產(chǎn)糖苷酶的鏈霉菌及其在生物轉(zhuǎn)化制備葫蘆素b中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株糖苷酶產(chǎn)生菌——鏈霉菌（Streptomyces?sp.）RW-2，及其在生物轉(zhuǎn)化葫蘆素B-2-O-葡萄糖苷制備葫蘆素B中的應用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072，保藏編號：CCTCC?No：M2013330，保藏日期2013年7月17日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1）鏈霉菌是發(fā)酵工業(yè)中常用菌種，無毒無害，使用安全；（2）鏈霉菌RW-2營養(yǎng)要求簡單、生長迅速、容易培養(yǎng)；（3）鏈霉菌RW-2產(chǎn)生的糖苷酶為胞外酶，分離除去菌體，粗酶液或經(jīng)稀釋后，即可作為生物轉(zhuǎn)化體系，（4）從甜瓜蒂提取的總葫蘆素經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理后，其中的葫蘆素B-2-O-葡萄糖苷幾乎能全部轉(zhuǎn)化為葫蘆素B，葫蘆素B的含量可提高1～2.7倍。
【專利說明】產(chǎn)糖苷酶的鏈霉菌及其在生物轉(zhuǎn)化制備葫蘆素B中的應用
(一)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一株產(chǎn)糖苷酶的鏈霉菌及其在生物轉(zhuǎn)化制備葫蘆素B中的應用。
(二)【背景技術】
[0002]甜瓜蒂為葫蘆科一年生草質(zhì)藤本植物甜瓜(Cucumis melo)成熟后的干燥果柄，別名也叫瓜蒂、瓜丁、苦丁香，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為上品之藥，系《中國藥典》一部1977年版收載品種，味苦，性寒，入脾、胃經(jīng)。具有涌吐痰食、祛濕退黃之功?，F(xiàn)代臨床多用于治療食積不化，食物中毒，癲癇痰盛以及急、慢性肝炎和肝硬化等。
[0003]甜瓜蒂的藥效成分為葫蘆素(cucurbitacins)，葫蘆素是一類四環(huán)三萜類化合物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40余種，如葫蘆素B、葫蘆素D和葫蘆素E等，它們具有護肝消炎和抗腫瘤等多種生物學活性。在甜瓜蒂中，葫蘆素B占總葫蘆素的比例最高，并且活性最好，是抗肝炎、肝癌的最有效單體，對因濕熱毒盛所致遷延性肝炎、慢性肝炎及原發(fā)性肝癌有很好的輔助治療效果。
[0004]上世紀70~80年代，國內(nèi)已研發(fā)出藥物葫蘆素片，臨床用于肝炎和原發(fā)性肝癌的輔助治療。葫蘆素片是用乙醇從甜瓜蒂提取的總葫蘆素經(jīng)純化后加輔料壓片而成，葫蘆素B是主要藥效成分，也是該藥品有效成分檢驗的指標，藥典要求其含量不低于60%。
[0005]從甜瓜蒂提取的總葫蘆素中存在葫蘆素B-2-0-葡萄糖苷(以下簡稱為葫蘆素B糖苷)，其含量接近甚至大于葫蘆素B的含量，但生物活性遠遠不如葫蘆素B，如對人肝癌HepG-2細胞的抑制作用的僅為葫蘆素B的1.1%。糖苷鍵連接的化合物需先經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為苷元才能被人體吸收，但由于人體缺乏相應的酶而水解困難，幾乎不能被人體吸收。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
`
[0006]本發(fā)明目的是提供一株糖苷酶產(chǎn)生菌-鏈霉菌(Streptomyces sp.)RW_2,及其
在生物轉(zhuǎn)化制備葫蘆素B糖苷中的應用，能夠顯著提高從甜瓜蒂提取的總葫蘆素中葫蘆素B含量，具有成本低、工藝簡單、效率高等優(yōu)點。
[0007]本發(fā)明采用的技術方案是:
[0008]鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.) RW-2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏編號=CCTCC No:M2013330，保藏日期2013年7月11日。
[0009]本發(fā)明所述鏈霉菌RW-2，是由河道污水與甜瓜蒂粉末混合富集培養(yǎng)物中分離和篩選得到的優(yōu)良菌株，再經(jīng)紫外線照射誘變處理獲得。
[0010]所述鏈霉菌RW-2的菌落特征如下:在平板培養(yǎng)基上，30°C條件下，培養(yǎng)3天，菌落初期為白色，小而致密、干而不透明，不易挑起，之后逐漸變大，呈灰綠色，表面呈粉狀，有褶皺，背面呈灰黑色。在顯微鏡下觀察，基內(nèi)菌絲細長，多分枝；直徑為0.8~1.0 ii m ;氣生菌絲略粗；分生孢子呈橢圓形，表面光滑。
[0011]所述鏈霉菌RW-2的16s rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
[0012]GCTTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGAGCCACTTGGGCATCCAA
GTGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGC
GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
CAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAA
ACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC
GGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGT
GAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTG
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CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAG
GCTTGACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGG
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GTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGC
CGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCT
GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCC
CAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTCGAACAAo[0013]本發(fā)明還涉及所述的鏈霉菌RW-2在微生物發(fā)酵制備糖苷酶中的應用。[0014]具體的，所述應用如下:將鏈霉菌RW-2菌種孢子或經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25~35°C培養(yǎng)3~6天，獲得含有糖苷酶的發(fā)酵液。所得發(fā)酵液經(jīng)過濾或離心除去菌體的清液為糖苷酶粗酶液，可以直接應用于生物轉(zhuǎn)化葫蘆素B糖苷；也可以保藏于4°C冰箱15天內(nèi)使用；也可以經(jīng)過冷凍干燥，制成粗酶粉保藏于4°C冰箱長期使用。[0015]所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯100~200g/L、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶劑為水，pH6.0 ~8.0。[0016]本發(fā)明還涉及所述的鏈霉菌RW-2在微生物轉(zhuǎn)化葫蘆素B糖苷制備葫蘆素B中的應用，可提高甜瓜蒂乙醇提取的總葫蘆素中葫蘆素B含量。[0017]具體的，所述應用為:將鏈霉菌RW-2菌種孢子或經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子液接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25~35°C培養(yǎng)3~6天，發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體獲得糖苷酶粗酶液，粗酶液經(jīng)1~5倍水稀釋后，加入5~20%體積百分數(shù)的甜瓜蒂乙醇提取的總葫蘆素溶液(其中葫蘆素B含量為I~2mg/mL)，于25~35°C、150~250r/min振蕩條件下進行轉(zhuǎn)化12~48h，轉(zhuǎn)化液經(jīng)乙酸乙酯萃取回收總葫蘆素。[0018]所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯100~200g/L、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶劑為水，pH6.0 ~8.0。[0019]所述菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，或經(jīng)過種子擴大培養(yǎng)，然后用孢子或種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶培養(yǎng)。[0020]具體的，所述活化、種子擴大培養(yǎng)及產(chǎn)酶培養(yǎng)方法如下:[0021](1)將鏈霉菌RW-2菌種孢子接種于斜面培養(yǎng)基，于25~35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天，得到活化后的鏈霉菌RW-2菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯100~200g/L(馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加5倍質(zhì)量水煮沸20~30min，4層紗布過濾去除馬鈴薯塊)、蔗糖10~20g/L、瓊脂15~20g/L，溶劑為水，pH6.0~8.0，高壓蒸汽121°C滅菌20min ；
[0022](2)將步驟(1)活化培養(yǎng)后鏈霉菌RW-2斜面孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于25~35°C、150~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)I~2天，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基不含瓊脂，其他成分以及配制方法同斜面培養(yǎng)基；
