用于人類耳聾多基因突變篩查的引物、探針及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于人類耳聾多基因突變篩查的引物、探針及其使用方法，屬于基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1、GJB2-M2或GJB2-M3、GJB2-M4和GJB2-M5篩查的引物和探針及其使用方法，用于人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M1或GJB3-M2篩查的引物和探針及其使用方法，用于人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M1和SLC26A4-M2篩查的引物和探針及其使用方法。本發(fā)明提供的引物和探針及其使用方法，可以在同一次PCR反應(yīng)中檢測多個(gè)樣本，相比傳統(tǒng)的檢測方法具有準(zhǔn)確率高、步驟少，耗時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】用于人類耳聾多基因突變篩查的引物、探針及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于人類耳聾多基因突變篩查的引物、探針及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]耳聾是嚴(yán)重影響人類健康的一種常見疾病，也是臨床上最常見的遺傳性疾病之一，因其病因復(fù)雜、發(fā)生率高且治療困難，從而極大的影響著患者的人際交往與生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1%。~3%。，全世界約有7000萬人罹患不同程度的聽力缺損，而我國是世界上聽力障礙人口最多的國家，在全國各類殘疾人中，聽力殘疾約占總數(shù)的24%，累及全國數(shù)千萬個(gè)家庭。
[0003]耳聾的致病因素有很多，包括遺傳因素和環(huán)境因素等，其中約50%_60%由遺傳因素導(dǎo)致，即遺傳性耳聾。在大量遲發(fā)性聽力下降的患者中，許多也是由于自身基因缺陷或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)環(huán)境因素的易感性增加而致病。根據(jù)是否伴有耳外組織的異常或病變，遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾(SHL)和非綜合征性耳聾(NSHL)，其中NSHL占70%甚至更多。而根據(jù)遺傳方式的不同又可將遺傳性耳聾分為常染色體顯性遺傳(DFNA)、常染色體隱性遺傳(DFNB)、X連鎖遺傳、Y連鎖遺傳及線粒體遺傳五類，其中以DFNB最為常見，約占60%~75% ;其次為DFNA，約占20%~30%。一般情況下，DFNB多表現(xiàn)為語前聾或先天性耳聾，DFNA多表現(xiàn)為語后聾或漸進(jìn)性聽力下降。
[0004]隨著基因組學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)于遺傳性耳聾相關(guān)基因及發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，在70%~80%的遺傳性耳聾患者中可發(fā)現(xiàn)致聾基因突變，已知有數(shù)百個(gè)基因與遺傳性耳聾有關(guān)，且絕大多數(shù)的遺傳性耳聾為單基因病，而耳聾相關(guān)的遺傳基因突變?cè)谡Ｈ后w中也并不少見，在我國現(xiàn)有人口中，攜帶遺傳性致聾基因的比例約為6%。研究結(jié)果還表明，遺傳性耳聾的致病基因及同一基因的突變位點(diǎn)在不同種族，甚至在同一種族的不同地區(qū)的人群中都不完全相同。目前，歐美發(fā)達(dá)國家列入耳聾致病基因臨床檢測的項(xiàng)目包括EYAl、TIMM8A、GJB2、GJB6、SLC26A4、USH2A、USH3A、P0U3F4、WFS1、COCH、OTOF, TECTA以及線粒體DNA CmtDNA)等，但最普遍也是最基本的檢測項(xiàng)目是GJB2、GJB6、SLC26A4、COCH和mtDNA基因的突變檢測。而國內(nèi)進(jìn)行的耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國大部分的遺傳性耳聾主要由GJB2、GJB3、SLC26A4以及mtDNA等為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變引起，對(duì)這幾個(gè)基因進(jìn)行遺傳學(xué)檢測可以明確耳聾人群中40%的遺傳學(xué)病因，結(jié)合家族史 分析和查體可以診斷95%以上的遺傳性耳聾，這為我國耳聾致病基因篩查以及臨床基因診斷工作的大規(guī)模開展提供了理論依據(jù)。
[0005]GJB2基因定位于13qll2ql2上，含2個(gè)外顯子，是NSHL最常見的致病基因，已被證實(shí)與常染色體隱性遺傳性耳聾(DFNBl)和顯性遺傳性耳聾(DFNA3)有關(guān)，其編碼的連接蛋白26 (conneXin26)表達(dá)于耳蝸，參與細(xì)胞間信號(hào)介導(dǎo)和離子傳遞。突變的GJB2基因可導(dǎo)致連接蛋白異常，進(jìn)而影響細(xì)胞間隙的連接功能，引起內(nèi)耳鉀離子回收障礙而致耳聾。GJB2基因突變是中國人散發(fā)性先天性耳聾的主要病因，且有26%-33%的語前聾患兒為GJB2基因突變所致。目前在NSHL病人中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種GJB2基因突變類型，其主要突變類型包括 35delG、167delT、235delC、V371、299-300delAT、R143W、W24X 等，這些突變類型在不同種族人群中的發(fā)生頻率和分布情況差異很大，其中35delG為高加索人的致病熱點(diǎn)突變，而我國的致病熱點(diǎn)突變則為235delC。
[0006]GJB3基因于1998年由夏家輝等研究中國兩個(gè)常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾的家系時(shí)定位并克隆，該基因定位于人類染色體1ρ33-ρ35，編碼由270個(gè)氨基酸組成的連接蛋白31 (connexin31)。GJB3突變既可導(dǎo)致DFNA，又可導(dǎo)致DFNB，其錯(cuò)義突變E183K和無義突變R180X被認(rèn)為與高頻聽力下降有關(guān)，復(fù)合雜合突變423-425delATT和423A-G能導(dǎo)致隱性非綜合征性耳聾。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，GJB3基因突變?cè)谥袊@人群中的攜帶率約為3% ο
[0007]SLC26A4基因定位于7q31，亦稱PDS基因，含21個(gè)外顯子，是Pendred綜合征和大前庭水管綜合征的致病基因。SLC26A4基因編碼的Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸組成，其功能主要是參與碘/氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。SLC26A4的突變導(dǎo)致Pendred蛋白發(fā)生異常，既可影響細(xì)胞內(nèi)外陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響聲音傳遞而導(dǎo)致聽力損失。在中國大陸，大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因突變檢出率為97.9%，高于韓國(78%)、日本(92%)和歐洲(40%)。全國分子流行病學(xué)研究結(jié)果表明，中國人群的SLC26A4基因具有獨(dú)特的突變譜，其IVS7-2A>G突變是大前庭水管綜合征中的高發(fā)突變，在聾人群體中的檢出率達(dá)到14.3%，占所有SLC26A4突變的45-60%，其次為第19外顯子上的2168A>G突變。而在歐美國家耳聾患者中最常見的T416P、IVS8+1G>A、L236P等SLC26A4基因突變，在中國大前庭水管綜合征患者中卻鮮有發(fā)現(xiàn)。
