一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，具體為在培養(yǎng)基上接種大腸桿菌，低溫過夜培養(yǎng)，然后升溫補料培養(yǎng)，適時誘導收獲菌體。本發(fā)明的發(fā)酵工藝整個過程都是在同一個發(fā)酵罐中進行，沒有過度消耗碳源，菌體生活環(huán)境保持穩(wěn)定，這樣在后續(xù)的發(fā)酵過程中菌體可以保持很快的生長速度，效率大大提高，工藝穩(wěn)定性也得以增強。同時免去了種子擴大的設(shè)備需求，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)醫(yī)藥生物工程與【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝。
技術(shù)背景
[0002]大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，廣泛用于重組蛋白表達，在各大科研院所和制藥企業(yè)發(fā)酵規(guī)模已經(jīng)超過千噸。
[0003]然而，由于在發(fā)酵工藝上長期沒有大的技術(shù)突破，目前發(fā)酵仍然停留在逐級放大菌種后再接種的模式上。由于逐級接種相當于使菌種不停地適應新環(huán)境，尤其是在某些發(fā)酵工藝中菌種擴大培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基成分不一致的時候更是這樣。即使是成分一致，在菌種擴大過程中，由于菌體的生長消耗，也會使得培養(yǎng)基成分發(fā)生改變，從而與后續(xù)的接種培養(yǎng)基成分不一致，甚至連PH也不一致。
[0004]很多情況下，由于菌體需要時間來適應新環(huán)境，導致菌體必須經(jīng)過一個延遲期(Lag phase)。在實際操作中，這個時間可能是2小時，也可能是9小時，取決于菌體適應新環(huán)境的能力，每個批次可能都不一樣，這就給工藝穩(wěn)定性提出了挑戰(zhàn)。
[0005]本發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中改變傳統(tǒng)工藝中的37 °C逐級放大培養(yǎng)模式，不需要更換培養(yǎng)基和發(fā)酵罐，能夠在一個發(fā)酵罐中完成所有的發(fā)酵工藝。通過采用降低溫度的方法可以有效地降低菌體的新陳代謝水平，在低溫下，菌體的生長很慢，幾乎要用3-5倍的時間來達到常規(guī)發(fā)酵溫度下的生長狀態(tài)。同時，由于葡萄糖的預先加入，菌體受制于分解代謝物阻遏，會優(yōu)先利用葡萄糖，即使培養(yǎng)基中可能混有乳糖類的雜質(zhì)，也不會產(chǎn)生誘導效應，在這樣的條件下，菌體能夠安然度過夜間的12-20小時，一旦開始升溫和補加碳源，可以直接進入對數(shù)生長期進行快速增長。該方法可以使菌體在生產(chǎn)培養(yǎng)基中進行長時間的適應，但是并不快速增殖，可以避免菌體自身新陳代謝消耗培養(yǎng)基成分，同時避免菌體產(chǎn)生代謝廢物，使得菌體的新陳代謝系統(tǒng)做好準備。這樣的一個處理就可以使菌體度過延遲期，一旦開始發(fā)酵，直接進入對數(shù)生長期(Log phase)，發(fā)酵時間將會比傳統(tǒng)工藝短至少6-9小時，大大降低了生產(chǎn)成本、提高了工作效率，節(jié)約了生產(chǎn)時間和原輔料，工藝可控，批間一致性增強，穩(wěn)定性高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，進而使發(fā)酵的效率大大提高，工藝穩(wěn)定性也得以增強。同時免去種子擴大的設(shè)備需求，降低成本。
[0007]為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝在同一個發(fā)酵罐中完成，含有如下步驟: (O培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的配制和滅菌；
(2)接種并在低溫下過夜培養(yǎng)；
(3)升溫并開始補料培養(yǎng)；(4)誘導并收獲菌體。
[0008]其中，
(O培養(yǎng)基的配制和滅菌過程為:
用純化水分別配制濃度為5-15g/L的甘油、0.ι-lg/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L消泡劑、5-15g/L的十二水磷酸氫二鈉、2_10g/L的磷酸二氫鉀、l_5g/L的氯化銨、0.2-lg/L的硫酸鈉，配制后均勻混合制得混合溶液；用5-lOmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合溶液的PH值至7.2±0.2，并于110-115°C高壓蒸汽滅菌15-30分鐘；滅菌完成并冷卻至20-50°C后，添加已經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的微量元素濃縮液至終濃度如下:七水硫酸鎂200-600mg/L、二水氯化鈣10_30mg/L、七水硫酸亞鐵10_50mg/L、四水鑰酸銨0.01-0.lmg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化鈷0.01-0.lmg/L、五水硫酸銅