[0023](3)將步驟(1)的鏈霉菌RW-2斜面孢子，或步驟(2)制備的種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶培養(yǎng)基于25~35°C、150~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)3~6天，得到鏈霉菌RW_2的發(fā)酵液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯100~200g/L (處理方法同斜面培養(yǎng)基)、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶劑為水，pH6.0~8.0，高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0024]微生物有著非常強大的酶系和分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，一些糖苷酶能將葫蘆素B糖苷的葡萄糖殘基水解而使其轉(zhuǎn)化為葫蘆素B。酶水解法比酸堿水解法更有專一性，不會對產(chǎn)物葫蘆素B結構造成破壞，具有轉(zhuǎn)化率高、條件溫和等優(yōu)點。本發(fā)明將甜瓜蒂提取的總葫蘆素，用微生物發(fā)酵制備的特異性糖苷酶進行水解處理，將葫蘆素B糖苷轉(zhuǎn)化為葫蘆素B，但對葫蘆素B和葫蘆素E等成分不產(chǎn)生水解作用，提高葫蘆素B在總葫蘆素中的含量，從而提高了該藥品的有效成分含量，降低藥品的生產(chǎn)成本。
[0025]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:(I)鏈霉菌是發(fā)酵工業(yè)中常用菌種，無毒無害，使用安全；(2)鏈霉菌RW-2營養(yǎng)要求簡單、生長迅速、容易培養(yǎng)；(3)鏈霉菌RW-2產(chǎn)生的糖苷酶為胞外酶，分離除去菌體，粗酶液或經(jīng)稀釋后，即可作為生物轉(zhuǎn)化體系，(4)從甜瓜蒂提取的總葫蘆素經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理后 ，其中的葫蘆素B糖苷幾乎能全部轉(zhuǎn)化為葫蘆素B，葫蘆素B的含量可提高I~2.7倍。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為標準品葫蘆素B (濃度為0.2g/L)高效液相色譜圖；
[0027]圖2為未經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫蘆素的高效液相色譜圖；
[0028]圖3為經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫蘆素的高效液相色譜圖。
(五)【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0030]實施例1:產(chǎn)糖苷酶微生物的富集、分離、篩選和誘變
[0031]250mL三角瓶中加入約2g甜瓜蒂，加適量河道中的污水，攪拌均勻，置于30°C的恒溫箱培養(yǎng)7天，進行產(chǎn)糖苷酶微生物的富集。
[0032]將長滿菌絲的上述富集物用無菌水稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，于30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。挑取形態(tài)和顏色不同的菌落孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，斜面置于30°C恒溫培養(yǎng)3天，得孢子豐富的斜面菌種。
[0033]用接種環(huán)分別挑取上述各個菌株斜面菌種的孢子，接入50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝)，于28°C、180r/min振蕩條件下發(fā)酵培養(yǎng)5天后，將發(fā)酵液用4層紗布過濾，取9mL濾液(即粗酶液)轉(zhuǎn)入一只50mL的三角瓶中，加入ImL甜瓜蒂乙醇提取的總葫蘆素溶液(其中葫蘆素B含量為1.42g/L)。三角瓶于28°C、180r/min的水浴振蕩箱中生物轉(zhuǎn)化24h后，用IOmL的乙酸乙酯萃取2遍，合并乙酸乙酯，減壓蒸干后用IOmL甲醇溶解，0.45 u m濾膜過濾，用作葫蘆素B含量分析。
[0034]高效液相色譜法分析經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫蘆素中葫蘆素B含量，由此比較不同菌株所產(chǎn)糖苷酶將葫蘆素B糖苷轉(zhuǎn)化為葫蘆素B的能力大小，經(jīng)過比較，一個編號為R-2的菌株所產(chǎn)糖苷酶將葫蘆素B糖苷轉(zhuǎn)化為葫蘆素的轉(zhuǎn)化率最高，葫蘆素B含量可以提高1.43倍。
[0035]依據(jù)R-2的菌株菌落形態(tài)、菌絲大小和孢子形態(tài)初步判斷為放線菌，采用16SrDNA序列分析方法對菌株R-2進行鑒定,確定其為一株鏈霉菌(Streptomyces sp.)。
[0036]對野生菌株鏈霉菌R-2進行了紫外照射誘變選育，經(jīng)過篩選獲得產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化葫蘆素B糖苷為葫蘆素B能力有所提高的菌株RW-2，葫蘆素B含量可以提高1.86倍，較用野生菌株轉(zhuǎn)化提高了 30.1%，將該菌株提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號=CCTCC No:M2013330，保藏日期:2013年7月11日。