[0008]綜上所述，對(duì)遺傳性耳聾致病基因GJB2、GJB3和SLC26A4的熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查，明確患者耳聾病因，依據(jù)基因檢測結(jié)果指導(dǎo)臨床醫(yī)生及患者的疾病治療情況以規(guī)避耳聾風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)夫妻雙方均為遺傳性耳聾致病基因攜帶者的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)于我國防治遺傳性耳聾、推進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)具有重要意義。目前，對(duì)遺傳性耳聾致病基因進(jìn)行檢測的方法包括限制性片段長度多·態(tài)性分析(RFLP)，變性高效液相色譜分析(DHPLC)，直接測序法等，這些方法或者不能定性，或者耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時(shí)對(duì)不同基因或同一基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。由于遺傳性耳聾具有遺傳異質(zhì)性強(qiáng)、突變位點(diǎn)多以及人群患病率及攜帶致病基因比例高等特點(diǎn)，因此有必要建立一種高通量、高效率的基因突變檢測方法，以實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測或大規(guī)模的人群篩查?；蛐酒夹g(shù)用于遺傳性耳聾致病基因檢測，具有通量高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，但存在重復(fù)性差、易產(chǎn)生交叉污染從而造成假陽性結(jié)果等缺點(diǎn)。Real-Time PCR法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)上進(jìn)行閉管檢測，能夠有效克服PCR產(chǎn)物遺留污染的問題，且操作簡便、快捷，根據(jù)引物和探針的優(yōu)化設(shè)計(jì)，可同時(shí)檢測多個(gè)樣品不同基因或同一基因的多個(gè)突變位點(diǎn)，能夠有效的應(yīng)用于遺傳性耳聾致病基因檢測，是一種極具潛力的耳聾基因檢測工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為解決上述問題，本發(fā)明提出了一種用于人類耳聾多基因突變篩查的引物、探針及其使用方法。
[0010]一種用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1篩查的引物和探針，所述的引物和探針如下:
[0011]所述的引物為Primer-F和Primer-R,其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的DNA序列，Primer-R為序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列；
[0012]所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.38或SEQID N0.40所示的DNA序列；Probe_2為序列表中SEQ ID N0.39或SEQ ID N0.41所示的DNA序列；
[0013]其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第30-35位堿基G的缺失。
[0014]上述用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1篩查的引物和探針的使用方法，包括如下步驟:
[0015]步驟1:樣品的DNA提??；
[0016]步驟2:熒光PCR擴(kuò)增:
[0017]PCR體系如下:
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R,其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.1或SEQID N0.2所示的DNA序列，Primer-R為序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列； 所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.38或SEQ IDN0.40所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.39或SEQ ID N0.41所示的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第30-35位堿基G的缺失。
2.權(quán)利要求1所述的用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提??； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOX PCR緩沖霞5μ?MgCfc5.0 ~ICLOnimoldNTPs0,8 ~i Jmmol·Primer-FO, I ~I ,Ομηιο IPrimcr-RO, I ~I ,ΟμηιοIProbe-10.5 ~!.Ομηιο IProbe-20.5 ~1.ΟμηιοΙ
Taq _2.0~3.0 U
DNA40 ~_Eg
加水個(gè):SOpL PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F為序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的DNA序列；Primer-R為序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列；Probe-1為序列表中SEQ ID N0.38或 SEQ ID N0.40 所示的 DNA 序列；Probe_2 為序列表中 SEQ ID N0.39 或 SEQ ID N0.41 所不的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定:根據(jù)步驟3得到的GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB2基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M1純合突變； 如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M1野生型； 如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M1雜合突變； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M1為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第30-35位堿基G的缺失。
