I型登革病毒kmb17細(xì)胞適應(yīng)株的培育及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株及其制備方法，能將流行的I型登革病毒株適應(yīng)于人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上生長，獲得在KMB17細(xì)胞上穩(wěn)定傳代且病毒復(fù)制能力較強(qiáng)的細(xì)胞適應(yīng)株，經(jīng)過多次噬斑純化的方法獲得純度較高的純化適應(yīng)株。經(jīng)對病毒進(jìn)行系列鑒定，I型登革病毒純化株保持了較好的抗原性以及原始毒株的基本生物學(xué)特性。通過本發(fā)明使I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株能夠以人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17為基質(zhì)，進(jìn)行I型登革病毒擴(kuò)增，打破了I型登革病毒宿主細(xì)胞的局限性，為加快登革病毒預(yù)防性疫苗的研發(fā)開拓新的思路，為I型登革病毒滅活和減毒活疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時也具備大規(guī)模生產(chǎn)的可行性。
【專利說明】I型登革病毒KMB1 7細(xì)胞適應(yīng)株的培育及其制備方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種病毒株的制備方法，具體涉及I型登革病毒在KMB17細(xì)胞上的適應(yīng)株的分離、篩選、選育、純化以及培養(yǎng)方法，屬于病毒疫苗制造【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0003]登革病毒經(jīng)埃及伊蚊和白紋伊蚊等蟲媒傳播，廣泛流行于熱帶和亞熱帶國家及地區(qū)，可引起登革熱、登革出血熱及登革出血休克征。依抗原性不同可將登革病毒分為1、1、m、iv四個血清型。近年來，由于全球氣候變暖、人口流動頻繁等因素，登革熱在全世界的發(fā)病率提高了近30倍，在過去兩年中全球登革熱感染人群的數(shù)量持續(xù)增長。登革熱是過去50年間世界上最為嚴(yán)重的傳染病之一，已經(jīng)成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題。登革熱不僅嚴(yán)重危害人民的健康，而且還為國家和個人帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于還沒有可供使用的登革熱疫苗用于預(yù)防，登革熱的防控形式日趨嚴(yán)峻，因此登革熱疫苗相關(guān)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究是一項迫在眉睫的任務(wù)。但是由于登革熱病毒宿主細(xì)胞局限的，所以迄今為止全球仍沒有獲準(zhǔn)上市的登革病毒疫苗，因此登革疫苗研發(fā)迫在眉睫。目前最有潛力的傳統(tǒng)減毒活疫苗候選株是由泰國沃特瑞德研究所研發(fā)的以犬腎細(xì)胞和恒河猴胚肺細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗，VeiX)細(xì)胞也被認(rèn)為是疫苗開發(fā)的候選基質(zhì)，以人源性細(xì)胞制備的登革疫苗候選株還未見報道。因此研究登革病毒在人源性細(xì)胞上的適應(yīng)性對于登革病毒疫苗的研發(fā)具有重要意義。
[0004]現(xiàn)有的滅活和減毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性細(xì)胞為基質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的，其殘余DNA存在潛在的致病危險，目前普遍認(rèn)為比較安全且免疫效果好的，仍然是用人源性細(xì)胞基質(zhì)(如KMB17細(xì)胞)生產(chǎn)的疫苗，自從Hayflick等首次建立二倍體細(xì)胞株后，近三十多年來，人二倍體細(xì)胞的研究在國際上有很大的發(fā)展，在病毒學(xué)，細(xì)胞學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)等方面研究工作中已被廣泛的應(yīng)用，尤其在生產(chǎn)病毒疫苗等方面，提供了安全、實用的良好細(xì)胞。而以人源性細(xì)胞基質(zhì)制備的登革疫苗候選株目前尚未見報道。因此，研究登革熱病毒在人源性細(xì)胞上的適應(yīng)性，對于登革疫苗的研發(fā)具有重要意義。
[0005]人胚肺二倍體細(xì)胞系KMB17為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所建立、可用于疫苗生產(chǎn)的人源細(xì)胞。人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17用于人用疫苗具有很多優(yōu)點:無致癌性，且安全性高于其它細(xì)胞，易于規(guī)?；a(chǎn)，而且對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗，還可克服使用原代細(xì)胞時在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，作為人源性細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)人用疫苗時，引入的外源因子較少，比動物來源的細(xì)胞基質(zhì)具有更好的安全性，是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì)，且能穩(wěn)定實現(xiàn)大規(guī)模疫苗生產(chǎn)。人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17，已經(jīng)成功應(yīng)用于甲肝疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗的生產(chǎn)，其安全性和細(xì)胞穩(wěn)定性都得到了廣泛驗證，但目前還沒有成功應(yīng)用于I型登革病毒中國株的報導(dǎo)。
