專(zhuān)利名稱(chēng)：視網(wǎng)膜細(xì)胞存活的HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HIF1α調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)變性性疾病，例如，視網(wǎng)膜變性。
背景技術(shù)：
由于視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡導(dǎo)致的視力下降和失明是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。在2004年的公報(bào)中，世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，全球失明和視障的人口超過(guò)3億，在美國(guó)幾乎有1千萬(wàn) (WHO Bulletin 82pp844-851-Global Data on Visual Impairment November，2004)。 $ 發(fā)達(dá)國(guó)家，老人失明的主要原因是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，據(jù)估計(jì)其造成美國(guó)全部失明病例的一半。AMD逐漸破壞清晰的中心視力(sharp central vision)，后者是諸如駕駛和閱讀的活動(dòng)所需要的。AMD是以軟和硬的玻璃疣(drusen)的存在、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE) 的改變的色素沉著、RPE萎縮和脈絡(luò)膜新生血管(CNV)為特征的一組不同的疾病。AMD通常分為兩種形式，即干性和濕性AMD。干性AMD包括碎片的積聚和在外視網(wǎng)膜中的沉積，伴隨 RPE中、特別是中心視網(wǎng)膜之下的萎縮和肥大性變化。濕性AMD是一種病理過(guò)程，繼發(fā)于在大約20%的AMD患者中發(fā)生的血管新生血管變化(例如，CNV)。目前還不清楚這兩種形式 (濕性和干性)是相同病癥的不同表現(xiàn)形式，還是具有截然不同的起源和病理的不同的疾病。最近，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了濕性AMD的治療。例如，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗體，諸如來(lái)自 Genentech(South San Francisco, CA)的AVASTIN 和LUCENTIS ,表現(xiàn)出在某些情況下對(duì)治療確定的AMD的益處。除了 AMD，還描述了其他視網(wǎng)膜疾病。色素性視網(wǎng)膜炎(RP)由損害視桿感光細(xì)胞 (視桿)并導(dǎo)致其死亡的突變?cè)斐?。一些突變?dǎo)致視桿細(xì)胞迅速死亡，而另外一些導(dǎo)致這些細(xì)胞緩慢損失。但是，不管機(jī)制如何，一個(gè)共同的特征是視桿光感受器的損失。由于這種損失，患者變得在昏暗的照明下無(wú)法看清，但保留在光線(xiàn)充足的時(shí)候閱讀和駕駛的能力。這些其余的活動(dòng)是由視錐光感受器介導(dǎo)的，直到大部分視桿已經(jīng)死亡視錐光感受器仍然保持完整，然后它們開(kāi)始死亡。因此，視桿和視錐感光細(xì)胞死亡的預(yù)防作為一種治療或預(yù)防RP的方法是可取的。青光眼是另一種常見(jiàn)致盲疾病。它涉及視網(wǎng)膜的輸出神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損失。 在許多情況下，這種死亡伴隨著增加的眼內(nèi)壓，而在其他情況下，壓力處于正常范圍內(nèi)。在所有情況下，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡和失明是其結(jié)果。使用多種小鼠模型來(lái)研究視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡和視網(wǎng)膜疾病。特別地，由于極少有視桿細(xì)胞死亡在正常發(fā)育過(guò)程中發(fā)生，因此普遍在視網(wǎng)膜變性模型中研究視網(wǎng)膜細(xì)胞存活。 在視桿特異性基因磷酸二酯酶6 β (PDE 6β亞基)中的突變導(dǎo)致幾種類(lèi)型的動(dòng)物以及人類(lèi)中的光感受器變性。在小鼠中，這種突變也被稱(chēng)為rdl突變(Bowes等人(1990)Nature 347 677 ；McLaughlin ^ 人(1993) Nat. Genet. 4 :130-4 ；Rakoczy ^ 人(2006) Exp. Eye Res. 82(5) 741，Epub 2005Decl)。Rdl/rdl小鼠對(duì)于Pde6 β基因的外顯子7中的無(wú)義突變是純合的，這完全擾亂了視桿磷酸二酯酶的β亞基的產(chǎn)生(Carter-Dawson等人，1978)。 視桿發(fā)育，但隨后在出生后第(P) 12天和P21之間經(jīng)歷迅速變性。因此，攜帶突變的小鼠是有用的視網(wǎng)膜細(xì)胞疾病、特別是關(guān)于視桿細(xì)胞的光感受器變性的模型。例如，rdl小鼠用作人類(lèi)色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的模型(Komeima 等人(2007) J. Cell Physiol. 213 :809)。Rdl 小鼠也用作年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的模型。(Rohrer等人(2007)Exp. Eye Res. 84(1) 82，Epub 20060ct 25)。失明的分子機(jī)理仍不清楚。因?yàn)榧?xì)胞死亡是導(dǎo)致失明的重要方面，與通過(guò)控制DNA 調(diào)控細(xì)胞存活有關(guān)的分子和過(guò)程正處于積極研究中。關(guān)鍵的細(xì)胞存活機(jī)制是通過(guò)組蛋白蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸乙?；瘜?duì)基因表達(dá)的調(diào)控。賴(lài)氨酸乙?；且阴；梢阴］o酶A(CoA)向賴(lài)氨酸殘基的氨基的轉(zhuǎn)移。乙酰化是可逆的，且在體內(nèi)通過(guò)去除乙酰基的乙酰轉(zhuǎn)移酶和脫乙酰酶的競(jìng)爭(zhēng)作用來(lái)控制。