熒光定量pcr檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒及方法，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括具有如下核苷酸序列的引物對和Taqman探針：上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，Taqman探針:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。本發(fā)明提供的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，能夠快速、有效地檢測8個型肉毒桿菌，所述檢測方法準(zhǔn)確性、特異性和敏感性高，穩(wěn)定性好，可實(shí)現(xiàn)對待測樣品如食品、血液及組織樣品的快速診斷和有效檢測。
【專利說明】熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肉毒桿菌是一種生長在缺氧環(huán)境下的細(xì)菌，在罐裝食品及密封腌潰食物中具有極強(qiáng)的生存能力，攝食含肉毒桿菌的食品可引發(fā)食物中毒。肉毒桿菌是一種致命病菌，它在繁殖過程中分泌的毒素是毒性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)之一。人們食入和吸收這種毒素后，神經(jīng)系統(tǒng)將遭到破壞，出現(xiàn)頭暈、呼吸困難和肌肉乏力等癥狀。根據(jù)抗原性的不同，肉毒桿菌可分為8個型，分別是A、B、Ca、⑶、D、E、F和G型。其中A、B、E、F和G型主要引發(fā)人類發(fā)病，C a、
、D主要引發(fā)動物發(fā)病。
[0003]目前檢測肉毒桿菌所采用的方法主要還是傳統(tǒng)常規(guī)的分離鑒定法、Elisa方法及普通PCR檢測。傳統(tǒng)常規(guī)的分離鑒定法，操作煩瑣、耗時長、漏診率高；ELISA方法相對簡便、快速，但對于微量或雜質(zhì)較多的樣品，其特異性和靈敏度較低，可能造成漏診或誤診。PCR作為一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，自誕生以來，由于它的特異性、敏感性高，能在短時間內(nèi)得到大量的目的片段，使之成為當(dāng)今發(fā)明研究的重要手段之一。但常規(guī)的PCR在操作中容易造成污染，假陽性較高，使之在診斷上受到一些限制。因此，有必要建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確度高的肉毒桿菌檢測方法。
[0004]定量檢測技術(shù)-實(shí)時熒光定量PCR (Real-time PCR, qPCR)，該方法與傳統(tǒng)方法不同，它的優(yōu)點(diǎn):一是單管封閉操作，有效解決了 PCR污染問題；二是自動化程度高；三是特異性更強(qiáng)；四是PCR反應(yīng)的實(shí)時監(jiān)控。有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果；五是絕對定量，由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行絕對定量測定。SYBRGreen染料法已是較完善的檢測體系，且反應(yīng)體系中SYBRGreen染料的使用濃度亦不用進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，整個檢測體系簡單易行，但用SYBRGreen染料法進(jìn)行Real_timePCR也存在著一定的弊端，如結(jié)果需要進(jìn)行熔解曲線分析，特別是進(jìn)行多重基因檢測或引物質(zhì)量不好時，其擴(kuò)增的原始圖則不能直觀反映真實(shí)的擴(kuò)增效率，必需經(jīng)熔解曲線分析來確定最終的發(fā)明結(jié)果。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)自產(chǎn)生以來，不斷發(fā)展完善，到目前為止已經(jīng)非常成熟了。標(biāo)記方法由最初單一的染料法，發(fā)展到了特異性更高的探針法，如Taqman、Molecular Beacon等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，使其能夠快速、有效地檢測8個型肉毒桿菌，準(zhǔn)確性、特異性和敏感性高，穩(wěn)定性好，實(shí)現(xiàn)對待測樣品如食品、血液及組織樣品的快速診斷和有效檢測。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:[0007]熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括具有如下核苷酸序列的引物對和Taqman探針:
[0008]上游引物:5，-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3，，
[0009]下游引物:5’ -CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3 ’，
[0010]Taqman 探針:5，-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3，。
[0011]進(jìn)一步地,所述Taqman探針的核苷酸序列的3’端標(biāo)記MGB突光淬滅基團(tuán)。
[0012]進(jìn)一步地,所述Taqman探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記HEX或FAM突光報告基團(tuán)。
[0013]進(jìn)一步地,所述PCR反應(yīng)液還包括2 X Premix EX Taq0
[0014]進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陽性對照、陰性對照，所述陽性對照為肉毒桿菌基因組 DNA。
[0015]本發(fā)明的另一個目的是提供熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，可快速地檢測8個型肉毒桿菌，且準(zhǔn)確性、特異性和敏感性較高。采用如下技術(shù)方案:
[0016]熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針進(jìn)行熒光定量PCR:
[0017]上游引物:5’ -TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3 ’，
[0018]下游引物:5’ -CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3 ’，
[0019]Taqman 探針:5，-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3 ’。
