一種基于est-ssr標記的甜瓜雜交種種子純度鑒定的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于EST-SSR標記的甜瓜品種綠天使雜交種種子純度鑒定的方法。該方法以甜瓜品種綠天使雜交種及其雙親的基因組DNA為模板，通過GeneBank數(shù)據(jù)庫上公布的214條甜瓜EST序列，利用Primer3.0在線引物設(shè)計，設(shè)計了57對EST-SSR引物。經(jīng)過篩選，得到1對雜交種帶型為雙親的互補帶型引物，經(jīng)田間驗證試驗引物穩(wěn)定性良好，且與田間試驗結(jié)果較為吻合，能夠?qū)μ鸸想s交品種進行純度鑒定。本發(fā)明的檢測方法在3h之內(nèi)即可完成種子純度鑒定工作，具有快速、低成本、操作方便等優(yōu)勢。
【專利說明】-種基于EST-SSR標記的甜瓜雜交種種子純度鑒定的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜育種與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及甜瓜雜交種純度鑒定方法，更 具體的是一種基于EST-SSR分子標記技術(shù)的雜交種種子純度鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本最關(guān)鍵的生產(chǎn)資料，其純度的高低是直接衡量種子質(zhì)量 優(yōu)劣的主要指標。種子純度降低會顯著降低作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)，使農(nóng)民蒙受巨大的經(jīng) 濟損失。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法是以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，其周期長、工作 量大，且易受環(huán)境、季節(jié)因素影響，導(dǎo)致結(jié)果存在偏差。因此，開發(fā)快速、準確的種子純度鑒 定方法已成為種子科研單位和企業(yè)共同關(guān)注的課題。
[0003] 伴隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，種子純度鑒定技術(shù)由傳統(tǒng)的形態(tài)標記鑒定逐步 發(fā)展到集形態(tài)標記鑒定、生化標記鑒定和DNA分子標記鑒定為一體的綜合鑒定技術(shù)體系。 DNA分子標記是DNA在分子水平上遺傳變異的直接反映，它們遺傳性穩(wěn)定，信息量大，不受 內(nèi)外環(huán)境的影響，而且具有與基因表達與否無關(guān)、檢測迅速和操作簡便等突出優(yōu)點，因此， DNA分子標記成為理想的快速鑒定種子純度的檢測方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR 及ISSR標記等在雜交種純度鑒定中都有應(yīng)用。
[0004] SSR標記因其具有共顯性、多態(tài)性高、實驗程序簡單等優(yōu)點，是目前作物品種鑒 定和種子純度鑒定研究中最常用的標記之一。目前開發(fā)的SSR標記主要有基因組SSR和 EST-SSR兩類。相對于基因組SSR，EST-SSR充分利用現(xiàn)有的測序數(shù)據(jù)，省去了 SSR引物開 發(fā)過程中的文庫構(gòu)建和測序等步驟，降低了成本。近年來，隨著測序技術(shù)的不斷提高和分子 生物學(xué)的深入研究，大量瓜類作物的EST被測序，迄今為止，國際葫蘆科基因組計劃研究小 組共收錄西瓜ESTs7856條，甜瓜126940條，黃瓜359105條。
[0005] EST序列可從世界三大數(shù)據(jù)庫EMBL (歐洲分子生物學(xué)實驗室)、NCBI (美國國家生 物技術(shù)信息中心）以及DDBJ (日本DNA數(shù)據(jù)庫）獲取，再利用相關(guān)軟件即可設(shè)計得到SSR引 物。EST序列中SSR的含量較高，而且在種屬間具有良好的通用性。馮建明等對西瓜978 條unigene序列分析，共檢索出2136個EST-SSR，出現(xiàn)頻率為53. 4%，Kong等研究發(fā)現(xiàn)甜瓜 EST序列每4. 7kb出現(xiàn)一個SSR，22個EST-SSR引物對平均能揭示2. 9個等位基因，平均期 望雜合度〇. 442,有15對引物能在黃瓜上擴增出條帶。關(guān)媛等從902條黃瓜果實EST檢索 出63個SSR，設(shè)計了 37對引物，共有14對引物在黃瓜和甜瓜之間有多態(tài)。胡建斌等從來源 于NCBI數(shù)據(jù)庫的6507條ESTs中檢索到784個SSR。Kong等利用來源于NCBI的黃瓜EST 序列設(shè)計了 54對EST-SSR，分析了 20份黃瓜材料的遺傳多樣性，其中有13對引物在甜瓜 中擴增出了特異片段，7對引物檢測出多態(tài)性。EST-SSR在葫蘆科瓜類作物中的開發(fā)和應(yīng)用 尚處于起始階段，由于來源于西瓜、甜瓜和黃瓜中的EST數(shù)量有限，造成可以利用的SSR偏 少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于公開了一種基于EST-SSR分子標記技術(shù)的甜瓜雜交種種子純 度鑒定方法，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案： 本方法通過對供試甜瓜雜交種進行DNA提取、PCR擴增和EST-SSR分析，確認了雜交種 及其雙親穩(wěn)定的共顯性互補帶型，從而對甜瓜雜交種進行純度鑒定。用于鑒定甜瓜雜交種 種子純度的SSR引物，包括引物正向序列：5' - GCACGAGGCTCAACTACC -3'，反向引物序列： 5' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3'。
[0007] 本發(fā)明所述快速鑒定甜瓜雜交種種子純度的方法，該方法以溫室甜瓜品種綠天使 供試種子(天津科潤蔬菜研究所）的基因組DNA為模板，對已知品種綠天使親本DNA差異性 片段進行分析。供試甜瓜雜交種取樣及DNA提取方法為：對溫室甜瓜(來自天津科潤蔬菜 研究所）隨機取樣，總共50株，取靠近根部的嫩葉部分50?100 mg,液氮冷凍研磨（Retsch MM400 生物粉碎儀），加入 CTAB 裂解緩沖液（20 g/L CTAB，1. 4 M NaCl，0· 1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA) 500 μ L，65°C恒溫水?。∟eslab)裂解30min，后續(xù)DNA提取純化按樹脂型基因組 DNA提純試劑盒(賽百盛）操作進行。DNA提取后濃度統(tǒng)一稀釋至50 ± 1 ng/ μ L，Nanodrop ND1000, Thermol)。DNA提取方法也可以按市售試劑盒進行。