早期的研究確定組蛋白蛋白質(zhì)為賴(lài)氨酸乙酰化的主要底物，后來(lái)的研究確定許多蛋白質(zhì)為組蛋白乙?；蚪M蛋白脫乙酰酶(HDAC)的底物。因?yàn)榻M蛋白蛋白質(zhì)參與調(diào)控基因表達(dá)，HDAC已經(jīng)主要作為催化組蛋白脫乙?；霓D(zhuǎn)錄輔阻遏物 (corepressor)進(jìn)行研究(Nagy 等人，1997 ；Strahl 和 Allis，2000)。存在幾類(lèi)HDAC (參見(jiàn)，Yang 和 Gr6goire (2005)Mol. Cell. Biol. 25 :2873)。IIA 類(lèi)組蛋白脫乙酰酶，其包括HDAC4、-5、-7、-9，共有幾個(gè)特點(diǎn)。它們結(jié)合MEF2并抑制其活性，并且它們經(jīng)受細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。這種運(yùn)輸受信號(hào)誘導(dǎo)的磷酸化調(diào)控(Miska 等人(1999)Embo. J. 18 :5099)。例如，HDAC4可以被鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的激酶IV(CaMKIV) 磷酸化(Zhao等人(2001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。磷酸化募集磷酸結(jié)合蛋白14-3-3，由此產(chǎn)生的復(fù)合物有效地從核輸出(Wang和Yang(2001)Mol.Cell.Biol.21 :5992)。HDAC4在去磷酸化和與14-3-3解離后，可以隨后重新進(jìn)入核(Grozinger和khreiber (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA doilO. 1073)。本領(lǐng)域需要用于預(yù)防、治療、診斷和預(yù)測(cè)由于一種或多種視網(wǎng)膜疾病或一個(gè)或多個(gè)自然事件引起的視網(wǎng)膜細(xì)胞功能下降所導(dǎo)致的視力喪失的療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)HDAC4、HDAC5和HDAC6各自在神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜) 細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。已發(fā)現(xiàn)HDAC7在視網(wǎng)膜細(xì)胞中具有與HDAC4、5和6類(lèi)似的分布，且由于其與其他IIa類(lèi)HDAC的高度同源性和類(lèi)似的分布情況，它還參與神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的存活。本發(fā)明進(jìn)一步部分地基于以下發(fā)現(xiàn)=HIFlci也在神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜) 細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的方法，包括以足以抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的量在一種或多種視網(wǎng)膜細(xì)胞中表達(dá)外源性HDAC4和/或外源性 HIFl α。在某些方面，視網(wǎng)膜細(xì)胞是，例如，雙極細(xì)胞、視桿感光細(xì)胞、視錐感光細(xì)胞及其組合。視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡可以自然發(fā)生或由諸如年齡相關(guān)性黃斑變性或色素性視網(wǎng)膜炎的視網(wǎng)膜疾病引起。在某些方面，編碼外源性HDAC4和/或外源性HIFl α的核酸序列通過(guò)體內(nèi)電穿孔和/或通過(guò)病毒載體被遞送到視網(wǎng)膜細(xì)胞。在某些方面，外源性HDAC4在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。 外源性HDAC4可以包括導(dǎo)致外源性HDAC4定位于神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的突變，例如，對(duì)于 HDAC4-L175A觀(guān)察到的表型。在某些方面，外源性HIFl α沒(méi)有被ARDl乙?；?，沒(méi)有被泛素化和/或沒(méi)有經(jīng)受蛋白酶體降解。在某些方面，外源性HIFl α包括導(dǎo)致外源性HIFl α具有組成型活性的(constitutively active)突變。在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的方法，包括抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞中的內(nèi)源性HDAC4的降解，以抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的方法，包括防止 ARDl乙?；暰W(wǎng)膜細(xì)胞中的HIFl α，以抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。在某些方面，抑制HIFl α泛素化。在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種抑制雙極細(xì)胞死亡的方法，包括以足以抑制雙極細(xì)胞死亡的量在雙極細(xì)胞中表達(dá)外源性HDAC6。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法。該方法包括將細(xì)胞與一種增強(qiáng)HDAC4或HIFl α的表達(dá)和/或活性的試劑接觸，從而抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡。在再另一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防受試者的神經(jīng)變性性疾病的方法。 該方法包括向受試者施用一種增強(qiáng)HDAC4或HIFl α的表達(dá)和/或活性的試劑，從而治療或預(yù)防該受試者的所述神經(jīng)變性性疾病。