專利名稱：一種豬視網(wǎng)膜細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種豬視網(wǎng)膜傳代細(xì)胞及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒病(Porcine Circovirus Disease，PCVD)是由PCV2病毒感染而引起的一種臨床癥狀為漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)炎及腎炎，主要侵害5 12周齡斷奶仔豬，與近年來發(fā)生的PMWS、豬皮炎與腎炎綜合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, FONS)、豬呼吸道綜合征(PorcineRespiratory Disease Complex, PRDC)、A2 型先天性振顫(Congenital Tremor, CT)、豬增生性和壞死性肺炎(Porcine Proliferative and Necrotizing Pneumonia, PNP)、繁殖障礙等疾病都有密切相關(guān)。PCV2的危害在于能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，并經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，易被忽視。由于PCV2感染使免疫系統(tǒng)受到損害，容易繼發(fā)或并發(fā)其它病原體，使病情加重，并造成更大危害。本病呈世界性流行，自2000年證實我國存在此病以來，現(xiàn)已在我國豬群中普遍存在，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒2型(以下簡稱PCV2)能在單核細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及腎上皮細(xì)胞等原代細(xì)胞中繁殖，也能在Vero等傳代上皮細(xì)胞中繁殖，但觀察不到細(xì)胞病變，只有在豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖能使細(xì)胞產(chǎn)生明顯的病變。而原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞有分裂次數(shù)限制，體外培養(yǎng)20幾代以后細(xì)胞就會自然衰老死亡。因此需要構(gòu)建一株能連續(xù)傳代的豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，以供PCV2的分離、培養(yǎng)、鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，以供PCV2病毒的分離和鑒定，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明將含有LTAg基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中建立了傳代豬視網(wǎng)膜細(xì)胞MPR，該細(xì)胞可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至80代時細(xì)胞形態(tài)和性狀均未發(fā)生改變。PCV2病毒可以在該細(xì)胞內(nèi)大量增殖，并引起明顯的細(xì)胞病變。本發(fā)明的一個方面涉及一個轉(zhuǎn)基因傳代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞MPR，其保藏編號為:CCTCC NO: C2012193，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期:2012年12月13日。本發(fā)明的細(xì)胞的構(gòu)建，是將表達(dá)SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性(neomycin resistance)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中構(gòu)建的。所述的質(zhì)粒為質(zhì)粒pcDNA3.l_LTAg，其啟動子為CMV (人巨細(xì)胞病毒)。本發(fā)明豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞MPR的應(yīng)用，用于PCV2病毒的分離、培養(yǎng)以及鑒定。本發(fā)明的MPR細(xì)胞與原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞形態(tài)無變化，能連續(xù)穩(wěn)定傳代至80代以上。經(jīng)western blot和RT-PCR檢測，MPR細(xì)胞能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)LTAg，第80代細(xì)胞仍能檢測出LATg的穩(wěn)定表達(dá)。因此，本發(fā)明的MPR細(xì)胞在PCV2病毒的分離、培養(yǎng)以及鑒定中具有很好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式本發(fā)明將I個LTAg表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中，經(jīng)過長期的篩選獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的傳代細(xì)胞，并建立了 PCV2病毒的培養(yǎng)方法。轉(zhuǎn)入豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中的pcDNA3.1-LTAg質(zhì)粒是由pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒構(gòu)建的，在質(zhì)粒中插入LTAg基因，該基因的表達(dá)由CMV (人巨細(xì)胞病毒)啟動子驅(qū)動。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中還含有Neomycin (新霉素)抗性基因，因此可以用藥物G418來篩選能穩(wěn)定表達(dá)LTAg的細(xì)胞。經(jīng)G418壓力篩選得到能穩(wěn)定表達(dá)LATg，并能連續(xù)傳代、性狀穩(wěn)定的豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞MPR。MPR細(xì)胞接PCV2病毒72小時能觀察到明顯的細(xì)胞病變，并且病毒滴度能達(dá)到