0.01-0.lmg/L、一水硫酸錳 0.05-0.5 mg/L、七水硫酸鋅 0.01-0.lmg/L ；
(2)流加培養(yǎng)液的配制和滅菌過程為:
用純化水配制濃度為500-1000g/L的甘油，在115-121°C高壓滅菌20-30分鐘，冷卻至室溫；IPTG 1-10 mol/L,純化水配制后經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌；用純化水配制濃度為5-10mol/L的氫氧化鈉；
(3)接種并在低溫下過夜培養(yǎng)的過程為:
維持培養(yǎng)基溫度為2 0-35°C、通氣量為0.5-lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速為100-500rpm、罐壓為
0.05-0.1bar，向發(fā)酵罐中按1:50，000-1: 5，000的比例接種吸光度0D600為0.2-1的凍存大腸桿菌甘油菌種，保持此發(fā)酵條件進行過夜培養(yǎng)。
[0009](4)升溫并開始補料培養(yǎng)的過程為:
低溫過夜培養(yǎng)12-20小時后，升高發(fā)酵溫度至35-38°C，提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，維持溶氧比率于10-30%，補加甘油流加培養(yǎng)液，維持發(fā)酵罐中甘油濃度為5-15g/L，氫氧化鈉流加培養(yǎng)液由發(fā)酵罐控制，將PH維持在7.2±0.2 ;
(5)誘導并收獲菌體的過程為:
將發(fā)酵液吸光度0D600升高至10-60時進行誘導，誘導之后4-6小時下罐，收集發(fā)酵液，離心收集菌體。
[0010]其中，培養(yǎng)基的組成為5-15g/L的甘油、0.ι-lg/L的葡萄糖、5_30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L的消泡劑、5-15g/L的十二水磷酸氫二鈉、2_10g/L的磷酸二氫鉀、l-5g/L的氯化銨、0.2-lg/L的硫酸鈉、200-600mg/L的七水硫酸鎂、10_30mg/L的二水氯化鈣、10-50mg/L的七水硫酸亞鐵、0.01-0.lmg/L的四水鑰酸銨、0.1-0.5mg/L的硼酸、
0.01-0.lmg/L的六水氯化鈷、0.01-0.lmg/L的五水硫酸銅、0.05-0.5mg/L的一水硫酸錳、
0.01-0.lmg/L的七水硫酸鋅。
[0011]其中，流加培養(yǎng)液的組成為的500-1000g/L甘油、l-10mol/L的IPTG。
[0012]其中，培養(yǎng)基中含有引起大腸桿菌分解代謝物阻遏的葡萄糖,濃度為0.3-0.7g/L。
[0013]其中，培養(yǎng)基中含有作為氮源使用的大豆蛋白胨，濃度為15_25g/L。
[0014]其中，消泡劑選自Antifoam 204(Sigma 制)或 Antifoam SI (Wako 制)或 THIx-298(煙臺恒鑫制)或消泡劑0061 (佛山盈智制)中的任意一種。
[0015]其中，低溫下過夜培養(yǎng)溫度為20-35°C，進一步優(yōu)選為25-31°C
其中，重組蛋白選自重組人超氧化物歧化酶或重組人堿性成纖維細胞生長因子或重組人促血小板生成素模擬肽或可溶性表達或者包涵體表達的重組蛋白中的任意一種。
[0016]其中，所述的大腸桿菌是指腸桿菌科埃希氏菌屬的埃希氏菌及其亞種。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:
(1)節(jié)省了逐級放大菌種的時間，充分利用夜間人員休息時間進行生產(chǎn)；
(2)節(jié)省了菌種放大的設(shè)備和材料投入，降低了成本；
(3)通過夜間低溫條件的馴化，使菌種非常良好地適應了發(fā)酵條件，縮短發(fā)酵延遲期，大大提高了發(fā)酵時菌體生長速度，提高了發(fā)酵效率；
(4)菌種均一化程度高，不容易出現(xiàn)發(fā)酵延遲的情況，工藝穩(wěn)定性得到了增強；
(5)葡萄糖的存在利用了大腸桿菌分解代謝物阻遏的生理過程，避免了本底表達；
(6)培養(yǎng)基不含動物源成分和抗生素,符合現(xiàn)代制藥工業(yè)對于培養(yǎng)基的要求；
(7)方法簡單，可操作性強，充分利用發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)有設(shè)備，易于推廣和工業(yè)化大生產(chǎn)的需求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為在本發(fā)明涉及的發(fā)酵工藝下，發(fā)酵過程中連續(xù)三罐大腸桿菌的生長曲線。