[0020]進(jìn)一步地，所述Taqman探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記HEX報告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記MGB淬滅熒光基團(tuán)。
[0021]進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，包括:上游引物0.4μ I ;下游引物 0.4 μ I ；Taqman 探針 0.8 μ I ;檢測樣品 DNAl μ I ;2 XPremix EX Taq 10 μ 1，余量為滅菌
去離子水。
[0022]進(jìn)一步地，所述20 μ I的熒光定量PCR反應(yīng)體系還包括:50 X ROX Reference DyeI /11 0.4 μ I。
[0023]進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C 30s,為第一步循環(huán)；95°C 5s，60°C 34s，為第二步40個循環(huán)，所述第二步每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測。
[0024]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0025](1)本發(fā)明根據(jù)國家疾病控制中心標(biāo)準(zhǔn)毒株(⑶C54096)的保守序列設(shè)計通用型引物，合成特異性引物及Taqman-MGB探針，采用熒光定量PCR方法快速靈敏地檢測8個型肉毒桿菌，且準(zhǔn)確性、特異性和敏感性高，穩(wěn)定性好，可實(shí)現(xiàn)對待測樣品如食品、血液及組織樣品的快速診斷和有效檢測。
[0026](2)本發(fā)明一方面采用了高拷貝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探針熒光定量PCR檢測法，使得利用Taqman-MGB探針法熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的靈敏度約是普通PCR 的 100 倍。
[0027](3)由于采用定量檢測技術(shù)-Taqman-MGB熒光定量PCR (Real-time PCR)，該方法(Real-time PCR)具有單管封閉操作防污染、自動化程度高、特異性強(qiáng)、可實(shí)時監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，有效地解決了傳統(tǒng)方法只能終點(diǎn)檢測的局限。
[0028](4)由于探針的3’端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報告基團(tuán)在空間上的位置更接近，實(shí)驗(yàn)靈敏度更高，特異性更強(qiáng)。[0029](5)Taqman-MGB探針法熒光定量PCR方法簡便、快速，整個過程(包括加樣)可在一個小時內(nèi)完成，計算機(jī)自動報告結(jié)果，無需電泳及其他后續(xù)的工作，即方便了操作又減少了污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]上述僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，以下結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0031]圖1是檢測肉毒桿菌的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0032]圖2是肉毒桿菌Taqman-MGB探針法熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果；圖中，1:肉毒桿菌；2:滅菌的去離子水；3:大腸桿菌；4:單增李斯特菌；5:志賀氏菌。
[0033]圖3是肉毒桿菌Taqman-MGB探針法熒光定量PCR的敏感性檢測結(jié)果；圖中，I:IX 105CFU/mL ；2:1X 104CFU/mL ；3:1X 103CFU/mL ；4:1X 102CFU/mL ；5:1 X IO1CFUZmL ；6:
IX 10°CFU/mL ；7:陰性樣品(滅菌的去離子水)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]除非特別指明，以下實(shí)施例中所用菌株由北京億森寶生物科技有限公司分離保存。
[0035]除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商購獲得。
[0036]實(shí)施例1熒光定暈PCR檢測肉毒桿菌的方法
[0037]1、設(shè)計引物和Taqman-MGB探針
[0038]根據(jù)國家疾病控制中心標(biāo)準(zhǔn)毒株(⑶C54096)的部分序列，通過DNAstar軟件進(jìn)行序列比對，找出肉毒桿菌基因序列的特異性保守序列。運(yùn)用Primer Primer 5.0軟件進(jìn)行引物和探針的設(shè)計。得到多對特異性引物和探針，經(jīng)過比對篩選，最終確定一組最佳引物和一條Taqman-MGB探針，目的片段為143bp，其核苷酸序列為序列表中序列4。
[0039]上游引物(BL-F):5，-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3，；
[0040]下游引物(BL-R):5，-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3，；
[0041]探針(BL-Taqman-MGB):5，-HEX-ACCTAATAGTATGTTGAATC-MGB-3，。
[0042]其中探針的5’端標(biāo)記HEX報告熒光基團(tuán)，熒光探針的3’端標(biāo)記MGB淬滅熒光基團(tuán)。其中，報告熒光基團(tuán)也可以選擇FAM等其他基團(tuán)。猝滅熒光基團(tuán)選擇MGB的原因在于，TaqMan-MGB探針與傳統(tǒng)的TaqMan-TAMRA探針比較具有以下優(yōu)勢:(I)提高TM值一平均15bases可提高18°C，這樣可以使探針的長度縮短，尤其對AT含量高的序列設(shè)計有很大的幫助，并且提高配對與非配對模板間的TM值差異。(2)提高信噪比一由于在探針的3’端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報告基團(tuán)在空間的位置更接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確，分辨率更高。
[0043]2、肉毒桿菌基因組DNA提取
[0044]利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，貨號DP302)提取肉毒桿菌的基因組DNA。放置于_20°C備用。
[0045]3、熒光定量PCR擴(kuò)增:[0046]按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行Taqman-MGB探針法熒光定量PCR:
[0047]
試劑使用量
上游特異引物BL-F0.4 u I
下游特異弓丨物BL-R0.4 μ?