6.5o實施例1 LTAg表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-LTAg的構(gòu)建根據(jù)NCBI genebank 中 LTAg 基因的序列(Sequence ID: gi | 156599055)設(shè)計引物，引物信息分別為:F: ttatgtttcaggttcagg、R: atggataaagttttaaac。而 293T 細(xì)胞中整合了 LTAg基因，因此，以293T細(xì)胞基因組為模板，PCR擴(kuò)增出LTAg基因，測序結(jié)果表明所獲得片段就是所要的目的片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1,編碼的氨基酸序列為SEQID N0:2。用EcoRV限制性內(nèi)切酶將pcDNA3.1 ( + )質(zhì)粒切開，連入擴(kuò)增獲得的LTAg基因片段，就得到了能表達(dá)LTAg蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-LTAgo實施例2傳代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞MPR的獲得和篩選(I)取香豬仔豬的眼球10只，75%乙醇浸泡5分鐘，生理鹽水浸泡5分鐘，PBS溶液沖洗兩次。無菌條件下剪開眼球，用鑷子剝離視網(wǎng)膜，PBS沖洗，用含有0.25%胰蛋白酶和
0.02%EDTA的消化液消化，37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化半小時。加入10%胎牛血清的DMEM終止消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入DMEM懸浮細(xì)胞，鋪到六孔板中。(2)在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞鋪板率達(dá)到60%_80%時，以2 μ g/孔的比例，將pcDNA3.1-LTAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染液為Lipofectamine LTX (Invitrogen 公司)。(3)48小時后，倒掉舊的培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100 μ g/ml硫酸鏈霉素)，換成選擇性培養(yǎng)基(含終濃度為600 μ g/ml G418的生長培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)，定期換液，篩選2周后，得到穩(wěn)定表達(dá)LTAg的傳代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，命名為MPR，并進(jìn)行了保藏。其保藏編號為:CCTCC NO: C2012193，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心，保藏日期:2012年12月13日。之后，將G418的終濃度降為300 μ g/ml維持培養(yǎng)(維持培養(yǎng)基:含終濃度為300 μ g/ml G418的生長培養(yǎng)基)或凍存。此種方法制作的傳代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能保持原來的形態(tài)結(jié)構(gòu)；增值能力得 到增強(qiáng)，細(xì)胞比原代細(xì)胞長得更快；遺傳穩(wěn)定性高，連續(xù)傳代80代后，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、增值能力不變；因為傳代細(xì)胞表達(dá)的LTAg蛋白能輔助病毒的包裝出毒，所以傳代細(xì)胞接毒后病變出現(xiàn)的更快，更明顯，且病毒滴度有所提高。
實施例3用MPR細(xì)胞培養(yǎng)PCV2病毒PCV2病毒培養(yǎng):六孔板中MPR細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時，接種200 μ L PCV2毒液，37°C吸附2小時。吸出原來培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入新的培養(yǎng)液，37°C 5%C02培養(yǎng)48小時即可觀察到明顯細(xì)胞病變，72小時細(xì)胞完全病變。效價測定取PCV2毒種，做10倍比稀釋，分別取10_4、10_5、10' 10_7接種長勢良好的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，每個稀釋度接種4孔，每孔0.1mL,同時設(shè)細(xì)胞陰性對照孔。接種后，置37°C、5%C02培養(yǎng)6 7日，觀察細(xì)胞病變，出現(xiàn)CPE者判為感染，計算TCID50 0經(jīng)計算病毒滴度可達(dá)到6.5。上述的培養(yǎng)結(jié)果表明，本發(fā)明的MPR細(xì)胞可以有效的用來培養(yǎng)PCV 2病毒。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，其保藏編號為:CCTCC N0:C2012193o
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞的構(gòu)建方法，是將表達(dá)SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中構(gòu)建的。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的質(zhì)粒為pcDNA3.l_LTAg，其啟動子為 CMV。
4.權(quán)利要求1所述的細(xì) 胞在PCV2病毒的分離、培養(yǎng)以及鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的涉及一個轉(zhuǎn)基因傳代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞MPR，其保藏編號為CCTCC NO: C2012193。本發(fā)明的MPR細(xì)胞與原代豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞形態(tài)無變化，能連續(xù)穩(wěn)定傳代至80代以上。經(jīng)western blot和RT-PCR檢測，MPR細(xì)胞能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)LTAg，第80代細(xì)胞仍能檢測出LATg的穩(wěn)定表達(dá)。因此，本發(fā)明的MPR細(xì)胞在PCV2病毒的分離、培養(yǎng)以及鑒定中具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/93GK103224911SQ201310189019
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者韓乃軍, 鄒敏 申請人:青島易邦生物工程有限公司