[0006]本專利技術(shù)將近年來流行于我國的I型登革病毒分離株在C6/36細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定，隨后在KMB17細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，優(yōu)化及建立了 I型登革病毒在KMB17細(xì)胞上培養(yǎng)方法。選育出了能穩(wěn)定傳代且病毒擴(kuò)增量高的細(xì)胞適應(yīng)株，經(jīng)噬斑純化獲得毒力較強(qiáng)、純度較高的純化株，經(jīng)鑒定病毒純化株保持了原始毒株的基本生物學(xué)特性，且具有較好的抗原性。通過本專利技術(shù)可以證實以KMB17細(xì)胞為基質(zhì)進(jìn)行登革病毒擴(kuò)增和疫苗研究具有可行性，打破了登革病毒宿主細(xì)胞的單一性、局限性，具備大規(guī)模生產(chǎn)的可行性，為研發(fā)具有我國地域特色的預(yù)防性登革病毒疫苗開拓新的思路，為研發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的登革病毒滅活和減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)，此疫苗的研發(fā)將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株及其制備方法，為將人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17應(yīng)用于I型登革病毒疫苗的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
[0008]本發(fā)明提供的I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株通過下列步驟獲得:
1)、按Iml病毒液/瓶的量，將濃度為4.0 MOI的I型登革病毒液接種到生長致密、透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為33土0.5°C，C02體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第五天時，于相同環(huán)境條件下，按3.5%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)9-10天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE達(dá)++++時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，于4°C 3500 Xg離心10分鐘，收集上清，獲得病毒液；
2)、將步驟I)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，控制病毒濃度為4.0 Μ0Ι，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3. 5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03，1%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比的抗生素，在溫度為33土0.5V，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第五天時，于相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)9-10天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE達(dá)++++時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，于4°C 3500 Xg離心10分鐘，收集上清，獲得病毒液；如此反復(fù)連續(xù)傳代培養(yǎng)三代以上，直至獲得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液；
3)、按Iml病毒液/瓶的量，將步驟2)所得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液，接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，并控制病毒濃度為4.0 Μ0Ι，按I: 9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為35+0.5°C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第三天時，在相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C凍融3次，收集細(xì)胞液，4°C 3500 Xg離心10分鐘，無菌條件下收集上清，獲得病毒液并于-70°C下保存；
4)、將步驟3)獲得的病毒液反復(fù)凍融2次，于4°C，3500Xg離心分離lOmin，收獲上清，得病毒液；將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量，接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為35±0.5°C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第三天時，于相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C凍融3次，收集細(xì)胞液，40C 3500Xg離心10分鐘，無菌條件下收集上清，獲得病毒液，如此反復(fù)連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以上，至KMB17細(xì)胞CPE達(dá)++++時，即篩選出能在KMB17上穩(wěn)定傳代增值的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株；
5)用KMB17細(xì)胞對步驟4)篩選出的能在KMB17上穩(wěn)定傳代增值的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行下列噬斑篩選純化:棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細(xì)胞的培養(yǎng)液，用Hanks液漂洗2次；在不含血清的下列維持液中:MEM培養(yǎng)基+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，將步驟4)篩選出的能在KMB17上穩(wěn)定傳代增值的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株稀釋至4.0MOI濃度后，接種KMB17細(xì)胞，置37土0.5 °C孵育4h，每隔15min輕輕水平晃動培養(yǎng)板數(shù)次，以保證病毒與細(xì)胞充分接觸；吸附完畢后吸出病毒液，加ImL含有0.1 %體積比的中性紅及5%體積比的胎牛血清的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基，于37土0.5°C, CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；2天后每天觀察2次，記錄蝕斑出現(xiàn)和生長情況，直至大小適宜時，吸取斑點，以維持液稀釋后接種96孔板，收集病變孔的培養(yǎng)液；如此進(jìn)行3輪噬斑純化；通過實驗，3輪噬斑純化均在3天后出現(xiàn)微小斑點，至5-6天斑點直徑長至約8-lOum，篩選出I型登革病毒適應(yīng)株；此毒株即為能在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖的純化I型登革病毒適應(yīng)株；
