抗壞血酸結(jié)合卡利比克畢赤酵母防治水果采后病害的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗壞血酸結(jié)合卡利比克畢赤酵母防治水果采后病害的方法,屬于水果采后病害生物防治領域。將卡利比克畢赤酵母（Pichiacaribbica）活化,接種到NYDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，離心得到菌體，將菌體用兩倍終濃度抗壞血酸(VC)稀釋卡利比克畢赤酵母成1×108cells/mL的菌懸液（抗壞血酸的終濃度為150μg/mL-350μg/mL之間)；將菌懸液均勻噴灑于水果上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。本發(fā)明利用抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用提高其對水果采后病害生物防治的效力，使用簡單，操作方便，效果好，成本低。
【專利說明】抗壞血酸結(jié)合卡利比克畢赤酵母防治水果采后病害的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母(/7ZcAia cariMica)使用防治水果采后病害的方法，屬于水果采后病害生物防治領域。
【背景技術(shù)】
[0002]水果采后病害造成的損失是巨大的。根據(jù)一般保守的估計，我國水果采后損失為20% -25%左右。導致水果采后損失的因素很多，由于病原菌侵染造成的腐爛是造成水果采后損失的主要原因，其中霉菌是水果采后主要病原菌。引起水果貯藏期間腐爛的霉菌種類很多，但每種水果占優(yōu)勢的致病菌一般有2-3種。病原真菌對采后水果的危害不僅在于其導致水果在數(shù)量上的嚴重損失，而且許多病原真菌能分泌產(chǎn)生許多次生代謝產(chǎn)物會引起嚴重的食品安全問題，如曲霉菌(Aspergillus fIavus和Aspergillus parasiticus等)產(chǎn)生的黃曲霉毒素、擴展青霉iPeniciIIium expansum)產(chǎn)生的棒曲霉素(patulin)等。
[0003]長期以來，控制水果采后病害的主要措施是使用殺菌劑。根據(jù)一項最新的統(tǒng)計，殺菌劑在農(nóng)業(yè)作物保護總市場占有23.8%的份額，金額達73億美元。大部分的殺菌劑被用在水果和蔬菜上，并且果農(nóng)大多在采前和采后都使用化學殺菌劑以防止水果采后病害的發(fā)生，因此比起其它的農(nóng)藥來說人類更易直接接觸殺菌劑。殺菌劑的長期和大量使用，嚴重污染環(huán)境，有損于人類健康。過去十多年，公眾和科學界對于食品和環(huán)境中農(nóng)藥(尤其殺菌齊U)殘毒問題的關注日益增加。美國國家科學院(NAS)的報道(1987)指出，殺菌劑的應用對人類健康造成了危害；全美9種致瘤化合物的銷售量中，殺菌劑占90%左右，在用于食物的全部農(nóng)藥中，殺菌劑構(gòu)成60%的致瘤危險。
[0004]隨著國家經(jīng)濟發(fā)展和消費水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護意識增強，我國食品中的農(nóng)藥(包括化學殺菌劑)殘留已引起了人們的高度重視。因此，研究并開發(fā)替代化學殺菌劑的安全、無毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社會意義和廣闊的應用前景。當前國際上越來越重視用有益微生物進行水果采后病害生物防治的研究，并認為這是最有希望取代化學殺菌劑的方向之一。
[0005]自從以色列學者Guter首次報道枯草芽孢桿菌Qkicillus subtil is)對水果病原菌有拮抗作用以來，利用拮抗菌進行水果采后病害的生物防治目前已取得了突破性的進展，被認為是最有希望替代化學殺菌劑的方法。例如在美國，自1979年美國環(huán)境保護署批準使用首個生物防治微生物作為生防菌以來，截止到2004年已有26個微生物(14種細菌和12種真菌)被該機構(gòu)認可并注冊。
[0006]隨著酵母分類、生態(tài)、生理、生物化學和分子生物學的研究取得進展，人們對農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏中利用酵母的興趣日益提高。國內(nèi)外的研究表明，許多酵母菌應用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。酵母菌遺傳穩(wěn)定，抑菌譜廣、效價高，一般不產(chǎn)生對人和寄主植物有害的代謝產(chǎn)物，安全性高，且對營養(yǎng)要求低，生長快，并對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數(shù)殺菌劑不敏感，對其它化學和物理處理能夠相容，因此近年來拮抗酵母作為水果采后病害生防菌，受到國際上的廣泛關注。畢赤酵母OcYcAia guiIliermondii)是國際上最早被報道能抑制果實病原真菌的生物防治酵母，而Candida oleophilia isolate 1-182已經(jīng)在1995年作為生物殺菌劑在美國環(huán)境保護署(EPA)登記，并已經(jīng)由美國Ecogen公司商業(yè)化。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隱球磨 母iCryptococcus albidus')也已經(jīng)商業(yè)化，商品名為Yield Plus。
