1GPRLGVRATR41 50 (A) CDP-2與HCF4-801抗體的反應(yīng)性的確認(rèn)向含0. lw/v% NaN3的0. IM磷酸緩沖液(PBS ρΗ7· 5)中添加CDP-2至CDP-2的濃 度達(dá)0. 5 μ g/ml，從而制備固定用⑶P-2溶液。將此固定用⑶P-2溶液100 μ 1分注于Immuno Module (NUNC公司制)的孔(以下稱為抗原固定平板)。于4°C靜置過夜后，用以0. 05%的 濃度含Tween20的PBS緩沖液(以下稱為緩沖液A)洗滌3次。洗滌后，向肽固定平板的孔 添加以lw/v%的濃度含BSA的PBS(以下稱為緩沖液Β)300μ 1，于2 8°C靜置保存4小時 以上?？乖潭ㄆ桨逶谑褂们坝? 8°C保存。除去CDP-2固定平板中的緩沖液B。除去后，向抗原固定平板的孔各添加75 μ 1緩 沖液B。再者，將HCF4-801雜交瘤的培養(yǎng)中的培養(yǎng)上清從培養(yǎng)用平板的孔取出，向抗原固 定平板的孔添加25μ1。添加緩沖液B及培養(yǎng)上清后，于室溫攪拌1小時。攪拌后，用緩沖 液A進(jìn)行抗原固定平板的孔的洗滌3次。洗滌后，將用緩沖液B稀釋10000倍的經(jīng)辣根過 氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗小鼠Ig多克隆抗體(DAK0公司制；Code No. P0447) 100 μ 1添加 到抗原固定平板的孔，于室溫反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，用緩沖液A進(jìn)行抗原固定平板的孔的 洗滌3次。洗滌后，加入100 μ L含作為對于POD的底物的對苯二胺(OPD)的底物液，于室 溫靜置10分鐘。接著，將100 μ L含2Ν 的反應(yīng)停止液加入抗原固定平板的孔后，對于 孔中的反應(yīng)液，使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司制)來測定492nm處的吸光度。吸光 度0. 15以上視為有反應(yīng)性，小于0. 15視為無反應(yīng)性。(B) CDP-2與HE25抗體的反應(yīng)性的確認(rèn)如同⑶P-2與HCF4-801抗體的反應(yīng)性的確認(rèn)進(jìn)行。需要說明的是，如同實施例2(A)及實施例2(B)，對于CDP_2_1，CDP-3，CDP_3_1，HCV-Jlb及HCV-JlbT49P，也進(jìn)行了 HCF4-801抗體的反應(yīng)性的確認(rèn)及HE25抗體的反應(yīng)性的 確認(rèn)。其結(jié)果如表2所示。表2 :HCF4-801抗體及HE25抗體與各合成多肽的反應(yīng)性的有無
權(quán)利要求
1.利用使用粒子的免疫測定法預(yù)處理丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白檢測用樣品的方 法，包括眷將疑似含丙型肝炎病毒的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理；及 將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性物質(zhì)的試劑處理； 其中含堿性物質(zhì)的試劑及含酸性物質(zhì)的試劑中的至少一種含還原劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中還原劑是選自下列的至少1種巰基乙胺，巰基乙醇，二硫 蘇糖醇，半胱氨酸，二硫丁四醇，硼氫化鈉及膦。
3.權(quán)利要求1的方法，其中第1處理步驟中使用的試劑還含非離子表面活性劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中非離子表面活性劑選自聚氧乙烯系非離子表面活性劑。
5.權(quán)利要求1的方法，其中第1處理步驟中使用的試劑還含離液劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中離液劑是選自下列的至少1種尿素，胍鹽酸鹽，水楊酸鈉， 乙酰胺及甲酰胺。
7.權(quán)利要求1的方法，其中堿性物質(zhì)是選自下列的至少1種氫氧化鈉，氫氧化鉀及氫氧化鎂。
8.權(quán)利要求1的方法，其中酸性物質(zhì)是選自下列的至少1種醋酸，乳酸，檸檬酸，蘋果 酸，琥珀酸，磷酸，蟻酸，富馬酸，酒石酸，鹽酸及硫酸。
9.權(quán)利要求1的方法，其中粒子是磁性粒子。
10.權(quán)利要求1 9中任一項的方法，其中第1處理步驟及第2處理步驟中使用的試劑 中的至少一種含無機(jī)鹽類。
11.權(quán)利要求10的方法，其中無機(jī)鹽類是選自下列的至少1種氯化鈉，氯化鉀，氯化 鎂及硫酸鈉。