6)將步驟5)收獲的純化I型登革病毒適應(yīng)株按照步驟4)在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖、分裝，于-70°C下長期保存，備用。
[0009]所述每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7X 106。
[0010]所述步驟I)的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36經(jīng)過下列傳代培養(yǎng):按常規(guī)在細(xì)胞中加入下列細(xì)胞生長液:MEM培養(yǎng)基加10%(w/v)小牛血清；放置于溫度為33±0.5°C，二氧化碳體積濃度為5% (v/v)的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天換液一次，培養(yǎng)4-5天細(xì)胞長成形態(tài)良好致密
單層。`
[0011]所述步驟3)的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17經(jīng)過下列培養(yǎng):按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對KMB17細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所用細(xì)胞生長液為MEM培養(yǎng)液加10% (w/v)小牛血清，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層。
[0012]通過本發(fā)明能將流行的I型登革病毒株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上適應(yīng)，從而得到能穩(wěn)定傳代且病毒擴(kuò)增量高的細(xì)胞適應(yīng)株，經(jīng)噬斑純化獲得毒力較強(qiáng)、純度較高的純化株，經(jīng)鑒定，該病毒純化株保持了原始毒株的基本生物學(xué)特性，且具有較好的抗原性。能夠以人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17為基質(zhì)，進(jìn)行I型登革病毒擴(kuò)增，打破了 I型登革病毒宿主細(xì)胞的局限性，為具有我國地域特色的預(yù)防性登革病毒疫苗的研發(fā)開拓新的思路，為研發(fā)I型登革病毒滅活和減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)，同時也具備大規(guī)模生產(chǎn)的可行性，此疫苗的研發(fā)將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為正常KMB17細(xì)胞(顯微鏡放大40倍)；
圖2為登革病毒感染KMB17細(xì)胞后的細(xì)胞病變(CPE)(顯微鏡放大40倍)；
圖3為不同條件下I型登革病毒中國株感染KMB17細(xì)胞的感染性滴度；
圖4為I型登革病毒中國株I~10代的感染性滴度；
圖5為正常KMB17細(xì)胞的免疫熒光觀察(X 100);圖6為I型登革病毒中國株感染KMB17細(xì)胞的免疫熒光觀察(X 100)；
圖7為登革病毒特異基因片段；
圖8為I型登革病毒特異基因片段；
圖9為透射電鏡觀察純化的登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株；
圖10為Real-time PCR檢測I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株在KMB17細(xì)胞中增殖后病毒基因的擴(kuò)增曲線；
圖11為Real-time PCR檢測I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株在KMB17細(xì)胞中增殖后病毒基因的溶解曲線。
【具體實施方式】[0014]下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0015]實施例1
1)、白紋伊蚊細(xì)胞C6/36經(jīng)過下列傳代培養(yǎng):按常規(guī)在細(xì)胞中加入下列細(xì)胞生長液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比(W/V)的胎牛血清+3.5%體積比(W/V)的體積濃度為7%的NaHC03，1%體積比(W/V)的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比(W/V)的抗生素；放置于溫度為33±0.5°C，二氧化碳體積濃度為5% (v/v)的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天換液一次，培養(yǎng)4-5天細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層；
2)、按Iml病毒液/瓶的量，每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7父106，將病毒濃度為4.0MOI的I型登革病毒液接種到步驟I)的生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，于溫度為33土0.50C XO2體積濃度為5% (v/v)的環(huán)境中，恒溫吸附I小時，于相同環(huán)境中，按1:9的體積比，補(bǔ)加下列病毒維持液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比(W/V)的胎牛血清+3.5%體積比(W/V)的體積濃度為7%的NaHC03，1%體積比(W/V)的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比(W/V)的抗生素，培養(yǎng)至第5天，于相同環(huán)境中，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第8天，當(dāng)白紋伊蚊細(xì)胞C6/36病變CPE達(dá)++++時，收集細(xì)胞液，于4°C，3500 Xg離心分離lOmin，收獲上清，即得病毒液；