3.—種用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M2或GJB2-M3篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R,其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.5或SEQID N0.6所示的DNA序列；Primer_R為序列表中SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的DNA序列； 所述的探針為 Probe-l> Probe-2> Probe-3 和 Probe-4, Probe-1 為序列表中 SEQ IDN0.42所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.43所示的DNA序列；Probe_3為序列表中SEQ ID N0.44所示的DNA序列；Probe_4為序列表中SEQ ID N0.45所示的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M2為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第167位堿基T的缺失；所述的人類耳聾GJB2`基因突變GJB2-M3為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第176-191位16個(gè)堿基的缺失。
4.權(quán)利要求3所述的用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M2或GJB2-M3篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提??； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOX PCR緩沖液SpLMgCb5,0~ 10,OmmoldNTPs0,8 ~1,5mmolMmer-F0,1~1.Ομηιο?Priincr-R0.1 ~1.Ομηιο?Probe-10.5 ~1.ΟμηιοiProbc-20.5 ~Ι,ΟμηιοΙProbe-30.5 — 1.Ομηιο?Probc-4D.5 ~1.Ομηιο iTaq _2.0~3,0 U
DNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F為序列表中SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.6所示的DNA序列；Primer-R為序列表中SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的DNA序列；Probe-1為序列表中SEQ ID N0.42所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.43所示的DNA序列；Probe_3為序列表中SEQ ID N0.44所示的DNA序列；Probe_4為序列表中SEQ ID N0.45所示的DNA序列；· 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定: 根據(jù)步驟3得到的GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB2基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M2或GJB2-M3純合突變； 如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M2或GJB2-M3野生型； 如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M2或GJB2-M3雜合突變； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M2為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第167位堿基T的缺失；所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M3為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第176-191位16個(gè)堿基的缺失。
5.一種用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M4篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R, Primer-F為序列表中SEQ ID N0.9或SEQ IDN0.10所示的DNA序列；Primer-R為序列表中SEQ ID N0.11或SEQ ID N0.12所示的DNA序列； 所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.46或SEQ IDN0.48所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.47或SEQ ID N0.49所示的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M4為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第233-235位堿基C的缺失。
6.權(quán)利要求5所述的用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M4篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提??； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOX PCR緩沖液5μ?MgCb5,0~ 10,OmmoldNTPsO J~IjmmolPrimcr-FO, I ~ I ,Ομηιο?Primer-R0.1 ~ I,Ομηιο?Probe-10,5~1,0μηιοΙProbe-20,5 ~L Ομηιο ITaq _2,0 ~3,0 U`
DNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 所示的 DNA 序列；Primer_R為序列表中SEQ ID N0.11或SEQ ID N0.12所示的DNA序列；Probe_l為序列表中SEQ IDN0.46 或 SEQ ID N0.48 所示的 DNA序列;Probe_2 為序列表中 SEQ ID N0.47 或 SEQ ID N0.49所示的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定: 根據(jù)步驟3得到的GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB2基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M4純合突變； 如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M4野生型； 如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M4雜合突變； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M4為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第233-235位堿基C的缺失。