[0008] 供試甜瓜雜交種PCR方法為： (1) SSR上游引物序列： 5, - GCACGAGGCTCAACTACC -3,， SSR 下游引物序列：5' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG-3'。
[0009] ⑵采用上述SSR引物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增 反應(yīng)的總體積為1〇μ L，擴增反應(yīng)體系為：2XGoTaq? Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物 10 μ mol/L各0.5 μ L，供試甜瓜雜交種基因組DNA模板（50 ng/μ L) 1 μ L，雙蒸水補足10 μ L ;PCR 反應(yīng)程序為 95°C預(yù)變性 2 min，32 個擴增循環(huán)（94°C 45 sec，55°C 45 sec，72°C，45 sec) ;72°C延伸 7min，4°C保存； 供試甜瓜雜交種PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，凝膠 組分為：去離子水 21 mL，10XTBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μ L，10% 過流酰胺 300 μ L ; 設(shè)定電壓250 V，電泳1 h，關(guān)閉電源，進行染色；染色過程：銀染8?10 min，迅速水洗，NaOH 顯色數(shù)分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗； 供試甜瓜雜交種EST-SSR結(jié)果分析，比較雜交種及其雙親的特征譜帶，對供試種子樣 品進行共顯性互補帶型分析，通過計算供試品種樣品中雜交種數(shù)量占總樣品數(shù)量的比例確 定種子純度。
[0010] 為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗方法做以詳細的 說明。
[0011]、原理： 本方法應(yīng)用一種新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1?6個堿基為重復(fù)單 元，是存在于EST中的SSR。EST ( Expressed sequence tag,表達序列標簽）是將mRNA在 體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到質(zhì)?；蚴删w載體構(gòu)建cDNA文庫后，大規(guī)模隨機挑取cDNA克 隆，對其5'端或3'端進行測序后獲得的長約150?500bp的表達序列片段。EST序列來自 實驗室構(gòu)建的cDNA文庫或從美國國家生物信息中心（NCBI)的Genbank中下載。采用相關(guān) 軟件合成引物，最后對研究材料進行PCR擴增和凝膠電泳，通過特異譜帶進行分析，從而計 算雜交種的純度。 2、 引物設(shè)計 通過Gene Bank數(shù)據(jù)庫上公布的214條甜瓜EST序列，利用Primer 3. 0在線引物設(shè)計， 引物由上海生工合成，經(jīng)篩選獲得了 1對EST-SSR引物可用于甜瓜雜交種種子純度鑒定。引 物由上海生物工程公司合成。
[0012] 表1弓|物序列表如下：

【權(quán)利要求】
1. 用于鑒定甜瓜雜交種種子純度的1對SSR引物，其特征在于包括上游引物序列：5'_ GCACGAGGCTCAACTACC-3'，下游引物序列：5' -GAGACCGAAATTGAAGAATAG-3'。
2. -種采用權(quán)利要求1所述引物，基于EST-SSR標記的甜瓜雜交種種子鑒定純度的方 法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 采用權(quán)利要求1所述的上游引物序列： 5' -GCACGAGGCTCAACTACC-3'，下游引物序列： 5 ' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3 '引物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的 PCR擴增反應(yīng)的總體積為10 UL，擴增反應(yīng)體系為：2XGoTaq?Master Mixes 5 yL，上游和 下游引物10 μ mol/L各0. 5 μ L，供試甜瓜雜交種基因組DNA模板，50 ng/ μ L，1 μ L，雙蒸水 補足10 μ L ;PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性2 min，32個擴增循環(huán)，94°C 45 sec，55°C 45 sec， 72? 45 sec ;72°C 延伸 7min，4°C 保存； (2) 對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，凝膠組分為：去 離子水 21 mL，10XTBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μ L，10% 過流酰胺 300 μ L ;設(shè)定電壓 250 V，電泳30 min，關(guān)閉電源，進行染色；染色過程：銀染8?10 min，迅速水洗，NaOH顯色 數(shù)分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗； (3) 通過分析EST-SSR結(jié)果，比較雜交種及其雙親的特征譜帶，對供試種子樣品進行共 顯性互補帶型分析，通過計算供試品種樣品中雜交種數(shù)量占總樣品數(shù)量的比例確定種子純 度。
3. 權(quán)利要求2所述的基于EST-SSR標記的甜瓜雜交種種子鑒定純度的方法，其中所述 的甜瓜指的是：西瓜、黃瓜。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059992SQ201410332784
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】張若緯, 李歐靜, 彭冬秀, 蘭慶闊, 武云鵬, 王永, 李秀秀 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司, 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所