一種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法。本發(fā)明根據(jù)水牛RBP3基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)，其核苷酸序列分別如序列表SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示，設(shè)計(jì)出兩對引物，對雜交水牛的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩種擴(kuò)增產(chǎn)物；最后對所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、分型，從而快速、準(zhǔn)確地辨別雜交水牛的三種核型。本發(fā)明首次證明上述兩個(gè)突變位點(diǎn)與雜交水牛染色體核型相關(guān)，并且可以利用這兩個(gè)突變位點(diǎn)快速鑒別雜交水牛的染色體核型，可以作為雜交水牛的分子標(biāo)記選育手段，加速雜交水牛的選育效率。
【專利說明】-種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 亞洲水牛包括河流型（River Buffalo)和沼澤型（Swamp Buffalo)兩個(gè)亞種。河 流型水牛主要產(chǎn)于南亞地區(qū)，例如尼里-拉菲水牛（巴基斯坦）和摩拉水牛（印度），沼 澤型水牛則以我國為最。水牛具有較強(qiáng)的抗病力和耐粗飼的特點(diǎn)，適應(yīng)濕熱氣候，非常適 合我國南方地區(qū)飼養(yǎng)，南方地區(qū)鮮奶消費(fèi)的缺口也可以由水牛奶填補(bǔ)。水牛奶因口感獨(dú) 特，奶香味濃郁，其脂肪、蛋白質(zhì)和鈣、磷的含量比普通牛奶高而備受到人們的青睞，從而 激起了奶水牛業(yè)的興起和快速發(fā)展。這些年來，在國家產(chǎn)業(yè)政策刺激下，水牛奶業(yè)日益受 到重視，在不久的將來，奶水牛行業(yè)必將成為南方奶業(yè)的重要支柱。但是水牛屬于單胎動 物，繁殖力低，與黃牛相比，水牛具有發(fā)情期晚、發(fā)情不明顯、受胎率低及產(chǎn)后發(fā)情間隔時(shí)間 長等特點(diǎn)，整體繁殖力低（王根林，2006)。水牛產(chǎn)奶量與荷斯坦牛相比，僅為其一半，沼 澤型水牛的產(chǎn)奶量更低。在現(xiàn)代化養(yǎng)殖的條件下，僅靠自然繁殖是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要的， 因此一般都會引進(jìn)河流型水牛進(jìn)行雜交以提高水牛的繁殖性能和產(chǎn)奶量。河流型水牛染 色體數(shù)目是 50 (Dutt MK，Bhattacharya P. Chromosomes of the Indian water Buffalo. Nature，1952, 27:1129-1129)，而沼澤型水牛為 48 (Berardino DD，Iannuzzi L. Chromosome banding homologies in Swamp and Murrah Buffalo. The Journal of Heredity,1981, 72:183-188)。導(dǎo)致兩者染色體數(shù)目不同的原因是，沼澤型水牛最大的1號染色體，基因 和形態(tài)上與河流型水牛4和9號染色體極為相似，相當(dāng)于河流型水牛第4號染色體短 臂的端粒和9號染色體的著絲粒串聯(lián)融合，形成一條染色體（Berardino DD，Iannuzzi L. Chromosome banding homologies in Swamp and Murrah Buffalo. The Journal of Heredity，1981，72:183-188)。兩個(gè)亞種之間會雜交產(chǎn)生染色體為49的后代，這些后代之 間是可育的，相互雜交會產(chǎn)生48、49和50三種不同染色體數(shù)的后代。根據(jù)有關(guān)的研究表明， 雜交水牛的繁殖性能比純種有所降低，主要體現(xiàn)在其核型數(shù)2n = 49的雜交水牛會產(chǎn)生異 常配子，導(dǎo)致胚胎發(fā)育的不正常，最終導(dǎo)致胚胎在早期便死亡，宏觀上表現(xiàn)為情期配種受胎 率和年受胎率分別降低12. 3%和6. 4%，產(chǎn)仔間隔長達(dá)97. 6天（黃右軍，尚江華，梁夢玫， 張秀芳，黃芬香.河流型水牛與沼澤型水牛雜交后代（2n = 49)染色體遺傳與繁殖力的研 究.遺傳，2003, 25 (2) :155-159)。若通過核型水平對水牛進(jìn)行選擇，那么對雜交水牛群的 整體繁殖能力將有顯著的提升，辨別雜交水牛核型數(shù)也顯得非常重要。
[0003] 傳統(tǒng)鑒定核型的方法是采用取外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入秋水仙素使 細(xì)胞分裂停留在中期，再低滲固定，制作滴片，通過染色體照片的對比分析對染色體數(shù)目進(jìn) 行分組，觀測和描述組內(nèi)各染色體形態(tài)和特征，進(jìn)而確定其染色體組型并闡明生物的染色 體組成。但是該方法較為繁瑣，周期長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本也不低，檢測大群體雜交水牛便非 常麻煩，不符合現(xiàn)代化大規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展方向。然而快速檢測雜交水牛核型的方法依舊沒 有相關(guān)文獻(xiàn)證明已經(jīng)正在研究或者研究出來，甚至連這方面的探索也沒有文獻(xiàn)資料可供查 詢。哺乳動物中，亞種間由于長時(shí)間的地理和生殖隔離，相同的基因也會有不同的突變和演 化。在水牛的亞種雜交中，不同核型的雜交水牛在特定染色體上的基因會有所區(qū)別，這些區(qū) 別會體現(xiàn)在堿基序列上。因此本研究依據(jù)分子標(biāo)記的應(yīng)用和雜交水牛核型分析，將二者聯(lián) 系起來，建立利用分子標(biāo)記快速檢測雜交水牛核型的方法，該方法尚無相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表或說 明，屬于創(chuàng)新型研究，可快速方便大規(guī)模檢測雜交水牛的核型，改良群體結(jié)構(gòu)，從而提高繁 殖和泌乳性能，加快雜交水牛的品種改良速度。
