一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子及其應(yīng)用，所述啟動子具有下列核苷酸序列：1）序列表中SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；或2）在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列進(jìn)行雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列；或3）對1）或2）所限定的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所得的，與1）或2）所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動子具有在氧化葡萄糖酸桿菌中有效表達(dá)內(nèi)源或外源基因的功能，與常用啟動子相比具有更高的啟動活性，可實現(xiàn)在G.oxydans中應(yīng)用于基因表達(dá)、功能基因的篩選研究，還可用于2-KGA高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建。
【專利說明】一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種啟動子，更具體地涉及一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子及其應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]基因表達(dá)的最終產(chǎn)物是RNA和蛋白質(zhì)，任何基因表達(dá)調(diào)控程序的缺陷或紊亂，均會對生物體造成嚴(yán)重后果。因此，基因表達(dá)調(diào)控的機理研究是分子生物學(xué)的熱點和前沿。編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都存在著不同的基因表達(dá)調(diào)控位點。啟動子作為啟動基因的重要元件已有詳細(xì)研究。啟動子是指可以與RNA聚合酶結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列區(qū)域，通常位于編碼基因的上游。它是基因的一個組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達(dá)程度。因此，啟動子的篩選和功能分析對于生物體內(nèi)表達(dá)調(diào)控機制的研究以及實現(xiàn)目的基因的時空特異性表達(dá)具有十分重要的意義。使用強啟動子有利于促進(jìn)內(nèi)源或外源基因的聞效表達(dá)。
[0003]氧化葡萄糖酸桿菌(G.0xydans)是一種革蘭氏陰性菌，屬于醋酸桿菌科(Acetobacterceae),其最大特點是細(xì)胞周質(zhì)外膜空間含有許多膜結(jié)合脫氫酶,可以不完全氧化糖、糖醇等多種底物為醛、酮及酸，產(chǎn)物不需要通過透膜運輸而直接分泌到胞外，因此廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。通過現(xiàn)代生物技術(shù)對微生物進(jìn)行遺傳標(biāo)記和改良，是研究和闡明其在生物催化中的作用、實現(xiàn)菌株的靶向改造的重要手段。目前，已有少數(shù)研究者嘗試篩選啟動子來驅(qū)動內(nèi)源基因在G.0xydans的高表達(dá)，以期構(gòu)建高產(chǎn)工程菌。例如，Saito等人將來自于E.coli的三個啟動子tufB、tac及PL用于強化L-山梨糖脫氫酶基因(sdh)和L-山梨糖酮脫氫酶基 因(sndh)在G.0xydans中的表達(dá),使得產(chǎn)物2_酮基-葡萄糖酸(2-KGA)的生成量比對照菌有不同程度的提高，其中tufB啟動子表現(xiàn)最高的啟動活性，2-KGA的產(chǎn)量從對照的59mg/ml提高到88mg/ml，提高的幅度有限(Saito，Y.，Ishii1Y.,Hayashi, H.，Imaoj Y.，Akashij T.，Yoshikawaj K.，Noguchi, Y.，Soedaj S.，Yoshidaj Μ.，NiwajΜ.，(1997)Cloning of genes coding for L-sorbose and L-sorbosone dehydrogenasesfrom Gluconobacter oxydans and microbial production of 2-keto-L-gulonate,aprecursor of L—ascorbic acid, in a recombinant G.0xydans strain.Applied andenvironmental microbiology63, 454-460.)。Merfort 等人報道了來自于 G.0xydans的延長因子啟動子tufB也能啟動5-酮基-葡萄糖脫氫酶(ga5dh)的同源表達(dá)(Merfort, M., Jiilichj F., (2006)Untersuchungen zur 5-keto-D-Gluconat Bildung mitGluconobacter oxydans.Forschungszentrum Jiilich GmbH，Zentralbibliothek.)?？偠灾陨硐鄳?yīng)的遺傳操作系統(tǒng)的缺乏仍舊是制約G.0xydans基因工程改良的主要因素，而獲得能在G.0xydans中使用且高效的啟動子是關(guān)鍵條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子及其應(yīng)用，從而解決氧化葡萄糖酸桿菌自身相應(yīng)的遺傳操作系統(tǒng)的缺乏制約了氧化葡萄糖酸桿菌基因工程的改良的缺陷。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]提供一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子具有下列核苷酸序列:1)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或2)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列進(jìn)行雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列；或3)對I)或2)所限定的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所得的，與I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的核苷酸序列。