7.一種用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M5篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為 Primer-F 和 Primer-R, Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.13 或 SEQ IDN0.14所示的DNA序列；Primer-R為序列表中SEQ ID N0.15或SEQ ID N0.16所示的DNA序列； 所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.50或SEQ IDN0.52所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.51或SEQ ID N0.53所示的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M5為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第299-300位堿基AT的缺失。
8.權(quán)利要求7所述的用于人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M5篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提?。? 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOX PCR緩沖液5pLMgCIi5,0 ~l0.0mmol·dNTPs0.8 ~L5mmoiPri mer-F0.1 ~ I.Ομηιο IPrimer-R0.1 ~ 1.Ομηιο?Probe-10,5~ Ι,ΟμιηοΙProbc-20,5 ~丨,Ομηιο?Taqft2.0 ~3.0UDNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.13 或 SEQ ID N0.14 所示的 DNA序列；Primer_R為序列表中SEQ ID N0.15或SEQ ID N0.16所示的DNA序列；Probe_l為序列表中SEQ IDN0.50 或 SEQ ID N0.52 所示的DNA序列;Probe_2 為序列表中 SEQ ID N0.51 或 SEQ ID N0.53所示的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定:根據(jù)步驟3得到的GJB2基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB2基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M5純合突變； 如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M5野生型； 如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB2基因?yàn)镚JB2-M5雜合突變； 其中，所述的人類耳聾GJB2基因突變GJB2-M5為人類耳聾GJB2基因的第二外顯子的第299-300位堿基AT的缺失。
9.一種用于人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M1或GJB3-M2篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R,其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.17或SEQID N0.18 所示的 DNA 序列；Primer_R 為序列表中 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.22 和 SEQ ID N0.23 中的任一個(gè)所示的 DNA 序列； 所述的探針為Probe-1、Probe-2> Probe-3和Probe-4,其中Probe-1為序列表中SEQID N0.54所示的DNA序列；Probe_2為序列表中SEQ ID N0.55所示的DNA序列；Probe_3為序列表中SEQ ID N0.56或SEQ ID N0.58所示的DNA序列；Probe_4為序列表中SEQ IDN0.57 或 SEQ ID N0.59 所示的 DNA 序列； 其中，所述的人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M1為人類耳聾GJB3基因的第二外顯子的第538堿基由G變成T ;所述的人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M2為人類耳聾GJB3基因的第二外顯子的的第547堿基由G變成A。
10.權(quán)利要求9所述的用于人類耳`聾GJB3基因突變GJB3-M1或GJB3-M2篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提取； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:IOXPCR緩沖液5μΙMgCK5.0 ~10,OmmoldNTPs0.8 SmmolPrimer-F0.1 ~I ,ΟμιτιοIPri mcr- RO,卜 1.Ομ mo IPro be-10.5 ~L Ομηιο IProbe-20.5 ~1.0μ_1Probe-30.5 ~I.Ομηιο?Probe-40.5 ~ 1.Ομηιο?TaqR2.0-3.0U
DNA40~60ng
加水中:50μ? PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，·72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.17 或 SEQ ID N0.18 所示的 DNA序列；Primer-R為序列表中 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22 和 SEQ ID N0.23中的任一個(gè)所示的DNA序列；Probe-l為序列表中SEQ ID N0.54所示的DNA序列；Probe_2為序列表中SEQ ID N0.55所示的DNA序列；Probe_3為序列表中SEQ ID N0.56或SEQ IDN0.58所示的DNA序列；Probe-4為序列表中SEQ ID N0.57或SEQ ID N0.59所示的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到GJB3基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定: 根據(jù)步驟3得到的GJB3基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB3基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的GJB3基因?yàn)镚JB3-M1或GJB3-M2純合突變； 如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB3基因?yàn)镚JB3-M1或GJB3-M2野生型； 如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的GJB3基因?yàn)镚JB3-M1或GJB3-M2雜合突變； 其中，所述的人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M1為人類耳聾GJB3基因的第二外顯子的第538堿基由G變成T ;所述的人類耳聾GJB3基因突變GJB3-M2為人類耳聾GJB3基因的第二外顯子的第547堿基由G變成>A。