3)、按Iml病毒液/瓶的量，將病毒濃度為4.0 MOI的步驟2)所得病毒液，接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7X106，于溫度為33土0.50CXO2體積濃度為5% (v/v)的環(huán)境中，恒溫吸附I小時，于相同環(huán)境中，按1:9的體積比，補(bǔ)加下列病毒維持液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比(W/V)的胎牛血清+3.5%體積比(W/V)的體積濃度為7%的NaHC03，1%體積比(W/V)的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比(W/V)的抗生素，培養(yǎng)至第5天，于相同環(huán)境中，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第8天，當(dāng)白紋伊蚊細(xì)胞C6/36病變CPE達(dá)++++時，收集細(xì)胞液，于4°C，3500 Xg離心分離lOmin，收獲上清，即得病毒液；如此連續(xù)傳代培養(yǎng)三代，獲得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液；
4)、人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17經(jīng)過下列培養(yǎng):按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對KMB17細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所用細(xì)胞生長液為MEM培養(yǎng)液+10%體積比(W/V)的小牛血清，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層；
5)、按Iml病毒液/瓶的量，將病毒濃度為4.0 MOI的步驟3)所得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液，接種到步驟4)的鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7X106,同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液:MEM培養(yǎng)基+ 5%體積比(W/V)的小牛血清+ 2%體積比(W/V)的體積濃度為6% (v/v)的碳酸氫鈉，于溫度為35±0.50C、CO2體積濃度為5%體積比(v/v)的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)至第3天，于相同環(huán)境下，按2%的體積比補(bǔ)加濃度為7% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第7天，當(dāng)人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17出現(xiàn)CPE時，收獲已出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE的病毒液，并于_70°C下保存；
6)、將步驟5)的病毒液反復(fù)凍融2次，于4°C，3500 X g離心分離lOmin，收獲上清，得病毒液，將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7X 106，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液=MEM培養(yǎng)基+5%體積比(W/V)的胎牛血清+3.5%體積比(W/V)的體積濃度為7%的NaHC03,1%體積比(W/V)的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比(W/V)的抗生素，于溫度為35土0.5°C、CO2體積濃度為5% (v/v)的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)至第4天，于相同環(huán)境下，按2%的體積比補(bǔ)加濃度為7% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17病變CPE達(dá)++++時，獲得能夠在KMB17細(xì)胞上增殖的登革病毒毒種，并于_70°C下保存；如此連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，獲得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上適應(yīng)的I型登革病毒適應(yīng)株。 [0016]7) I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株在KMB17細(xì)胞中的噬斑純化，利用KMB17細(xì)胞對選育出的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行噬斑篩選純化:棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細(xì)胞的培養(yǎng)液，用Hanks液漂洗2次；隨后用不含血清的下列維持液:MEM培養(yǎng)基+3.5%體積比(W/V)的體積濃度為7%的NaHC03 + 1%體積比(W/V)的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比(W/V)的抗生素，將病毒稀釋后以4.0MOI濃度接種KMB17細(xì)胞，置35土0.5 °C孵育4h，每隔15min輕輕水平晃動培養(yǎng)板數(shù)次，以保證病毒與細(xì)胞充分接觸；吸附完畢后吸出病毒液，加ImL含0.1 %體積比中性紅及5%體積比胎牛血清的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基，倒置于35土0.5 V, CO2體積濃度為5 %的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2天之后每天觀察2次，記錄蝕斑出現(xiàn)和生長情況，直至大小適宜時吸取斑點，以維持液稀釋后接種96孔板，收集病變孔的培養(yǎng)液，以上述方法進(jìn)行3輪噬斑純化。通過實驗，3輪噬斑純化均在3天后出現(xiàn)微小斑點，至5-6天斑點直徑長至約8-lOum，以此方法篩選出I型登革病毒適應(yīng)株，此毒株即為能在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖的純化的I型登革病毒適應(yīng)株。