[0007]從國內(nèi)外文獻中可知，以有效微生物取代化學殺菌劑用于水果采后病害的防治已顯示出巨大的應用前景，水果采后病害的生物防治已成為一個新的研究熱點。但到目前為止，已實際應用于生產(chǎn)的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire等少數(shù)幾種產(chǎn)品上市，而我國目前尚沒有拮抗菌應用于實際生產(chǎn)。主要原因在于商業(yè)生產(chǎn)條件下，由于環(huán)境條件的不確定性，微生物防治的效果往往不如化學殺菌劑的效果，從而達不到保鮮要求。這些因素影響了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產(chǎn)中的使用。
[0008]拮抗酵母防治水果采后病害的一個主要特點是利用其能在果實受傷處或表面快速生長，從而與病原菌開展營養(yǎng)和空間上的競爭，以達到抑制病原菌的目的。目前即使是已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的Candida oleophila (商品名為ASPIRE)也只有在與低劑量殺菌劑同時使用時才能達到足夠有效的防護作用，而且它們一般都不能有效地控制處于潛伏狀態(tài)的病原菌，即僅具有保護效果而缺乏治療能力，并且對病原菌拮抗的穩(wěn)定性和廣譜性上與化學殺菌劑相比也還有很大的差距。此外，拮抗酵母需要較高濃度下才能有效作用的特點也將產(chǎn)生很大的經(jīng)濟成本壓力。這些因素都對其商業(yè)化造成了諸多限制。因此拮抗酵母生物防治的效力必須得到進一步的提聞和改進。
[0009]抗壞血酸(Ascorbic acid)是一種天然存在的具有抗氧化性質(zhì)的有機化合物?？箟难嵋兹苡谒纬奢p度酸性的溶液。抗壞血酸是維生素C的一種形式(類維生素)?？箟难嵫苌谄咸烟牵侨祟惐仨毜臓I養(yǎng)素之一，也是常用的食品添加劑之一。因此可作為誘導拮抗劑的激發(fā)子。另外，抗壞血酸作為抗氧化劑和拮抗酵母結(jié)合使用，可以提高拮抗酵母對氧化脅迫的耐受性，從而提高其對水果采后病害的生物防治效力。
[0010]本發(fā)明利用抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用提高其對水果采后病害生物防治的效力，從而降低水果的腐爛率，進而達到水果貯藏保鮮的目的。
[0011]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明利用抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用提高其對水果采后病害生物防治的效力，經(jīng)抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用，可以明顯地抑制蘋果青霉病，桃果根霉病，防治其采后腐爛。本發(fā)明具有安全，高效，成本低等優(yōu)點，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果采后病害造成的損失。
[0012]本發(fā)明提供了抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母使用防治水果采后病害的方法，按照下述步驟進行:將卡利比克畢赤酵母活化，用NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)卡利比克畢赤酵母，離心得到菌體，配制含抗壞血酸(VC)的酵母濃度為I X IO8個/mL菌懸液；將菌懸液均勻噴灑在水果上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。
[0013]其中所述的NYDB培養(yǎng)基為:酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，純化水1000ml, pH自然。
[0014]其中所述的卡利比克畢赤酵母(/7ZcAia Caribbioa^0
[0015]其中所述的配制含抗壞血酸(VC)的酵母濃度為I X IO8個/mL菌懸液方法，按照下述步驟進行:將菌體用無菌水稀釋制備成2 X IO8個/mL菌懸液，與濃度為兩倍終濃度的抗壞血酸(VC)按體積比1:1混合，而抗壞血酸(VC)的最終濃度為150 μ g/mL-350 μ g/mL。
[0016]其中所述的水果為蘋果，桃果。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點:
(I)本發(fā)明所使用的卡利比克畢赤酵母OcYcAia cari bbi ca)為本實驗室篩選,其拮抗效力強，對人體無害。
[0018](2)本發(fā)明所使用的抗壞血酸(VC)來源廣泛，價格低廉，無毒無害。
[0019](3)本發(fā)明使用抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用，與單獨使用抗壞血酸(VC)處
理或卡利比克畢赤酵母處理相比，可以顯著提高卡利比克畢赤酵母的拮抗活性，從而降低水果的腐爛率，進而達到水果貯藏保鮮的目的。