[0004] 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，尤其在亞種的鑒別上，亞種間由于長時(shí)間的地理和 生殖隔離，相同的基因也會有不同的突變和演化通過分子標(biāo)記便可找出這些差異，加以辨 另IJ。敖光輝等人利用SSR對秈粳稻亞種之間進(jìn)行標(biāo)記差異，發(fā)現(xiàn)差異明顯（敖光輝，王麗，魏 琴，周黎軍.釉粳稻亞種間分子標(biāo)記差異分析.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008, 36 (5) :1778-1780);張 曉璐利用分子標(biāo)記在虎亞種識別中達(dá)到極高的準(zhǔn)確率（張曉璐.虎亞種識別的分子遺傳學(xué) 技術(shù)的研究.[碩士學(xué)位].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)圖書館，2005)，可見分子標(biāo)記在鑒別亞種 方面是非常方便準(zhǔn)確，具有極大的優(yōu)勢。不同核型的雜交水牛在特定染色體（河流型4和9 號染色體，沼澤型1號染色體）的數(shù)量上有所區(qū)別，2n = 48核型的水牛擁有兩條沼澤型1號 染色體，無河流型4和9號染色體；2n = 49核型的水牛擁有一條沼澤型1號染色體，河流型 4和9號染色體個(gè)一條；2n = 50核型的水牛無沼澤型1號染色體，擁有兩條河流型4和9號 染色體。這些區(qū)別會導(dǎo)致位于這些染色體上的基因序列，在不同核型雜交水牛上會有差異， 利用分子標(biāo)記方法，可以找到不同核型之間基因序列的穩(wěn)定性差異，從而辨別核型。經(jīng)過大 量的文獻(xiàn)查找，有如下基因位于以上3條染色體中：AC02、ACTA1、CSF1R、CSF2、CGN1、GAPDH、 GLI、IFNG、IGF1、RBP3、LDHB、LYZ、TPI1、LDLR、EEF2。其中，后兩個(gè)在河流型水牛9號染色體 上（Iannuzzi L,Cnriabbam,Via A. A genetic physical map in river Buffalo (Bubalus bubalis,2n = 50). Caryologia,1998, 5:311-318 ；Nahas SE, Hondt HA, Soussa SF, Ghor AE, Hanssan AA. Assignment of new loci to river Buffalo chromosomes confirms the Nature of chromosomes4and5.J.Anim. Breed. Genet, 1999,116:21-28)。通過大量的試驗(yàn) 最終從RBP3基因上找到符合條件的突變位點(diǎn)，可以較為準(zhǔn)確快速地辨別不同核型的雜交 水牛。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立一種快速鑒別雜交水牛染色體核型的新方法。
[0006] 通過優(yōu)化外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得雜交水牛的染色體數(shù)目，選取定位于沼澤 型水牛1號染色體上的RBP3基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，找到特異性突變位點(diǎn)，與染色體數(shù)目進(jìn)行 對比，通過凝膠的條帶的區(qū)別來鑒別染色體數(shù)量的多少。
[0007] 以黃牛的DNA為模板設(shè)計(jì)引物，得到可辨別核型的水牛RBP3基因的兩個(gè)突變位 點(diǎn)，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。RBP3-1的365bp處有一 個(gè)A365-T365的堿基突變；在RBP3-2的442bp處有一個(gè)G442-A442的堿基突變，兩者可以 辨別雜交水牛的三種核型。
[0008] 設(shè)計(jì)了可以辨別核型的RBP3基因的兩段DNA片段的引物對，所述的RBP3-1引物 對的正向引物為 5'-GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'（SEQ ID NO :3)，反向引物為 5'-TCCTTA CCTATGTGACGCTTGACG-3 (SEQ ID NO :4);所述的 RBP3-2 引物對的正向引物為 5' -AACACCTAT CCACGACCTTTATCAT-3'（SEQ ID NO :5)，反向引物為 5'-AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3'（ SEQ ID NO ：6)〇
[0009] -種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法，包括以下步驟：
[0010] 1)提取雜交水牛的總DNA ;
[0011] 2)根據(jù)水牛RBP3基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)兩組引物對-- RBP3-1引物對和RBP3-2引物對，其中：
[0012] RBP3-1 的正向引物為 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'，
[0013] RBP3-1 的反向引物為 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3' ；
[0014] RBP3-2 的正向引物為 5' -AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'，