[0017]8)將上述收獲的純化I型登革病毒適應(yīng)株按照步驟6的方法在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖、分裝，于_70°C下長期保存?zhèn)溆谩?br> [0018]登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株毒種檢測:
I)病毒滴定檢測
采用微量滴定法測定每代病毒液感染性滴度，檢測結(jié)果顯示，I型登革病毒中國株在KMB17細(xì)胞上連續(xù)傳代10代，病毒滴度呈持續(xù)升高直至穩(wěn)定的適應(yīng)過程，傳第1、2代最低，細(xì)胞無明顯病變，傳至第3代時，細(xì)胞開始有明顯病變，病毒的感染滴度達(dá)到3.0OlgCCID50/ml，至第9、10代滴度最高，達(dá)到5.0 lgCCID50/ml。病毒通過10代連續(xù)傳代，選育出良好的KMB17細(xì)胞適應(yīng)株。
[0019]2)病毒的純化和電鏡檢測
在KMB17細(xì)胞中大量培養(yǎng)擴(kuò)增病毒，將收獲的病毒液以4°C，8000rpm*15min離心后取上清液，加入PEG6000至終濃度為8%，4°C搖晃18h后，4°C，12000rpm*30min離心并棄掉上清液，沉淀以原體積1/30的0.01mol/L PBS液進(jìn)行溶解，隨后以12000rpm*15min離心并取上清液，上清液置于蔗糖墊最上層，通過蔗糖密度梯度離心法純化病毒，再經(jīng)過38000rpm*2h超速離心并棄上清，沉淀以原體積1/100的0.01mol/L PBS液進(jìn)行溶解并收集，最終獲得濃縮的純化病毒。經(jīng)濃縮純化后收獲到體積濃縮100倍的病毒液。
[0020]3)登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株毒種鑒定
(I)登革病毒的免疫熒光檢測
用免疫熒光法檢測I型登革病毒純化株抗原性。以KMB17細(xì)胞接種放有玻片的6孔板，長至單層后，其中4孔細(xì)胞接種IOOul/孔(2.0MOIH型登革病毒，2孔作陰性對照，用含5%血清MEM培養(yǎng)基于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。在種毒后第72小時取出孔里的玻片進(jìn)行熒光染色。一抗為I型登革病毒抗血清，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗人IgG。
[0021]I型登革病毒中國株在KMB17細(xì)胞上傳代10代后，以I型登革病毒抗血清進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示，在接種病毒的細(xì)胞內(nèi)可見明亮的綠色熒光，而對照組細(xì)胞內(nèi)未見綠色熒光，表明選育出的適應(yīng)株在KMB17細(xì)胞中可以增殖并具有良好的抗原性。
[0022](2) RT-PCR擴(kuò)增登革病毒特異性基因
將收獲的I型登革病毒液接種KMB17細(xì)胞后72小時，裂解細(xì)胞提取總RNA，根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)行的《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》中所述的“RT-PCR技術(shù)檢測登革病毒RNA及型別鑒定”方法，合成登革病毒通用檢測引物D1、D2及登革病毒型特異性引物TS1，通過RT-PCR對I型登革病毒特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:50°C 30分鐘合成cDNA ;94°C預(yù)變性2分鐘；然后以94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸I分鐘條件進(jìn)行PCR循環(huán)，共35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。引物序列見表1:經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，分別獲得511bp的登革病毒特異基因片段和482bp的I型登革病毒特異性片段。
[0023]表1登革病毒特異性引物
【權(quán)利要求】
1.一種I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于通過下列步驟獲得: 1)、按Iml病毒液/瓶的量，將濃度為4.0 MOI的I型登革病毒液接種到生長致密、透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為33土0.5°C，C02體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第五天時，于相同環(huán)境條件下，按3.5%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%w/v的NaHC03，培養(yǎng)9-10天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE達(dá)++++時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，于4°C 3500 Xg離心10分鐘，收集上清，獲得病毒液； 2)、將步驟I)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，控制病毒濃度為4.0 Μ0Ι，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03，1%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺，1%體積比的抗生素，在溫度為33土0.5V，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第五天時，于相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)9-10天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE達(dá)++++時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，于4°C 