IX Premix EX Taq (寶生物工程大連有限公司,10 μ I
貨號RR390 )
熒光探針引物BL-Taqraaη-MGBO, 8 μ I
50X ROX Reference Dye I / II0.4 μ I
DNA模板(檢測樣品)I μ?
[0048]
滅菌去離予水7 P I
[0049]將一定量的檢測樣品的DNA模板加入PCR管中，放置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。同時分別設(shè)置陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為肉毒桿菌基因組DNA，陰性對照為滅菌的去離子水。
[0050]熒光定量PCR反應(yīng)條件如下:95°C 30s，為第一步循環(huán)；95°C 5s，60°C 34s，為第二步40個循環(huán)。第二步每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，結(jié)果顯示肉毒桿菌基因組DNA使用熒光定量PCR檢測為陽性擴(kuò)增，Ct值為19.55，有S形擴(kuò)增曲線。陰性樣品則無擴(kuò)增曲線。從擴(kuò)增曲線上可以看到，在擴(kuò)增的前期，特別是在熒光臨界值(threshold)附近，曲線重合性較好。
[0052]實(shí)施例2、熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法的特異件和敏感件驗(yàn)證
[0053]1、特異性驗(yàn)證
[0054]肉毒桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、志賀氏菌菌液在胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基中，置26°C培養(yǎng)3-5天后，提取菌液基因組DNA。將提取的肉毒桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、志賀氏菌菌液基因組DNA作為模板，滅菌去離子水作為陰性對照，進(jìn)行Taqman探針法熒光定量PCR反應(yīng)，記錄結(jié)果。結(jié)果如圖2所示，肉毒桿菌DNA模板在20.08Ct處有擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線呈S形，大腸桿菌、單增李斯特菌、志賀氏菌DNA模板以及陰性對照樣品無非特異性擴(kuò)增。所得結(jié)果與預(yù)期完全吻合。
[0055]2、敏感性驗(yàn)證
[0056]肉毒桿菌菌液在胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基中，置26°C培養(yǎng)3-5天后，進(jìn)行菌落計數(shù)，然后將濃度為I X 105CFU/mL的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋。提取各梯度濃度菌液的基因組DNA作為模板，無菌水作為陰性對照，進(jìn)行Taqman探針法熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，20 μ I反應(yīng)體系中 ，最低檢測下線為27.61CFU/mL，如圖3所示，在最佳反應(yīng)條件下，最低檢測限IX 102CFU/mL的基因組DNA起始模板的Ct值大約為27.61，因此反應(yīng)循環(huán)數(shù)40可大大滿足最低檢測要求。從不同濃度起始模板的擴(kuò)增曲線可以看出，S曲線基線平整，指數(shù)區(qū)明顯，斜率較大，這些均說明在該條件下模板的擴(kuò)增是較為理想的。
[0057]實(shí)施例3:熒光定暈PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒的制備及檢測
[0058]1、試劑盒的制備:
[0059]配制如下試劑并保存。
[0060]試劑1:肉毒桿菌熒光PCR反應(yīng)液ImL ；
【權(quán)利要求】
1.熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括具有如下核苷酸序列的引物對和Taqman探針:
上游引物:5 ’ -TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3 ’， 下游引物:5’ -CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman 探針:5’ -ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，其特征在于，所述Taqman探針的核苷酸序列的3’端標(biāo)記MGB熒光淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，其特征在于，所述Taqman探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記HEX或FAM熒光報告基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括2 X Premix EX Taq0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的通用型試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照、陰性對照，所述陽性對照為肉毒桿菌基因組DNA。
6.熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針進(jìn)行熒光定量PCR: 上游引物:5’ -TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’， 下游引物:5’ -CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman 探針:5’ -ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。`
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，其特征在于，所述Taqman探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記HEX報告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記MGB淬滅熒光基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，包括:上游引物0.4μ I ;下游引物0.4μ I ; Taqman探針0.8μ I ；檢測樣品DNAl μ I ；2XPremix EX TaqlO μ I,余量為滅菌去離子水。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，其特征在于，所述20μ I的熒光定量PCR反應(yīng)體系還包括:50XROX Reference Dye I / II 0.4μ L.
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光定量PCR檢測肉毒桿菌的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C 30s，為第一步循環(huán)；95°C 5s, 60°C 34s，為第二步40個循環(huán)，所述第二步每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740839SQ201410026867
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】高珊珊, 孫曉明, 王新杰 申請人:北京億森寶生物科技有限公司