[0007]所述雜交是在以下條件中進(jìn)行:在2X SSC, 0.P/oSDS的溶液中，68°C下雜交并洗膜I次，每次5min ;或在0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0008]還提供如上所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子的應(yīng)用，所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子在氧化葡萄糖酸桿菌中能夠有效表達(dá)內(nèi)源基因或外源基因。
[0009]所述內(nèi) 源基因包括來源于氧化葡萄糖酸桿菌的NADH脫氫酶II基因以及GA2DH基因，所述外源基因包括GFP基因。
[0010]所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子在氧化葡萄糖酸桿菌中對GA2DH基因的有效表達(dá)可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建。
[0011]還提供一種重組載體，所述重組載體中含有如上所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，所述重組載體通過在載體質(zhì)粒的多克隆位點插入具有所述核苷酸序列的DNA片段獲得。
[0012]還提供一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒中含有如上所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，由所述核苷酸序列啟動表達(dá)的目的基因，以及終止所述目的基因轉(zhuǎn)錄的終止序列組成。
[0013]還提供一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系含有如上所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子。
[0014]還提供一種重組菌，所述重組菌含有如上所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子。
[0015]本發(fā)明提供的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子經(jīng)證明具有在氧化葡萄糖酸桿菌中有效表達(dá)內(nèi)源基因或外源基因的功能，與該氧化葡萄糖酸桿菌中常用的啟動子tufB的作用效果相比，本發(fā)明提供的啟動子gHp0169具有更高的啟動活性,可實現(xiàn)在G.0xydans中應(yīng)用于基因表達(dá)、功能基因的篩選研究，并且該氧化葡萄糖酸桿菌啟動子還可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為PCR擴增得到的gHp0169啟動子的電泳圖譜；其中，泳道I為引物gHp0169-F和gHp0169-R擴增得到的gHp0169啟動子的電泳圖譜；泳道M為DNA Maker,分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大依次為 200bp，500bp，800bp，1200bp, 2000bp, 3000bp, 4500bp ；
[0017]圖2為gHp0169啟動子在G.0xydans基因組上的定位；其中，G0X0168為編碼一個NAD依賴的DNA連接酶基因，GOXO169編碼一個假定的蛋白。
[0018]圖3為PCR擴增得到的gfp的電泳圖譜。其中泳道I和2都為gfp_F和gfp-R擴增得到的gfp的電泳圖譜；泳道M為DNA Maker，分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大依次為200bp，500bp，800bp，1200bp，2000bp，3000bp，4500bp ；
[0019]圖4為gHp0169啟動子驅(qū)動的GFP蛋白在G.0xydans中隨著菌體生長的熒光值變化；
[0020]圖5為G.0xydans中GFP蛋白在突光顯微共聚焦顯微鏡下的突光照片；其中，a為gHp0169啟動子驅(qū)動下的G.0xydans, b為含空載pBBRlMCS5的對照菌；
[0021]圖6為PCR擴增得到的tufB的電泳圖譜；其中，泳道I為tufB_F和tufB_R擴增得到的tufB的電泳圖譜；泳道M為DNA Maker，分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大依次為200bp，500bp，800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ；
[0022]圖7為PCR擴增得到的ndh的電泳圖譜；其中，泳道I為ndh_F和ndh_R擴增得到的ndh的電泳圖譜；泳道M為DNA Maker,分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大依次為200bp，500bp,800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ；
[0023]圖8為PCR擴增得到的ga2dh的電泳圖譜；其中，泳道I為ga2dh_F和ga2dh_R擴增得到的ga2dh的電泳圖譜；泳道11為DNA Maker，分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大依次為200bp，500bp，800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ； [0024]圖9為ga2dh基因在各個菌中的轉(zhuǎn)錄水平比較；