3500 Xg離心10分鐘，收集上清，獲得病毒液；如此反復(fù)連續(xù)傳代培養(yǎng)三代以上，直至獲得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液； 3)、按Iml病毒液/瓶的量，將步驟2)所得傳代穩(wěn)定的I型登革病毒液，接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，并控制病毒濃度為4.0 Μ0Ι，按I: 9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為35土0.5°C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第三天時，在相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C凍融3次， 收集細(xì)胞液，4°C 3500Xg離心10分鐘，無菌條件下收集上清，獲得病毒液并于-70°C下保存； 4)、將步驟3)獲得的病毒液反復(fù)凍融2次，于4°C，3500Xg離心分離lOmin，收獲上清，得病毒液；將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量，接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，按1:9的體積比補(bǔ)加下列培養(yǎng)液:MEM培養(yǎng)基+5%體積比的胎牛血清+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，在溫度為35土0.5°C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)至第三天時，于相同環(huán)境條件下，按2%的體積比補(bǔ)加體積濃度為7%的NaHC03，培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置_20°C凍融3次，收集細(xì)胞液，4°C 3500Xg離心10分鐘，無菌條件下收集上清，獲得病毒液，如此反復(fù)連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以上，至KMB17細(xì)胞CPE達(dá)++++時，即篩選出能在KMB17上穩(wěn)定傳代增值的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株； 5)用KMB17細(xì)胞對步驟4)篩選出的能在KMB17上穩(wěn)定傳代增值的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行下列噬斑篩選純化:棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細(xì)胞的培養(yǎng)液，用Hanks液漂洗2次；在不含血清的下列維持液中:MEM培養(yǎng)基+3.5%體積比的體積濃度為7%的NaHC03+l%體積比的體積濃度為3%的L-谷氨酰胺+1%體積比的抗生素，將步驟4)的I型登革病毒細(xì)胞適應(yīng)株稀釋至4.0MOI濃度后，接種KMB17細(xì)胞，置37±0.5 °C孵育4h，每隔15min輕輕水平晃動培養(yǎng)板數(shù)次，以保證病毒與細(xì)胞充分接觸；吸附完畢后吸出病毒液，加ImL含有0.1 %體積比的中性紅及5%體積比的胎牛血清的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基，于37±0.5°C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)；2天后每天觀察2次，記錄蝕斑出現(xiàn)和生長情況，直至大小適宜時，吸取斑點，以維持液稀釋后接種96孔板，收集病變孔的培養(yǎng)液；如此進(jìn)行3輪噬斑純化；通過實驗，3輪噬斑純化均在3天后出現(xiàn)微小斑點，至5-6天斑點直徑長至約8-10um，篩選出I型登革病毒適應(yīng)株；此毒株即為能在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖的純化I型登革病毒適應(yīng)株； 6)將步驟5)收獲的純化I型登革病毒適應(yīng)株按照步驟4)在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上增殖、分裝，于-70°C下長期保存，備用。
2.如權(quán)利要求1所述的I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述步驟3)的每瓶的細(xì)胞數(shù)量為I~1.7X106。
3.如權(quán)利要求1所述的I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述步驟I)的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36經(jīng)過下列傳代培養(yǎng):按常規(guī)在白紋伊蚊細(xì)胞中加入下列細(xì)胞生長液:MEM培養(yǎng)基+10%體積比的小牛血清；放置于溫度為33土0.50C，CO2體積濃度為5%的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天換液一次，培養(yǎng)4-5天細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層。
4.如權(quán)利要求1所述的I型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述步驟3)的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17經(jīng)過下列培養(yǎng):按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對KMB17細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所用細(xì)胞生長液為MEM培養(yǎng)液+10%體積比的小牛血清 ，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層。
【文檔編號】C12N7/02GK103695377SQ201310677684
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】孫強(qiáng)明, 趙玉嬌, 陳俊英, 潘玥, 黃新偉, 李多, 丁曉潔 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所