[0020](4)本發(fā)明使用抗壞血酸(VC)和卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用，可以代替化學殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學殺菌劑對人的危害，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]其中圖1為抗壞血酸(VC)與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對蘋果青霉病的控制效果。注:CK:無菌蒸懼水，即對照組；0:1 X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液；150:I X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液(含終濃度為150 μ g/mL的VC)；200:1 X IO8個/ml的P.carribbica酵母菌懸液(含終濃度為200 μ g/mL的VC) ；250:1 X IO8個/ml的P.carri姑ica 酵母菌懸液(含終濃度為 250 μ g/mL 的 VC);300:1 X IO8 個/ml 的/I carribbica酵母菌懸液(含終濃度為300 μ g/mL的VC) ；350:1 X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液(含終濃度為350 μ g/mL的VC)。發(fā)病率是25°C放置15 d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著(P=0.05)。
[0022]圖2為抗壞血酸(VC)與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對桃果根霉病的控制效果。注:CK:無菌蒸懼水，即對照組；0:1X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液；50:1 X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液(含終濃度為50 μ g/mL的VC); 100:1 X IO8個/ml的Acarribbica 酵母菌懸液(含終濃度為 100 μ g/mL 的 VC); 150:1 X IO8 個 /ml 的/I carribbica酵母菌懸液(含終濃度為150 μ g/mL的VC) ；200:1 X IO8個/ml的A carribbica酵母菌懸液(含終濃度為200 μ g/mL的VC) ；250:1 X IO8個/ml的P.carribbica酵母菌懸液(含終濃度為250 μ g/mL的VC)。發(fā)病率是25°C放置15d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著(P=0.05)。
[0023]圖3為抗壞血酸(VC)與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對蘋果自然腐爛的影響。注:CK:無菌蒸餾水，即對照組；VC =250 μ g/mL的抗壞血酸(VC);酵母:1 X IO8個/ml的Acarribbica酵母菌懸液；結(jié)合:1 X IO8個/ml的P.carribbica酵母菌懸液(含終濃度為250 μ g/mL的VC)。不同字母代表差異顯著(P=0.05)。
[0024]圖4為抗壞血酸(VC)與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對桃果自然腐爛的影響。注:CK:無菌蒸餾水，即對照組；VC:200 μ g/mL的抗壞血酸(VC);酵母:1 X IO8個/ml的Acarribbica酵母菌懸液；結(jié)合:1 X IO8個/ml的P.carribbica酵母菌懸液(含終濃度為200 μ g/mL的VC)。不同字母代表差異顯著(P=0.05)?！揪唧w實施方式】
[0025]通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實施實例的限制。
[0026]卡利比克畢赤酵母iP.carribbica)系本實驗室篩選得到,現(xiàn)保存于位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株編號為CGMCC N0.3616，于NYDA(NYDB培養(yǎng)基的基礎上添加2%的瓊脂(質(zhì)量計))培養(yǎng)基4°C低溫保存。NYDB培養(yǎng)基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，自然pH。
[0027]培養(yǎng)程序為:⑴固體活化:將畢赤酵母接種于NYDA培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)48h ；
(2)液體培養(yǎng):在250ml的三角瓶中裝入50ml的NYDB種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入一環(huán)活化好的畢赤酵母，在190rpm, 28°C條件下培養(yǎng)20h ； (3)離心分離再懸浮:上述酵母培養(yǎng)混合物在7000g條件下,離心10 — 15min,并用無菌蒸懼水洗漆2次，以去除培養(yǎng)介質(zhì),用無菌蒸餾水重新再懸浮，并用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)酵母細胞濃度為2X IO8 cells/ml，再用滅過菌的生理鹽水或抗壞血酸溶液稀釋到所需濃度
實施例1:抗壞血酸(VC)與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對對水果病害的抑制效果 一、試驗方案
