采用lamp技術(shù)檢測牛無漿體方法
【專利摘要】采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測，所述的LAMP引物設(shè)計利用PrimerExplorerV4軟件針對牛無漿體16SrRNA基因的6個位點設(shè)計4條LAMP引物，引物包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP和BIP，其中：F3：GGGCATGTAGGTGGTTTGG；B3：GCGTGGACTACCAGGGTAT；FIP：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC；BIP：ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。該法以牛無漿體16SrRNA為靶基因位點，具有快速、靈敏、高效、低成本等特點，為牛無漿體病的病原檢測提供新的技術(shù)方法。
【專利說明】采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP)檢測牛無 漿體方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛無楽體AoKis):屬于立克次體目（Rickettsiales)無楽體科 (Anaplasmataceae)無楽體屬是一類專性寄生于脊椎動物血細胞中的無固 定形態(tài)的微生物（寶福凱，柳愛華.立克次體目微生物的系統(tǒng)分類進展[J].中國人獸共 患病學(xué)報，2007,23(12): 1262-1264.)。該病原可引起牛、羊、鹿等反芻動物和犬、兔等哺 乳動物的貧血、消瘦、黃疸、流產(chǎn)甚至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的損失。
[0003] 無楽體屬包含6個種：（1)邊緣無楽體(A ;主要感染牛和鹿，寄生 于動物紅細胞中；有較強致病力，是各國科學(xué)家研究的熱點和重點；（2)綿羊無漿體認 ohs):主要寄生于動物紅細胞，可以引起綿羊、山羊、鹿等發(fā)病，但不感染牛；（3)中央無漿 體認cmirah):感染牛，致病力較弱，在以色列、南美洲和澳大利亞被用作活疫苗（de la FUENTE J， LEW A, LUTZ H， et al. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development[J]· Animal Health Research Reviews， 2005， 6(1): 75-89.) ;(4)嗜 吞嗤細胞無菜體(A :是由以前的馬埃里克體Mui)、嗜 吞嗤細胞埃里克體(E 和人粒細胞埃里克體?。℉uman granulocytic anaplasmosis，HGA)的病原合并而來，是一種寄生于宿主粒細胞中的人畜共患病病原；（5) 牛無漿體(A知Kis):舊稱牛埃里克體(E知Kis)，感染牛羊等反芻動物，寄生于動物血 液的單核細胞中；（6)扁平無菜體(A :舊稱扁平埃里克體(萬.主要感染 犬類動物（DUMLER J S，BARBET A F，BEKKER C P，et al· Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and J HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001, 51 (Pt 6): 2145-2165.)〇
[0004] 牛無漿體的宿主動物主要是牛羊等反芻動物，也可感染鹿，哺乳動物犬及兔 等(G0ETHERT Η K， TELFORD S R. Enzootic transmission of Anaplasma bo vis in Nantucket cottontail rabbits [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003， 41(8): 3744-3747; LEE M, YU D, Υ00Ν J, et al. Natural co-infection of Ehrlichia chaffeensis and Anaplasma bovis in a deer in South Korea [J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2009, 71(1): 101-103; KANG J G, KIM Y J, YANG H J， et al. New Genetic Variants of Anaplasma phagocytophilum and Anaplasma bovis from Korean Water Deer (Hydropotes inermis argyropus)[J]. VetorBorne and Zoonotic Diseases, 2011，11(7): 929-938.);綿羊無楽體的宿主動物主要是綿羊、 山羊及一些野生反芻動物（de la FUENTE J, HOGG J T, NARANJO V，et al. Genetic characterization of Anaplasma ovis strains from bighorn sheep in Montana[J]. Journal of Wildlife Diseases, 2006，42(2): 381-385);嗜吞噬細胞無漿體的宿主范 