[0025]圖10為各菌以氧化葡萄糖酸(GA)為底物生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的過程比較。
【具體實施方式】
[0026]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，參照《分子克隆指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件。
[0028]下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029]菌株與質(zhì)粒:大腸桿菌(E.coli)DH5a購自東盛公司。
[0030]pBBRlMCS5:參考 Kovach, Μ.E.，Elzer, P.H.，Steven Hill, D., Robertson, G.T., Farris, Μ.A., Roop II, R.Μ., Peterson, K.Μ., (1995) Four new derivativesof the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Genel66, 175—176。
[0031 ] 工具酶及生化試劑:各限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；T4DNA連接酶、T-Vector pMD?19(Simple)購自 Takara 公司；2XPCR mix 購自東盛公司；卡那霉素(Kan)、頭孢西丁鈉霉素(Cef)、硫酸慶大霉素(Gen)購自上海生工生物工程公司。
[0032]培養(yǎng)基:下述培養(yǎng)基的溶劑均為水。
[0033]LB液體培養(yǎng)基(I升):10g NaCl，5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨。
[0034]LB固體培養(yǎng)基(I升):I升液體LB液體培養(yǎng)基加13g瓊脂。
[0035]山梨醇液體培養(yǎng)基(I升):80g山梨醇，20g酵母提取物，Ig KH2PO4,0.5gMgSO4.7Η20，0.Ig 谷氨酰胺。
[0036]山梨醇固體培養(yǎng)基(I升):1升液體山梨醇液體培養(yǎng)基加13g瓊脂。
[0037]本發(fā)明中，靜息細(xì)胞是指在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)至一定時間后的微生物細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ占⒂镁彌_液進(jìn)行洗滌，去除營養(yǎng)成分的微生物細(xì)胞。
[0038]實施例1:啟動子gHp0169的克隆[0039]根據(jù)G.0xydans621H基因組序列，gHp0169序列位于G0X0168和G0X0169之間(如圖2所示)，設(shè)計與合成引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，其序列如下:
[0040]gHp0169-F:5， -ATAGAGCTCGCCAAGAAAGCCGCAGAACTC-3，；
[0041]gHp0169-R:5’ ~GCATCTAGAGCGGAAGGCGTTATACCCTGA~3J ；
[0042]以G.0xydans的基因組為模板，以gHp0169_F和gHp0169_R為引物，PCR擴增目的基因，并在兩端分別引入Sac I和Xba I酶切位點(下劃線所示)，具體條件如下:
[0043]反應(yīng)體系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0044]反應(yīng)過程:94°C5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s，30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，
4°C保存。
[0045]結(jié)果如圖1所示，采用引物gHp0169-F和gHp0169_R擴增得到大小約150bp的目
的條帶。
[0046]將擴增條帶回收純化后連接到T-Vector pMD?19 (Simple)載體上,得到重組載體命名為T-gHp0169。對插入片段進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明與gHp0169的5’側(cè)翼序列比較，一致性為100%，表明擴增正確。將該片段命名為gHp0169，其具體的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1 所示。
[0047]實施例2:啟動子gHp0169的功能活性驗證
[0048]2.1、質(zhì)粒 pBBRlpgHp0169_GFP 的構(gòu)建
[0049]根據(jù)引物gHpO 169-F和gHpO 169-R兩端設(shè)計的酶切位點，用Sac I和XbaI將gHp0169片段從實施例1構(gòu)建所得的T-gHp0169重組載體上切下，把酶切后回收的gHp0169片段與經(jīng)Sac I和Xba I酶切的pBBRlMCS5載體片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株中，提取質(zhì)粒，用Sac I和Xba I酶切鑒定。對初步鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序表明含有SEQ ID NO:1所示的142bp的重組載體命名為pBBRlpgHp0169。
[0050]以PET28a_GFP (購自美國綠陽生物醫(yī)藥公司)為模板，設(shè)計與合成gfp引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，其序列如下:
[0051]GFP-F:ACGTCTAGAAGAAAGACGATGGCTAGCA
[0052]GFP-R: CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCA
[0053]以質(zhì)粒PET28a_GFP為模板，以GFP-F和GFP-R為引物，PCR擴增目的基因，并在兩端分別引入Xba I和BamH I酶切位點(下劃線所示)，具體條件如下:
[0054]反應(yīng)體系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0055]反應(yīng)過程:94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，4°C保存。
[0056]將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在720bp左右存在明顯條帶，如圖3所示。用膠回收試劑盒純化回收720bp左右的片段后，用Xba I和BamHI限制性內(nèi)切酶于37°C水浴酶切l(wèi)h，再次電泳膠回收，與同樣酶切的質(zhì)粒pBBRlpgHp0169連接，轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR后進(jìn)行電泳(有大小約為720bp的酶切目的條帶)進(jìn)行測序，將測序表明含有GFP的重組載體命名為pBBRlpgHp0169-GFP。
[0057]2.2、氧化葡萄糖酸桿菌的基因工程菌G.0xydans pBBRlpgHp0169_GFP的獲得。
[0058]將2.1中獲得的重 組質(zhì)粒pBBRlpgHp0169_GFP先轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)進(jìn)行擴增，然后從重組E.coli提取質(zhì)粒pBBRlpgHp0169-GFP,用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至G.0xydans,轉(zhuǎn)化液在30°C搖床復(fù)蘇3-4h，涂布至含有硫酸慶大霉素(25mg/ml)的山梨醇瓊脂平板上，于30°C培養(yǎng)2-3天后，長出的抗性菌落即為陽性轉(zhuǎn)化子。同時轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒PBBR1MCS5于G.0xydans,得到 G.0xydans pBBRlMCS5 作為空白對照。
[0059]2.3、GFP在G.0xydans中表達(dá)量的檢測
[0060]全細(xì)胞相對突光定量檢測根據(jù)Yuzhou Xu, Qin Liu, Lingyun Zhou, ZhaoYang, Yuanxing Zhang.Surface Display of GFP by Pseudomonas Syringae TruncatedIce Nucleation Protein in Attenuated Vibrio Angui Ilarum Strain.MarBiotechnol (2008) 10:701 - 70所述，將各個時間點取的菌用PBS稀釋至0D600為1.0，利用突光酶標(biāo)儀(GENios Pro, Tecan, Mammedorf, Auich, Switzerland)在激發(fā)波長 485nm 和激發(fā)波長535nm下定量相對熒光。對照菌經(jīng)過同一處理后將其相對熒光作為對照。利用熒光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM，尼康，日本東京)觀察菌體熒光表達(dá)情況。
[0061]從圖4可以看出，全細(xì)胞熒光值隨著菌體生長增長，當(dāng)在穩(wěn)定期時達(dá)到最大，因此我們?nèi)?4h的菌體用于熒光顯微共聚焦掃描，從圖5可以看出，GFP在gHp0169的驅(qū)動下得到了表達(dá)，而對照菌則無熒光表達(dá)。
[0062]2.4、質(zhì)粒 pBBRlpgHp0169_ndh 和 pBBRlptufB-ndh 的構(gòu)建
[0063]根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌G.0xydans的啟動子tufB的核苷酸序列,其具體的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，設(shè)計引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，序列如下:
[0064]PtufB-F:5，-ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC-3，；
[0065]PtufB-R:5，-ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC-3，；
[0066]以G.0xydans菌株基因組為模板，以PtufB-F和PtufB-R為引物PCR擴增，在啟動子序列兩端分別引入Sac I和Xba I酶切位點，擴增條件如下:
[0067]反應(yīng)體系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0068]反應(yīng)過程:94°C 5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 40s，30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，
4°C保存。
[0069]PCR產(chǎn)物得到的tufB片段(如圖6，約500bp)用Sac I和Xba I酶切，把酶切后回收的tufB片段與經(jīng)Sac I和Xba I酶切的pBBRlMCS5載體片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株中，提取質(zhì)粒，用Sac I和Xba I酶切鑒定。對初步鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將重組載體命名為pBBRlptufB。
[0070]根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌G.0xydans的ndh的核苷酸序列,設(shè)計引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，序列如下:
[0071]ndh-F:5’ ~CGTCTAGAGAGGAAAAATCCATGTCTGC~3J ；
[0072]ndh-R:5’ ~ATAGGATCCATGCTCAAGCAGAGGACG~3，；