[0037]所述的平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基的組成相同，按如下組成和方法配制:馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200g，加自來水1000mL煮沸30min，4層紗布過濾去除馬鈴薯塊，濾液補足到lOOOmL，再加入蔗糖20g、瓊脂18g，pH自然，加熱溶化后分裝試管，高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0038]所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基按如下組成配制:馬鈴薯200g/L (處理方法同平板培養(yǎng)基)、蔗糖20g/L，大豆粉10g/L，溶劑為水，pH自然(實測值為6.8)。
[0039]實施例2:用于生物轉(zhuǎn)化過程的糖苷酶發(fā)酵
[0040]以鏈霉菌RW-2為 產(chǎn)酶菌種，經(jīng)過培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化葫蘆素B糖苷為葫蘆素B的能力較未優(yōu)化前顯著提高，葫蘆素B含量可以提高2.71倍，較未優(yōu)化前提高了 45.7%，優(yōu)選的制備方法如下:
[0041](I)將試管斜面保藏的鏈霉菌RW-2菌種接種于斜面培養(yǎng)基，斜面于30°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成和方法配制:馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200g，加自來水1000mL煮沸30min，4層紗布濾去馬鈴薯塊，濾液補足到lOOOmL，再加入蔗糖20g、瓊脂18g，pH自然，加熱溶化后分裝試管，高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0042](2)用接種環(huán)挑取步驟(1)活化培養(yǎng)后的鏈霉菌RW-2孢子至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于280C、180r/min振蕩條件下培養(yǎng)5天，得到含糖苷酶的發(fā)酵液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基按如下組成配制:馬鈴薯200g/L、蔗糖30g/L，大豆粉14g/L，溶劑為水，pH7.5。
[0043](3)將步驟(2)鏈霉菌RW-2的發(fā)酵液，用4層紗布過濾除去菌體，所得清液即為糖苷酶粗酶液。
[0044]所得糖苷酶粗酶液可以用于生物轉(zhuǎn)化法提高總葫蘆素中葫蘆素B含量，可以立即使用，也可以保藏于4°C冰箱15天內(nèi)使用，也可以經(jīng)過冷凍干燥后制備酶干粉，保藏于4°C冰箱長期保藏使用。
[0045]實施例3:生物轉(zhuǎn)化法提高總葫蘆素中葫蘆素B的含量
[0046]將市售中藥材甜瓜蒂于85°C的烘箱中烘干24h，用粉碎機將其粉碎。IOg甜瓜蒂粉中加入200mL的70%乙醇，40°C水浴浸提2.5h，再超聲浸提0.5h，4層紗布過濾，收集濾液。濾液減壓蒸干后用40mL甲醇溶解，即得總葫蘆素溶液(葫蘆素B含量為1.68g/L)。
[0047]取實施例2中制備的糖苷酶粗酶液9mL于50mL三角瓶中，加入ImL的上述總葫蘆素溶液，三角瓶用保鮮膜封口后，于32°C、180r/min的水浴振蕩箱中生物轉(zhuǎn)化16h。轉(zhuǎn)化液用IOmL乙酸乙酯萃取2遍，合并乙酸乙酯，減壓蒸干乙酸乙酯即得經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫
蘆素產(chǎn)品。
[0048]實施例4:經(jīng)生物轉(zhuǎn)化法處理的總葫蘆素中葫蘆素B的含量分析
[0049]將實施例3中經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫蘆素樣品用IOmL甲醇溶解，0.45 U m濾膜過濾，采用高效液相色譜法分析其中葫蘆素B的含量，結果表明，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的總葫蘆素中，葫蘆素B含量達到0.46g/L,而未經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理對照品中葫蘆素B含量僅為0.17g/L,可見，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理后， 葫蘆素B含量提高2.71倍。
【權利要求】
1.鏈霉菌(Sti^ptomycessp.) RW-2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏編號=CCTCC No:M2013330，保藏日期2013年7月11日。
2.如權利要求1所述的鏈霉菌RW-2，其特征在于所述鏈霉菌RW-2的16srDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.權利要求1所述的鏈霉菌RW-2在微生物發(fā)酵制備糖苷酶中的應用。
4.權利要求 1所述的鏈霉菌RW-2在生物轉(zhuǎn)化葫蘆素B-2-0-葡萄糖苷制備葫蘆素B中的應用。
【文檔編號】C12P33/00GK103614322SQ201310597855
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權日:2013年11月22日
【發(fā)明者】梅建鳳, 李莎, 金航, 應國清, 王鴻, 易喻, 陳建澍 申請人:浙江工業(yè)大學