圍比較廣，包括人、牛、羊、馬、鹿、狗、貓、豬、鼠和兔等動物（de la FUENTE J，WONG S J， LUTZ H, et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(3): 1309-1317; MORGENTHAL D, HAMEL D, ARNDT G, et al. Prevalence of haemotropic Mycoplasma spp. , Bartonella spp. and Anaplasma phagocytophilum in cats in Berlin/ Brandenburg (North-East Germany)[J]. Berliner und Miinchener Tierarztliche ffochenschrift, 2012, 125 (9- 10): 418-427; GALINDO R C, AYLLON N, SMRDEL K S, et al. Gene expression profile suggests that pigs (Sus scrofa) are susceptible to Anaplasma phagocytophilum but control infection[J]. Parasites & Vectors, 2012，5: 181.)，是一種重要的人畜共患病病原。邊緣無漿體主要感染牛等反芻動物，包括 家養(yǎng)牛及一些野生動物如野牛、長頸鹿、叉角羚、大角羊、麋鹿、白尾鹿、黑尾鹿等（PALMER G H, RURANGIRWA F R, MCELWAIN T F. Strain composition of the EhrlichiaAnaplasma marginale within persistently infected cattle, a mammalian reservoir for tick transmission[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39 (2): 631-635; de la FUENTE J, THOMAS E, Van den BUSSCHE R A, et al. Characterization of Anaplasmamarginale isolated from north American bison [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5001-5005. )〇
[0005] 目前，無漿體的主要檢測方法有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷法和分子生物學(xué)診斷法 等。
[0006] 病原學(xué)診斷主要有血涂片檢查和動物接種試驗。血涂片檢查仍是無漿體檢查最 為經(jīng)典的方法，其要求在疑患病動物用藥之前體溫較高時進行采集動物耳尖血做血涂片， 用姬姆薩染色法染色，染色后在1000倍油鏡下觀察結(jié)果。該法然簡單可靠，但在感染率很 低或感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作的熟練程度將直接影響診斷結(jié)果的 準確性（張菲菲.羊無漿體PCR診斷方法建立及分子流行病學(xué)調(diào)查[D].鄭州：河南農(nóng) 業(yè)大學(xué)，2013.)。臨床上，若被檢動物染蟲率很低，不能確診，可通過人工培養(yǎng)病原，接種 實驗動物來人工感染動物，然后收集接種動物的血液，進行診斷（AUBRY P，GEALE D W. A Review of Bovine Anaplasmosis[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2011, 58(1):1-30 ；C0ETZEE J F, APLEY M D, K0CAN K M. Comparison of the complement fixation test and competitive ELISA for serodiagnosis of Anaplasma marginale infection in experimentally infected steers[J]. American Journal of Veterinary Research, 2007，68(8): 872-878.)。無漿體的體外培養(yǎng)往往需要較好的實驗條件和操 作熟練的專業(yè)技術(shù)人員，因此該方法不適用于田間流行病學(xué)調(diào)查，而較適合于病原的實驗 室分離。
[0007] 血清學(xué)診斷主要有補體結(jié)合試驗（CF)、卡片凝集試驗（CA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)。在我國，張其才利用邊緣邊蟲高染蟲率的含蟲血所制備的補反診斷抗原具有敏感 性良好和特異性很強的特點，CF方法對試驗條件下人工感染牛的補反檢出率為99%，安全 區(qū)無假陽性反應(yīng)（張其才，呂文順，竇惠芳，等.補體結(jié)合試驗診斷邊蟲感染牛的研究 [J].中國獸醫(yī)科技.1993, 23 (5) :8-10)，但袁建豐等試驗證明該試驗在很大程度上無法 檢測出隱性感染及感染初期的動物(袁建豐.1)邊緣無漿體快速診斷試劑盒的研制；2)羊 泰勒蟲臨床癥狀、血液學(xué)以及抗體變化的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005)。