供試的果實經(jīng)過精細挑選，盡量選擇果實均勻一致，表面無擦傷！機械傷和病蟲傷害。將水果用無菌打孔器打孔，其中蘋果的表面?zhèn)跒?mm(直徑)X3mm(深)，桃果的表面?zhèn)跒?mm(直徑)X3mm(深)。每個傷口處等量加入30 μ I以下處理液:(I) I X IO8Cells/mL的卡利比克畢赤酵母懸液(含各濃度抗壞血酸)；(2) I X 108cells/mL的羅倫隱球酵母菌懸液；(3)無菌水。3h后，再向水果傷口處分別接種30μ L以下致病菌孢子懸浮液:向蘋果傷口處接種5 X 108spores/mL的擴展青霉{Penicillium expanusm)孢子懸浮液，向桃果傷口處接種I X 104spores/mL的匍枝根霉iRhizopus stolonifer)孢子懸浮液。自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(濕度95%)，置于25°C。每處理重復3次，每次重復10個果實。整個試驗重復2次。經(jīng)過若干天的培養(yǎng)，記錄果實發(fā)病率，以此評價卡利比克畢赤酵母的抑菌效果。
[0028]發(fā)病率的計算公式如下:
發(fā)病率(%) =發(fā)病的果實/接種病原菌的果實總數(shù)X100%
二、試驗結(jié)果
按照上述步驟試驗，統(tǒng)計水果的腐爛率結(jié)果如下:
1.1對蘋果青霉病的抑制效果
如圖1中所示，對照組的發(fā)病率為94.4%，單獨的酵母處理組發(fā)病率為38.9%，因此AcariMica在25° C下能夠有效控制由擴展青霉造成蘋果的采后病害。與此同時,與未用VC處理的酵母組相比，VC能顯著地提高酵母的生防效果。其中250ug/ml VC處理組有最好的效果，其蘋果青霉病病害發(fā)病率為19.4%，即效果最為顯著。
[0029]1.2對桃果根霉病的抑制效果
從圖2可以看，酵母與200 μ g/mL VC結(jié)合能顯著抑制桃果根霉病的發(fā)病率，結(jié)合處理青霉病的發(fā)病率23.62%，單獨使用卡利比克畢赤酵母處理也能顯著抑制桃果根霉病，但是效果不如結(jié)合處理，發(fā)病率為54.17%。[0030]實施例2:抗壞血酸與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對水果自然腐爛的抑制效果
一、試驗方案
將以下處理液均勻噴于水果表面，自然晾干:(I) I X IO8個/mL的卡利比克畢赤酵母菌懸液
(含最佳濃度的VC，蘋果為250 μ g/mL VC,桃果為200 μ g/mL VC) ； (2) IX IO8個/mL的卡利比克畢赤酵母菌懸液；⑶VC(蘋果為250 μ g/mL VC，桃果為200 μ g/mL VC)和(4)無菌水。然后，將處理好的果實放入塑料筐用保鮮膜密封。桃果4°C貯藏7天轉(zhuǎn)入20°C (RH95%)的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏；蘋果室溫下貯藏3個月。取出水果統(tǒng)計腐爛水果個數(shù)，并觀察腐爛情況。每處理重復3次，整個實驗重復2次。抗壞血酸與卡利比克畢赤酵母結(jié)合使用對水果自然腐爛的抑制效果以發(fā)病率表示。
[0031]發(fā)病率的計算 公式如下:
發(fā)病率(%) =發(fā)病的果實/接種病原菌的果實總數(shù)X100%
二、試驗結(jié)果
按照上述步驟試驗，統(tǒng)計的自然腐爛率結(jié)果如下:
2.1對蘋果自然腐爛率的影響
從圖3可以看出，經(jīng)過卡利比克畢赤酵母和VC結(jié)合處理的蘋果果實發(fā)病率均顯著低于對照，為40.28%。單獨使用卡利比克畢赤酵母的自然腐爛率效果不如結(jié)合處理好，與結(jié)合處理相比具有顯著差異。
[0032]2.2對桃果發(fā)病率的影響
從圖4可以看出，單獨的卡利比克畢赤酵母組效果顯著，而經(jīng)卡利比克畢赤酵母和VC結(jié)合處理的桃果效果更好，其果實腐爛指數(shù)為31.35%，與對照桃果的腐爛指數(shù)(75%)相比顯著降低。VC單獨處理 并無效果。
【權(quán)利要求】
1.抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于按照下述步驟進行:將卡利比克畢赤酵母活化，用NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)卡利比克畢赤酵母，離心得到菌體，配制含抗壞血酸(VC)的酵母濃度為I X IO8個/mL菌懸液；將菌懸液均勻噴灑在水果上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的NYDB培養(yǎng)基為:酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，純化水1000 ml，pH自然。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的卡利比克畢赤酵母QPi chi a cari bbi ca )。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的配制含抗壞血酸(VC)的酵母濃度為I X IO8個/mL菌懸液方法，按照下述步驟進行:將菌體用無菌水稀釋制備成2 X IO8個/mL菌懸液，與濃度為兩倍終濃度的抗壞血酸(VC)按體積比1:1混合，而抗壞血酸(VC)的最終濃度為150μ g/ml-350 μ g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗壞血酸(VC)結(jié)合卡利比克畢赤酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的水果為蘋果或桃果。
【文檔編號】A23B7/154GK103988893SQ201410027010
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】張紅印, 李超蘭, 張曉云, 楊其亞 申請人:江蘇大學