12.權(quán)利要求9的方法，其中免疫測定法是將液相中形成的含HCV核心蛋白，抗HCV核 心蛋白抗體及磁性粒子的復(fù)合物通過磁分離來從液相分離而檢測HCV核心蛋白的免疫測定法。
13.利用使用粒子的免疫測定法的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白檢測用試劑盒，其含 含堿性物質(zhì)的第1試劑；及 含酸性物質(zhì)的第2試劑；其中第1試劑及第2試劑中的至少一種含還原劑。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中第1試劑及第2試劑中的至少一種含無機(jī)鹽類。
15.權(quán)利要求13的試劑盒，其中第1試劑還含非離子表面活性劑。
16.權(quán)利要求13的試劑盒，其中第1試劑還含離液劑。
17.權(quán)利要求13 16中任一項的試劑盒，其還含 含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體的第3試劑； 含結(jié)合于HCV核心蛋白的第1抗體的第4試劑； 眷含粒子的第5試劑； 含與第1抗體及粒子結(jié)合的第2抗體的第6試劑；及 固定有與第1抗體結(jié)合的物質(zhì)的固相。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中標(biāo)記抗體及第1抗體分別結(jié)合到HCV核心蛋白的不同 部位，且結(jié)合部位中不含SEQ ID NO :2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中標(biāo)記抗體及第1抗體的結(jié)合部位是SEQID N0:2所示 的HCV核心蛋白的第21 30位的氨基酸序列或第41 48位的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中用作標(biāo)記抗體及第1抗體的抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的單 克隆抗體，所述雜交瘤選自以保藏號NITEBP-844及NITE BP-843保藏于獨立行政法人制品 評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心的雜交瘤。
21.判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法，包括眷將疑似含丙型肝炎病毒的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理； 將第1處理步驟中得到的樣品用含酸性物質(zhì)的試劑處理； 在粒子上形成復(fù)合物，所述復(fù)合物含■結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體、及■第2處理步驟中得到的樣品中所含的HCV核心蛋白； 形成步驟后，將樣品中的粒子與樣品中所含的其他成分分離；眷將分離步驟中得到的粒子上形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相； 測定轉(zhuǎn)移步驟中得到的轉(zhuǎn)移到與所述粒子不同的固相的復(fù)合物的標(biāo)記；及 基于測定步驟的結(jié)果，判斷樣品中有無丙型肝炎病毒；其中含堿性物質(zhì)的試劑及含酸性物質(zhì)的試劑中的至少一種含還原劑。
22.丙型肝炎病毒(HCV)的免疫測定方法，包括 在第1固相上形成含結(jié)合于HCV核心蛋白的標(biāo)記抗體，結(jié)合于HCV核心蛋白的第1 抗體及HCV核心蛋白的復(fù)合物； 將第1固相上形成的復(fù)合物從第1固相游離，轉(zhuǎn)移到與第1固相不同的第2固相；及 測定轉(zhuǎn)移到第2固相的復(fù)合物的標(biāo)記；其中，標(biāo)記抗體及第1抗體分別結(jié)合到HCV核心蛋白的不同部位，且結(jié)合部位不含SEQ ID NO 2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明提供HCV核心蛋白檢測用樣品的預(yù)處理方法，其特征在于，在利用使用粒子的免疫測定法的HCV核心蛋白的檢測中，將疑似含丙型肝炎病毒(HCV)的樣品用含堿性物質(zhì)的試劑處理，再用含酸性物質(zhì)的試劑中和處理時，任何試劑含還原劑；另外提供，HCV核心蛋白檢測用試劑盒，判斷樣品中有無丙型肝炎病毒的方法，及HCV的免疫測定方法。
文檔編號G01N33/68GK102081018SQ20101053948
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者山垣內(nèi)孝博, 武田和彥, 高馬卓也 申請人:希森美康株式會社