該方法雖 然具有其自身的很多優(yōu)點，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗體的比例適當(dāng)，否則會出 現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，另外，由于操作條件和技能等較高要求的限制而不適合于田間流 行病學(xué)調(diào)查。在1991年，國際獸醫(yī)局頒布的推薦診斷技術(shù)指南中，卡片凝集試驗被確定為 診斷牛邊緣無漿體病的主要方法之一。張肖正等將快速卡片凝集試驗（RCA)與補體結(jié)合試 驗（CF)進行了比較，結(jié)果顯示，RCA的敏感性比CF更好，且檢出感染后的陽性反應(yīng)持續(xù)時間 長。但是卡敏凝集實驗的非特異性反應(yīng)及解釋結(jié)果的主觀性是該方法的制約因素，另外，該 實驗所用的抗原很難制備，并且不同批次、不同實驗室之間制備的會有所不同，從而造成結(jié) 果的異同。在我國，余豐等利用冷藏抗原片進行間接免疫熒光抗體實驗檢測邊緣無漿體，結(jié) 果表明，該方法具有敏感性高、特異性強等特點，人工感染牛的符合率為100% ;檢查疫區(qū)的 273份血清樣品，陽性率為35. 2%，對安全區(qū)的86份血清樣品進行檢查，假陽性率為3%。在 實驗中，邊緣無漿體抗原與雙芽巴貝斯蟲、瑟氏泰勒蟲、伊氏錐蟲感染的牛血清均無交叉反 應(yīng)，與感染了綿羊無漿體的羊血清有較強的交叉反應(yīng)(余豐，呂文順，張其才等.間接熒光 抗體診斷牛邊緣邊蟲病的研究[J].中國獸醫(yī)科技，1990(5) : 8-10. )。2007年Glen等證實 了 ELISA方法能夠有效且可靠的診斷家養(yǎng)羊的綿羊無漿體病和野生有蹄類動物的無漿體 ?。℅len A Scoles, WL Goff, TJ Lysyk, et al. Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use in the diagnosis of A. ovis infections in domestic sheep and Anaplasma sp. in wild ungulates[J]. Veterinary Microbiology, 2008,130(1-2): 184-190)。同年，Strik等報道cELISA能夠特異和敏感的檢測出感染無漿體的動物。然而， 由于MSP 5蛋白在無漿體中的保守性，該方法并不能將各種無漿體區(qū)分開而進行鑒別診斷 (Strik, N. I. , A. R. Alleman, A. F. Barbet, et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale [J]. clinical and vaccine immunology, 2007, 14 (3): 262-268·)。 2010年徐平源等還對湖南地區(qū)邊緣無漿體的MSP4基因進行了克隆及序列分析，這些都為 重組抗原ELISA診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。ELISA多用于樣品的批量篩檢，且特異性強， 但其缺點在于對時間和操作的要求非常嚴格，必須有專業(yè)人員完成，而且對于陽性的區(qū)別 比較模糊，有時候需要反復(fù)做（徐平源，何德肆.湖南地區(qū)邊緣無漿體的MSP4基因的克 隆及序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(10): 815-817)。
[0008] 分子生物學(xué)診斷方法主要有核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物（如酶與熒光素等）標(biāo) 記的DNA片段、單鏈DNA和RNA等。其具有特定的序列，能夠與具有相應(yīng)核苷酸堿基互補序 列的核酸片段結(jié)合，可用于樣品中特定基因片段的檢測。中國研究者馬米玲等的研究表明， 核酸探針技術(shù)的最大優(yōu)點是可以較準確的區(qū)分形態(tài)相似的病原，但與病原學(xué)檢查和血清學(xué) 方法相比，其敏感性并不具有明顯的優(yōu)勢，而且需要特殊設(shè)備，檢出速度又慢，不適應(yīng)于大 批量樣品的檢測（馬米玲，羅建勛，殷宏，等.邊緣無漿體病診斷方法的研究進展[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2008, 38 (07) :633-638)。除常規(guī)PCR檢測方法外，還有復(fù)合實時熒光定量 PCR(Jff Courtney, LM Kostelnik, NS Zeidner, et al. Multiplex Real-Time PCR for Detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004，42(7): 3164- 3168)、實時反轉(zhuǎn)錄PCR (KR Sirigireddy， RR Gant. Multiplex Detection of Ehrlichia and Anaplasma Species Pathogens in Peripheral Blood by Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction[J]· Journal of Molecular Diagnostics, 2005，7(2): 308-316)、雙重RT-PCR (N Decaro, G Carelli, E. Lorusso, et al. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale[J\. Journa of Veterinary Diagnostic Investigation, 2008，20(5): 606-611)、實時熒光定量PCR(遲慶安.綿羊無漿體和牛無漿體實時熒光定 量PCR檢測方法的建立[D].新疆：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.)等方法檢測無漿體，雖然PCR 方法的敏感性高，特異性強，但是其操作繁瑣，不適合實踐應(yīng)用，而更適合用于長期帶蟲動 物的檢測。
[0009] 與傳統(tǒng)PCR方法相比，LAMP技術(shù)屬于等溫擴增，無需昂貴的熱循環(huán)儀，并且由于 LAMP反應(yīng)中可以產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物--白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產(chǎn)物可不經(jīng)過電泳，無需 開蓋直接通過肉眼觀察即可判定結(jié)果，在反應(yīng)前、后加入染色劑效果更佳。LAMP技術(shù)敏感性 高、特異性強、操作簡便，能夠滿足現(xiàn)場和條件較差的基層實驗室進行快速檢測的需求。目 前，LAMP方法已用于多種寄生蟲等病原體的檢測，例如，李群等根據(jù)牛巴貝斯蟲的細胞色素 b基因 （cyt b)設(shè)計LAMP引物，建立了檢測牛巴貝斯蟲的LAMP方法（李群，王素華，周前 進，等.快速檢測牛巴貝斯焦蟲LAMP方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010, 10 (32): 781-784.);王中光等根據(jù)瑟氏泰勒蟲表面蛋白基因（P33)設(shè)計引物，建立了檢測牛瑟氏 泰勒蟲的LAMP方法（王中光，張守發(fā)，曹士諾，等.牛瑟氏泰勒蟲環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢 測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，2(32): 108-111) ;Ma等根據(jù)綿羊無漿體 的表面蛋白4 (MSP4)基因設(shè)計引物，建立了檢測綿羊無漿體的LAMP方法（Miling Ma， Zhijie Liu, Jianxun Luo, et al. Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Anaplasma oFi5/^J]. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2011，49(6):2143-2146) ;Pan 等根據(jù)嗜吞噬細胞無漿體的 表面蛋白2 (MSP2)基因設(shè)計引物，建立了檢測嗜吞噬細胞無漿體的LAMP方法（Lei Pan， Lijuan Zhang, Guiqiang Wang, et al. Rapid, Simple, and Sensitive Detection of Anaplasma phagocytophilum by Loop-Mediated Isothermal Amplification of the msp2 Gene[J]· JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2011,49(12):4117- 4120);目前，尚沒有 牛無漿體的LAMP檢測方法，本發(fā)明以牛無漿體16S rRNA為靶基因位點設(shè)計引物，建立針對 牛無漿體的LAMP方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法檢出率低、操作繁瑣等問題，本發(fā)明提供一種LAMP技術(shù) 檢測牛無漿體方法，該法以牛無漿體16S rRNA為靶基因位點，具有快速、靈敏、高效、低成本 等特點，為牛無漿體病的病原檢測提供新的技術(shù)方法。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方 法，該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的 LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測，所述的LAMP引物設(shè)計 利用Primer Explorer V4軟件針對牛無漿體16S rRNA基因的6個位點設(shè)計4條LAMP引 物，引物包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP和BIP。
[0012] F3 ：GGGCATGTAGGTGGTTTGG ； B3 ：GCGTGGACTACCAGGGTAT ； FIP ：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC ； BIP :ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。