[0015] RBP3-2 的反向引物為 5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3' ；
[0016] 3)分別用步驟2)中的兩組引物對雜交水牛的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩種擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[0017] 4)分別對步驟3)所得到的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、分型：RBP3_1引物對的擴(kuò)增產(chǎn) 物選用Ecil內(nèi)切酶，酶切條帶中出現(xiàn)2條帶確認(rèn)為2N = 50核型；RBP3-2引物對的擴(kuò)增產(chǎn) 物選用Drdl內(nèi)切酶，酶切條帶中出現(xiàn)1條帶確認(rèn)為2N = 48核型，酶切條帶中出現(xiàn)3條帶 確認(rèn)為2N = 49核型。
[0018] 步驟3)中的PCR擴(kuò)增體系為：雙蒸水8μ L、Mixl0y L、正向引物0. 5μ L、反向引物 0. 5yL、雜交水牛 DNAlyL。
[0019] 步驟4)中所述的酶切，是將兩種擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L分別與雙蒸水3. 5 μ L、 lOXBufferl μ L、10U/ μ L的內(nèi)切酶0· 5 μ L混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置2-4h。
[0020] 本發(fā)明的效果是：本發(fā)明可以快速、準(zhǔn)確地鑒別雜交水牛染色體核型數(shù)，可以作為 雜交水牛的分子標(biāo)記選育手段，加速雜交水牛的選育效率。
[0021] 更詳細(xì)的技術(shù)方案見《【具體實(shí)施方式】》。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1 :是本發(fā)明的技術(shù)流程示意圖。
[0023] 圖2 :是水牛RBP3基因一個(gè)片段RBP3-1的DNA序列、突變位點(diǎn)及引物。
[0024] 圖3 :是水牛RBP3基因另一個(gè)片段RBP3-2的DNA序列、突變位點(diǎn)及引物。
[0025] 圖 4 :是 RBP3-1 的 365bp 處 A365-T365 的堿基突變。
[0026] 圖5 :是三種核型的RBP3-1酶切電泳圖譜。
[0027] 圖 6 :是 RBP3-2 的 442bp 處 G442-A442 的堿基突變。
[0028] 圖7 :是三種核型的RBP3-2酶切電泳圖譜。
[0029] 圖8 :是2N = 48雜交水牛染色體核型。
[0030] 圖9 :是2N = 49雜交水牛染色體核型。
[0031] 圖10 :是2N = 50雜交水牛染色體核型。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1
[0033] (一）RBP3基因兩段DNA序列PCR擴(kuò)增
[0034] 1.引物設(shè)計(jì)
[0035] 用黃牛RBP3基因作模板序列，設(shè)計(jì)引物對，根據(jù)SEQ ID NO :1所述RBP3-1的正向 引物為 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'，反向引物為 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3 ; 根據(jù) SEQ ID N0 :2 所述 RBP3-2 的正向引物為 5'-AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'，反向引 物為5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3'。用普通PCR方法擴(kuò)增雜交水牛RBP3基因的 兩段DNA片段，PCR產(chǎn)物純化和測序，通過序列分析獲得如序列表SEQ ID N0 :1和SEQ ID NO :2所述的序列；在RBP3-1的365bp處有一個(gè)A365-T365的堿基突變；在RBP3-2的442bp 處有一個(gè)G442-A442的堿基突變?？杀鎰e雜交水牛的不同核型。
[0036] 2. PCR產(chǎn)物的純化和測序
[0037] PCR 擴(kuò)增：
[0038] 1)SEQ ID N0:1
[0039] 20 μ L體系：雙蒸水8 μ L、MixlO μ L、正向引物0· 5 μ L、反向引物0· 5 μ L、雜交水 牛 DNA1 μ L。擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，55. 2°C退火 40s，72°C延伸 40s，35 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min，16°C保持5min。共51個(gè)樣本，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
[0040] 2)SEQ ID NO :2
[0041] 20μ L體系：雙蒸水8μ L、Mixl0y L、正向引物0. 5μ L、反向引物0. 5μ L、雜交水牛 DNA1 μ L。擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循 環(huán)，72°C再延伸5min，16°C保持5min。共51個(gè)樣本，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 送公司測序。
[0042] (二）PCR-RFLP診斷方法建立
[0043] RFLP 檢測：
[0044] 1)SEQ ID N0:1