11.一種用于人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M1篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R,其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.24或SEQID N0.25 所示的 DNA 序列；Primer-R 為序列表中 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ IDN0.28和SEQ ID N0.29中的任一個(gè)所示的DNA序列； 所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.60、SEQ IDN0.61和SEQ ID N0.62中的任一個(gè)所示的DNA序列；Probe_2為序列表中SEQ ID N0.63所不的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M1為人類耳聾SLC26A4基因的IVS7-2A>G0
12.權(quán)利要求11所述的用于人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M1篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:樣品的DNA提??； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOX PCR緩沖液SnLMgCIi5,0~MIOmmoldNTPs0.8 ~ LSmmol` Primcr-F0.1 ~1.Ομηιο? Primer-R0.1 — 1.Ομηιο IProbe-10,5 ~ 1.ΟμηιοIProbe-20.5 ~】Λμηιο I Taqjfi2,0 ~3.0 U
DNA40~60ng
_水至50μ[ PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.24 或 SEQ ID N0.25 所示的 DNA序列；Primer-R為序列表中 SEQ ID N0.26,SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28 和 SEQ ID N0.29 中的任一個(gè)所示的 DNA 序列；Probe-l 為序列表中 SEQ ID N0.60,SEQ ID N0.61 和 SEQ ID N0.62 中的任一個(gè)所示的DNA序列；Probe-2為序列表中SEQ ID N0.63所示的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到SLC26A4基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定: 根據(jù)步驟3得到的SLC26A4基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB3基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M1純合突變；如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M1野生型；如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M1雜合突變； 其中，所述的人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M1為人類耳聾SLC26A4基因的IVS7-2A>G0
13.—種用于人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M2篩查的引物和探針，其特征在于，所述的引物和探針如下: 所述的引物為Primer-F和Primer-R，其中Primer-F為序列表中SEQ ID N0.30、SEQ IDN0.31和SEQ ID N0.32中的任一個(gè)所示的DNA序列；Primer_R為序列表中SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36 和 SEQ ID N0.37 中的任一個(gè)所示的 DNA 序列； 所述的探針為Probe-1和Probe-2，其中Probe-1為序列表中SEQ ID N0.64、SEQ IDN0.65、SEQ ID N0.66和SEQ ID N0.67中的任一個(gè)所示的DNA序列；Probe_2為序列表中SEQ ID N0.68所示的DNA序列； 其中，所述的人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M2為人類耳聾SLC26A4基因的第十九外顯子的第2168堿基由A變成G。
14.權(quán)利要求13所述的用于人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M2篩查的引物和探針的使用方法，其特征在于，包括如下步驟:· 步驟1:樣品的DNA提??； 步驟2:熒光PCR擴(kuò)增: PCR體系如下:
IOXPCR緩沖液5pLMgCb5,0 ~l0.0mmoldNTPsOJ ~ 1.Smmo I Prinier-FO,卜 1.0 μηιο I Primcr-RCU ~ I ,Ομηιο?Probc-10,5 ~I.0 μηιο IProbe-20,5 ~ 1.Ομηιο I Taq _2,0~3.0 U
DNA40 ~60r?g
加水.個(gè):SOpL PCR反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)； 其中，Primer-F 為序列表中 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31 和 SEQ ID N0.32 中的任一個(gè)所示的DNA序列;Primer-R為序列表中 SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQID N0.36和SEQ ID N0.37中的任一個(gè)所示的DNA序列；Probe_l為序列表中SEQ ID N0.64、SEQ ID N0.65、SEQ ID N0.66 和 SEQ ID N0.67 中的任一個(gè)所示的 DNA 序列；Probe_2 為序列表中SEQ ID N0.68所示的DNA序列； 步驟3:檢測: 采用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀于每個(gè)循環(huán)步驟的退火階段檢測FAM和HEX熒光信號(hào)，得到SLC26A4基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線； 步驟4:結(jié)果判定: 根據(jù)步驟3得到的SLC26A4基因的FAM信號(hào)和HEX信號(hào)擴(kuò)增曲線，判斷樣品提供者的GJB3基因突變情況: 如果樣品孔只有FAM信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M2純合突變；如果樣品孔只有HEX信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M2野生型；如果樣品孔同時(shí)有FAM信號(hào)和HEX信號(hào)，表明樣品提供者的SLC26A4基因?yàn)镾LC26A4-M2雜合突變； 其中，所述的人類耳聾SLC26A4基因突變SLC26A4-M2為人類耳聾SLC26A4基因的第十九外顯子的第2168堿基由·A變成G。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103849682SQ201410027023
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】曾驥孟, 莊建立, 劉斌, 賴金嬌 申請(qǐng)人:芮寶生物醫(yī)藥科技（廈門）有限公司