[0013] 所述的LAMP反應(yīng)體系包括： 1) 弓丨物混合液：外引物為F3和B3各0.2 Mmol/L，內(nèi)引物為FIP和BIP各1.6 Mmol/ L，外內(nèi)引物比為1 :8 ; 2) 反應(yīng)混合液：0· 8 mol/L Betaine，8 mmol/T, MgS04,1· 4 mmol/Τ, dNTP Mixture,8 U/25 μ? Bst DNA 聚合酶； 3) 2μ1 DNA 模版； 加滅菌雙蒸餾水至25 μ?。
[0014] 所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反應(yīng)混合液混合均 勻后加入2 μ? DNA模版，在60-65°C保溫30-90min。
[0015] 所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加 入2 μ? DNA模版，在62°C保溫60min。
[0016] 所述的熒光可視化檢測采用SYBR Green I染料，在每個管蓋內(nèi)側(cè)添加1 μ L稀釋 10倍的SYRB Green I原液，合上管蓋，反應(yīng)結(jié)束后，輕甩反應(yīng)管，使染料與產(chǎn)物混合。
[0017] 本發(fā)明有以下優(yōu)點：（1)擴增效率極高，60min內(nèi)擴增產(chǎn)物可達到靶基因的 109~10 1(1倍；（2)本發(fā)明操作簡單，只需在62°C恒溫條件下將反應(yīng)物混合，反應(yīng)lh，不需要 復(fù)雜的溫度變化過程；（3)本發(fā)明建立的牛無漿體LAMP檢測方法靈敏性高，擴增模板只需 10 copies/^L或更少；（4)本發(fā)明基于牛無漿體16S rRNA建立的LAMP方法特異性高，可 檢測牛無漿體，不能檢測嗜吞噬細胞無漿體、綿羊無漿體、呂氏泰勒蟲、莫氏巴貝斯蟲、血吸 蟲；（5)本發(fā)明結(jié)果判定簡單，可以通過添加 lyL 10倍稀釋的SYRB Green I染料，顯色直 接肉眼觀察，不經(jīng)過電泳。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明檢測牛無漿體電泳檢測圖，Μ為DL2000DNA Marker，1-7為陽性結(jié)果， 為LAMP擴增梯形條帶，N為陰性對照，無擴增產(chǎn)物； 圖2為本發(fā)明添加熒光染料檢測結(jié)果，1-7為陽性結(jié)果，具有綠色熒光，N為陰性對照， 為褐色； 圖3為本發(fā)明添加熒光染料后紫外顯像檢測結(jié)果，1-7為陽性結(jié)果，呈較亮熒光，N為陰 性對照，突光較弱； 圖4是本發(fā)明中不同反應(yīng)溫度條件下測得的LAMP體系試驗電泳檢測圖，圖中所示：Μ : DL2000 DNA Marker ;1 :6(TC ;2 :61°C ;3 :62°C ;4 :63°C ;5 :64°C ;6 :65°C ;N :陰性對照，65°C ; 圖5是本發(fā)明中不同濃度MgS04條件下測得的LAMP體系試驗電泳檢測圖，圖中所示： M ：DL2000 DNA Marker ;1 :2 mmol /T, ；2 ：4 mmol /T, ；3 ：6 mmol /T, ；4 ：8 mmol /T, ;5 :10 mmol / L ；6 ： 12 mmol/T, ;7 :14 mmol/T, ;N :陰性對照，8 mmol/T,； 圖6是本發(fā)明中不同濃度dNTP Mixture條件下測得的LAMP體系試驗電泳檢測圖，M : DL2000 DNA Marker ；1 ：0. 8 mmol /T, ；2 ： 1. 0 mmol /T, ；3 ： 1. 2 mmol /T, ；4 ： 1. 4 mmol /T, ；5 ： 1. 6 mmol/T, ；6 ： 1. 8 mmol/T, ；7 ：2. 0 mmol/T, ;N :陰性對照，1. 4 mmol/T,； 圖7是本發(fā)明中在加入不同量的酶的條件下測得的LAMP體系試驗電泳檢測圖，M : DL2000 DNA Marker ;1 :2U ;2 :4U ;3 :6U ;4 :8U ;5 :10U ;6 :12U ;7 :14U ;N :陰性對照，8U /25μ L ； 圖8是本發(fā)明檢測牛無漿體敏感性試驗LAMP電泳擴增圖，圖中M:DL2000 DNA Marker ; 1~7代表嗜吞噬細胞無漿體DNA含量為103~10_3 copies/μ L，N為陰性對照；電泳 結(jié)果顯示LAMP的檢測限為10°，檢測靈敏度是常規(guī)PCR的100倍； 圖9是本發(fā)明檢測牛無漿體敏感性試驗常規(guī)PCR電泳擴增圖，Γ7代表嗜吞噬細胞無漿 體DNA含量，N為陰性對照； 圖10是本發(fā)明檢測牛無漿體特異性試驗電泳檢測圖，圖中M :DL2000 DNA Marker; 1 ：A. bovis ；2 -A. phagocytophilum ；3 ：A. ovis ；4 ：B. motasi ；5 :71. luwenshuni ；6 ： SbAisiiosY通a ;7:雙蒸水，1為A 基因組出現(xiàn)LAMP特征性梯狀條帶，展示 較好的特異性。

【具體實施方式】
[0019] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0020] 所述試劑均為市售，所用DNA模版本 申請人:實驗室均有保存。