[0045] 10yL酶切體系：雙蒸水3. 5yL、10XBufferlyL、限制性內(nèi)切酶 EcilO. 5μ LdOU/μ L)、PCR產(chǎn)物5μ L。將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置2-4h。2%瓊 脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
[0046] 擴(kuò)增雜交水?；蚪MDNA得到了 1008bp左右大小的特異性擴(kuò)增片段，序列分析結(jié) 果表明在365bp處存在A365-T365突變。該基因突變位點(diǎn)由兩個(gè)等位基因控制，其中T是 沒有形成酶切位點(diǎn)的等位基因，A是形成酶切位點(diǎn)的等位基因。這兩個(gè)等位基因可組成三 種基因型，其中TT型為未發(fā)生酶切的純合型（電泳檢測時(shí)只有1008bp -條DNA帶），AA型 為發(fā)生酶切的純合型（電泳檢測時(shí)出現(xiàn)642bp和365bp兩條DNA帶），TC為雜合型（電泳 檢測時(shí)出現(xiàn)1008bp、642bp和365bp三條DNA帶）。
[0047] 2)SEQ ID NO :2
[0048] 10yL酶切體系：雙蒸水3. 5yL、10XBufferlyL、限制性內(nèi)切酶 DrdlO. 5 μ L(10U/ μ L)、PCR產(chǎn)物5 μ L。將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置2-4h。2%瓊 脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
[0049] 擴(kuò)增雜交水?；蚪MDNA得到了 747bp左右大小的特異性擴(kuò)增片段，序列分析結(jié) 果表明在442bp處存在G442-A442突變.該基因突變位點(diǎn)由兩個(gè)等位基因控制，其中A是 沒有形成酶切位點(diǎn)的等位基因，G是形成酶切位點(diǎn)的等位基因。這兩個(gè)等位基因可組成三 種基因型，其中AA型為未發(fā)生酶切的純合型（電泳檢測時(shí)只有747bp -條DNA帶），GG型 為發(fā)生酶切的純合型（電泳檢測時(shí)出442bp和305bp兩條DNA帶），AG為雜合型（電泳檢 測時(shí)出現(xiàn)747bp、442bp和305bp三條DNA帶）。
[0050] 水牛RBP3基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)可以辨別雜交水牛的核型，對51頭雜交水牛進(jìn)行 酶切分型，核型數(shù)由傳統(tǒng)的核型分析方法所得，得到的數(shù)據(jù)如下：
[0051] 表1不同核型的酶切條帶統(tǒng)計(jì)（個(gè)體數(shù)）
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 提取雜交水牛的總DNA ; 2) 根據(jù)水牛RBP3基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)兩組引物對--RBP3-1引 物對和RBP3-2引物對，其中： RBP3-1 的正向引物為 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'， RBP3-1 的反向引物為 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3' ； RBP3-2 的正向引物為 5' -AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'， RBP3-2 的反向引物為 5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3' ； 3) 分別用步驟2)中的兩組引物對雜交水牛的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩種擴(kuò)增產(chǎn)物； 4) 分別對步驟3)所得到的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、分型：RBP3-1引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物選 用Ecil內(nèi)切酶，酶切條帶中出現(xiàn)2條帶確認(rèn)為2N = 50核型；RBP3-2引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物選 用Drdl內(nèi)切酶，酶切條帶中出現(xiàn)1條帶確認(rèn)為2N = 48核型，酶切條帶中出現(xiàn)3條帶確認(rèn) 為2N = 49核型。
2. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法，其特征在于：步驟3)中 的PCR擴(kuò)增體系為：雙蒸水8 μ L、MixlO μ L、正向引物0. 5 μ L、反向引物0. 5 μ L、雜交水牛 DNA1μ L。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的快速鑒別雜交水牛染色體核型的方法，其特征在于：步驟 4)中所述的酶切，是將兩種擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L分別與雙蒸水3. 5 μ L、10 X Buffer 1 μ L、10U/ μ L 的內(nèi)切酶〇. 5 μ L混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置2-4h。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152549SQ201410332529
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】熊家軍, 楊利國, 蘇皖中, 劉青, 劉孝然, 張華林, 張祖翔, 楊菲菲, 潘斌 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 湖北勁牛牧業(yè)有限公司