【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例形式的【具體實施方式】對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應將其理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下實施例。凡基于本發(fā)明的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的范圍。顯然，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明的基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換和變更。
[0020]實施例一(重組人超氧化物歧化酶發(fā)酵)
(O培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的配制和滅菌；
培養(yǎng)基的配制和滅菌:
硫酸鎂濃縮液:稱取七水硫酸鎂50g，純化水定容至10ml并經(jīng)過0.22 μ m過濾除菌；氯化鈣濃縮液:稱取二水氯化鈣1.5g，純化水定容至10ml并經(jīng)過0.22 μ m過濾除菌；硫酸亞鐵濃縮液:稱取七水硫酸亞鐵2.8g,純化水定容至10ml并經(jīng)過0.22 μ m過濾除囷；
微量元素濃縮液:稱取四水鑰酸銨0.37g、硼酸2.47g、六水氯化鈷0.71g、五水硫酸銅
0.25g、一水硫酸錳1.35g、七水硫酸鋅0.29g，純化水定容至10ml并經(jīng)過0.22 μ m過濾除菌。
[0021]稱取甘油225g、葡萄糖15g、大豆蛋白胨600g、Antifoam 204 lg、十二水磷酸氫二鈉270g、磷酸二氫鉀100g、氯化銨80g、硫酸鈉21g ;純化水配制后,用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至7.2，定容至27L并于115°C下高壓蒸汽滅菌20分鐘。
[0022]滅菌完成并冷卻至30°C后，向培養(yǎng)基中添加已經(jīng)過0.22 μ m過濾除菌的硫酸鎂濃縮液、氯化鈣濃縮液、硫酸亞鐵濃縮液各30ml，添加微量元素濃縮液3ml。
[0023]流加培養(yǎng)液的配制和滅菌:
稱取甘油2000g，純化水定容至2L后在121°C高壓滅菌20分鐘，冷卻至室溫；
取IPTG 0.1mol，純化水定容至10ml后經(jīng)過0.22 μ m過濾除菌；稱取氫氧化鈉400g,純化水定容至1L。
[0024]( 2 )接種并在低溫下過夜培養(yǎng)；
維持培養(yǎng)基溫度31 °C、通氣量18L/min、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm、罐壓0.05bar,向發(fā)酵罐中按1:30，000的比例接種吸光度0D_為0.3的凍存大腸桿菌甘油菌種。保持此發(fā)酵條件進行過夜培養(yǎng)。
[0025](3)升溫并開始補料培養(yǎng)；
低溫過夜培養(yǎng)17小時后，0D_達到11.46，升高發(fā)酵溫度至37 °C，適度提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，維持溶氧比率于20%，適時補加甘油流加培養(yǎng)液，維持發(fā)酵罐中甘油濃度為5-15g/L，氫氧化鈉流加培養(yǎng)液由發(fā)酵罐控制，將pH維持在7.2。
[0026](4)適時誘導并收獲菌體。
[0027]發(fā)酵液吸光度0D_升高至24.28時補加30ml IPTG進行誘導，誘導之后4小時下罐,收集發(fā)酵液,離心收集菌體。獲得濕菌體總共1.6kg。

【權(quán)利要求】
1.一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，該發(fā)酵工藝在同一個發(fā)酵罐中完成，含有如下步驟: (1)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的配制和滅菌； (2)接種并在低溫下過夜培養(yǎng)； (3)升溫并開始補料培養(yǎng)； (4)誘導并收獲菌體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于， (O培養(yǎng)基的配制和滅菌過程為: 用純化水分別配制濃度為5-15g/L的甘油、0.