[0021] 主要試劑：Bst DNA 聚合酶大片段（Bst DNA polymerase large fragment), New England Biolab;三甲銨乙內(nèi)酯（Betaine), Sigma公司；Tap DNA聚合酶、脫氧核苷三 憐酸（dNTP Mixture)、DL2000 DNA Marker、6XLoading buffer，TaKaRa 生物合成公司； DNAGreen，TIANDZ ; SYBR Green I，Solarbio ;基因組DNA快速抽提試劑盒(血液)，上海生 工生物合成有限公司。
[0022] 試驗儀器：電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司，型號HwS24 ;PCR儀，Gene Company Limited,型號9700 ;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠，型號DYY-5 ;紫外成像 儀，SYNGENE，型號InGenius LHR;數(shù)碼照相機，佳能公司，型號IXUS115 HS;快速混勻器， GENIE，型號V0RTEX-2 ;高速臺式離心機，上海安亭科技有限公司，型號TGL-16B ;手掌型 離心機，江蘇海門市麟麟醫(yī)用儀器廠，型號LX-100 ;分析天平，METTLER TOLEDO公司，型號 AB204-N ;精密PH計，上海宇隆儀器有限公司，型號PHS-3C ;超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù) 有限公司；雙重純水蒸餾儀，上海亞榮生化儀器廠，型號SZ-93 ;移液器，BRAND。
[0023] 1.引物設(shè)計 首先本發(fā)明人從NCBI上下載了牛無漿體16S rRNA基因序列(登錄號：FJ169957. 1)，使 用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0 / index, html)設(shè)計 多組引物，然后根據(jù)引物序列所在區(qū)域的保守性、引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、GC含量及Tm值等綜合 因素選擇引物，共設(shè)計4條LAMP引物，其中包括2條外引物F3、B3和2條內(nèi)引物FIP、BIP。 引物的信息見表1 : 表1引物序列信息

【權(quán)利要求】
1. 采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計、LAMP反應(yīng)體 系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和 突光可視化檢測，所述的LAMP引物設(shè)計利用Primer Explorer V4軟件針對牛無楽體16S rRNA基因的6個位點設(shè)計4條LAMP引物，引物包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP 和BIP，其中： F3 ：GGGCATGTAGGTGGTTTGG ； B3 ：GCGTGGACTACCAGGGTAT ； FIP ：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC ； BIP :ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，其特征在于：所述的LAMP 反應(yīng)體系包括： 1) 弓丨物混合液：外引物為F3和B3各0.2 Mmol/L，內(nèi)引物為FIP和BIP各1.6 Mmol/ L，外內(nèi)引物比為1 :8 ; 2) 反應(yīng)混合液：0· 8 mol/L Betaine，8 mmol/T, MgS04,1· 4 mmol/Τ, dNTP Mixture,8 U/25 μ? Bst DNA 聚合酶； 3) 2μ1 DNA 模版； 加滅菌雙蒸餾水至25 μ?。
3. 如權(quán)利要求2所述的采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，其特征在于：所述LAMP反 應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入2 PL DNA模版，在 60-65 ? 保溫 30-90min。
4. 如權(quán)利要求3所述的采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，其特征在于：所述LAMP反 應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入2 PL DNA模版，在 62°C 保溫 60min。
5. 如權(quán)利要求1所述的采用LAMP技術(shù)檢測牛無漿體方法，其特征在于：所述的熒光可 視化檢測采用SYBR Green I染料，在每個管蓋內(nèi)側(cè)添加1 μ L稀釋10倍的SYRB Green I 原液，合上管蓋，反應(yīng)結(jié)束后，輕甩反應(yīng)管，使染料與產(chǎn)物混合。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152550SQ201410332786
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】寧長申, 王金鴻, 呂亞莉, 菅復(fù)春, 張龍現(xiàn), 王榮軍, 張艷, 張文靜, 曹樹軒 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)