[0073]以G.0xydans的基因組為模板，以ndh_F和ndh_R為引物進(jìn)行PCR擴增，在啟動子序列兩端分別引入Sac I和Xba I酶切位點(下劃線所示)，擴增條件如下:
[0074]反應(yīng)體系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0075]反應(yīng)過程:94°C5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 40s，30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，4°C保存。
[0076]將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在1400bp左右存在明顯條帶(圖7)。用膠回收試劑盒純化回收HOObp左右的片段后，用Xba I和BamH I限制性內(nèi)切酶于37°C水浴酶切Ih，再次電泳膠回收，與同樣酶切的質(zhì)粒pBBRlpgHp0169/pBBRlptufB連接，轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR后進(jìn)行電泳(有大小約為1400bp的酶切目的條帶)進(jìn)行測序，將測序表明含有GFP的重組載體命名為pBBRlpgHp0169-ndh/pBBRlptufB-ndh。
[0077]2.5、NDH II的酶活檢測
[0078]膜組分的提取:將G.0xydans培養(yǎng)至穩(wěn)定期后收集，1000Orpm離心IOmin,做的菌體用一定體積的水洗滌一次，再用pH7.5,20mM的PBS緩沖液洗滌兩次后，重懸于同樣的緩沖液中。將細(xì)菌液于冰浴中超聲破碎(超5s停5s，99次)，然后于4°C、1000Orpm離心lOmin，棄沉淀取上清于4°C、30000rpm超聲離心lh，所得沉淀用50mM、pH5.5的NaAc緩沖液溶解，所得即為膜組分。
[0079]酶活測定:利用分光光度計在30°C、340nm處掃描因NADH還原為NAD+引起的吸光值變化。反應(yīng)體系(Iml):0.1mMNADH, 40mM的輔酶Q2 (溶解于二甲基亞砜中)、50mM、pH7.5的PBS以及適量的酶。反應(yīng)混合物現(xiàn)在30°C溫浴3min，然后加底物。蛋白濃度的測定用Bradford 法。
[0080]如表1結(jié)果所述，gHp0169驅(qū)動下的NDH II酶活為2.47U/mg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照菌(0.97U/mg),而同時在G.0xydans普遍使用的啟動子tufB控制下酶活也僅為1.39U/mg,說明啟動子gHp0169適用于在G.0xydans啟動外源基因和內(nèi)源基因的表達(dá)。
[0081]表1:NDH II在不同啟動子驅(qū)動下的酶活差別
[0082]
【權(quán)利要求】
1.一種氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子具有下列核苷酸序列: 1)序列表中SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 2)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO:1所示的核苷酸序列進(jìn)行雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列；或 3)對I)或2)所限定的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所得的，與I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，其特征在于，所述雜交是在以下條件中進(jìn)行:在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，68°C下雜交并洗膜I次，每次5min ;或在0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子的應(yīng)用，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子在 氧化葡萄糖酸桿菌中能夠有效表達(dá)內(nèi)源基因或外源基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述內(nèi)源基因包括來源于氧化葡萄糖酸桿菌的NADH脫氫酶II基因以及GA2DH基因，所述外源基因包括GFP基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌啟動子在氧化葡萄糖酸桿菌中對GA2DH基因的有效表達(dá)可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建。
6.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體中含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，所述重組載體通過在載體質(zhì)粒的多克隆位點插入具有所述核苷酸序列的DNA片段獲得。
7.—種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒中含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子，由所述核苷酸序列啟動表達(dá)的目的基因，以及終止所述目的基因轉(zhuǎn)錄的終止序列組成。
8.—種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子。
9.一種重組菌，其特征在于，所述重組菌含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌啟動子。
【文檔編號】C12R1/01GK103740714SQ201310597667
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】林金萍, 魏東芝, 施露露 申請人:華東理工大學(xué)