Ι-lg/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L消泡劑、5-15g/L的十二水磷酸氫二鈉、2_10g/L的磷酸二氫鉀、l_5g/L的氯化銨、0.2-lg/L的硫酸鈉，配制后均勻混合制得混合溶液；用5-lOmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合溶液的PH值至7.2±0.2，并于110-115°C高壓蒸汽滅菌15-30分鐘；滅菌完成并冷卻至20-50°C后，添加已經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的微量元素濃縮液至終濃度如下:七水硫酸鎂200-600mg/L、二水氯化鈣10_30mg/L、七水硫酸亞鐵10_50mg/L、四水鑰酸銨0.01-0.lmg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化鈷0.01-0.lmg/L、五水硫酸銅0.01-0.lmg/L、一水硫酸錳 0.05-0.5 mg/L、七水硫酸鋅 0.01-0.lmg/L ； (2)流加培養(yǎng)液的配制和滅菌過程為: 用純化水配制濃度為500-1000g/L的甘油，在115-121°C高壓滅菌20-30分鐘，冷卻至室溫；IPTG 1-10 mol/L，純化水配制后經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌；用純化水配制濃度為5-10mol/L的氫氧化鈉； (3)接種并在低溫下過夜培養(yǎng)的過程為: 維持培養(yǎng)基溫度為20-35 °C、通氣量為0.5-lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速為100-500rpm、罐壓為0.05-0.1bar，向發(fā)酵罐中按1:50，000-1:5，000的比例接種吸光度OD600為0.2-1的凍存大腸桿菌甘油菌種，保持此發(fā)酵條件進行過夜培養(yǎng)； (4)升溫并開始補料培養(yǎng)的過程為: 低溫過夜培養(yǎng)12-20小時后，升高發(fā)酵溫度至35-38°C，提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，維持溶氧比率于10-30%，補加甘油流加培養(yǎng)液，維持發(fā)酵罐中甘油濃度為5-15g/L，氫氧化鈉流加培養(yǎng)液由發(fā)酵罐控制，將pH維持在7.2±0.2 ; (5)誘導并收獲菌體的過程為: 將發(fā)酵液吸光度0D_升高至10-60時進行誘導，誘導之后4-6小時下罐，收集發(fā)酵液，離心收集菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的培養(yǎng)基的組成為5-15g/L的甘油、0.1-^/1的葡萄糖、5-3(^/1的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L的消泡劑、5_15g/L的十二水磷酸氫二鈉、2-10g/L的磷酸二氫鉀、l_5g/L的氯化銨、0.2_lg/L的硫酸鈉、200-600mg/L的七水硫酸鎂、10_30mg/L的二水氯化鈣、10_50mg/L的七水硫酸亞鐵、0.01-0.lmg/L的四水鑰酸銨、0.1-0.5mg/L的硼酸、0.01-0.lmg/L的六水氯化鈷、0.01-0.lmg/L的五水硫酸銅、0.05-0.5mg/L的一水硫酸錳、0.01-0.lmg/L的七水硫酸鋅。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的流加培養(yǎng)液的組成為500-1000g/L甘油、l-10mol/L的IPTG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中含有引起大腸桿菌分解代謝物阻遏的葡萄糖，濃度為0.3-0.7g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中含有作為氮源使用的大豆蛋白胨，濃度為15-25g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的消泡劑選自 Antifoam 204 (Sigma 制)或 Antifoam SI (Wako 制)或 ΤΗΙχ-298 (煙臺恒鑫制)或消泡劑0061 (佛山盈智制)中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的低溫下過夜培養(yǎng)溫度為20-35°C，進一步優(yōu)選為25-31 °C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的重組蛋白選自重組人超氧化物歧化酶或重組人堿性成纖維細胞生長因子或重組人促血小板生成素模擬肽或可溶性表達或者包涵體表達的重組蛋白中的任意一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達重組蛋白的發(fā)酵工藝，其特征在于，表達重組蛋白的菌 種為大腸桿菌，進一步為腸桿菌科埃希氏菌屬的埃希氏菌及其亞種。
【文檔編號】C12N9/02GK104164465SQ201410332982
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】趙建多, 常翠云, 王延山, 李辰霄, 齊連權(quán), 肖萱 申請人:北京泰德制藥股份有限公司