適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞包括視網(wǎng)膜細(xì)胞，諸如雙極細(xì)胞、視桿感光細(xì)胞或視錐感光細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的試劑包括核酸分子。合適的核酸分子可能在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子包括包含突變的HDAC4基因，所述突變導(dǎo)致外源性 HDAC4定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，諸如HDAC4-L175A。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，核酸分子包括沒(méi)有被ARDl乙?；腍IFl α基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子包括沒(méi)有被泛素化的 HIFla基因。在再另一實(shí)施方式中，核酸分子包括沒(méi)有被蛋白酶體降解的HIFl α基因。在另一實(shí)施方式中，核酸分子包括包含導(dǎo)致外源性HIFl α具有組成型活性的突變的HIFl a 基因。神經(jīng)元細(xì)胞死亡可以自然發(fā)生或由諸如年齡相關(guān)性黃斑變性或色素性視網(wǎng)膜炎的神經(jīng)變性性疾病引起。在其他方面，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法。該方法包括將細(xì)胞與一種抑制細(xì)胞中HDAC4降解的試劑或防止ARDl乙?；黾?xì)胞中的HIFl α的試劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，抑制HIFl α泛素化。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制雙極細(xì)胞死亡的方法。該方法包括將細(xì)胞與一種增強(qiáng)所述細(xì)胞中HDAC6的表達(dá)和/或活性的試劑接觸，從而抑制所述雙極細(xì)胞的死亡。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子包含在載體中，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒/ 逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合體、腺伴隨病毒(AAV)、單純皰疹病毒I或II、細(xì)小病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(reticuloendotheliosis virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乳頭瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，載體是AAV載體，例如，AAV 2/5或AAV 2/8載體。


圖1A-1D說(shuō)明HDAC4在發(fā)育中的和成熟的小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)。(A，B)分別為在 Pl和P21的視網(wǎng)膜切片的HDAC4免疫組織化學(xué)。(C，D)抗-HDAC4抗體與阻斷肽的預(yù)溫育導(dǎo)致在Pl和P21染色缺乏。箭頭(B，D)，由小鼠抗體標(biāo)記的血管。圖2A-I說(shuō)明HDAC4對(duì)于視網(wǎng)膜細(xì)胞的存活是必不可少的。使用在PO通過(guò)體內(nèi)電穿孔導(dǎo)入野生型小鼠視網(wǎng)膜的RNAi，在P6(A-C)或P5(D-J)經(jīng)分析，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)或HDAC4蛋白質(zhì)水平降低。(A)具有GAPDH RNAi的視網(wǎng)膜的冷凍切片(Cryosection)。(B)具有HDAC4 RNAi的視網(wǎng)膜的冷凍切片。(C)具有HDAC4 shRNA和 RNAi抗性HDAC4表達(dá)構(gòu)建體的視網(wǎng)膜的冷凍切片。(D-F)利用末端尿苷脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)分析檢測(cè)凋亡性細(xì)胞死亡。(D)具有GAPDH RNAi的視網(wǎng)膜的冷凍切片。箭頭表示TUNEL+細(xì)胞。(E)具有HDAC4 RNAi的視網(wǎng)膜的冷凍切片。箭號(hào)表示 TUNEL+GFP-細(xì)胞。箭頭(arrowhead)表示 TUNEL+GFP+細(xì)胞。(F)具有 HDAC4 RNAi 的視網(wǎng)膜的冷凍切片，來(lái)自非電穿孔區(qū)域。箭號(hào)表示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。(G-J)活化的胱天蛋白冬酶-3(caspase-3)免疫組織化學(xué)。(G) GAPDHRNAi視網(wǎng)膜切片。_DAC4 RNAi切片。 箭號(hào)表示活化的胱天蛋白酶-3+GFP+細(xì)胞。(I)沒(méi)有GFP覆蓋的(G)中的圖像。(J)沒(méi)有 GFP覆蓋的(H)中的圖像。(K)在P3、P4、P5和P6，對(duì)于每次處理的3個(gè)電穿孔視網(wǎng)膜的每 10(^111切片，計(jì)數(shù)在!104(4 shRNA或GAPDHshRNA電穿孔之后的GFP+細(xì)胞數(shù)。在具有HDAC4 shRNA的視網(wǎng)膜中觀(guān)察到的GFP+細(xì)胞數(shù)表示為由GAPDH shRNA電穿孔的細(xì)胞中GFP+細(xì)胞數(shù)的百分比。圖3A-3F說(shuō)明HDAC4過(guò)度表達(dá)使雙極(BP)細(xì)胞免于自然發(fā)生的細(xì)胞死亡。由 pCAG-GFP(A)或pCAG-HDAC4(B)電穿孔的視網(wǎng)膜的冷凍切片，BP細(xì)胞位于INL的上半部分， 它們的突起(process)延伸到IPL。(C)示意圖，表明視網(wǎng)膜克隆如何由自然發(fā)生的BP死亡成形，以及HDAC4防止死亡。(D)在P21使用在PO注射的不能復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒LIA或 LIA-HDAC4進(jìn)行的克隆分析。LIA-HDAC4克隆顯示含有BP細(xì)胞的克隆的百分比增加，而一視桿克隆(one rodclone)的百分比減少。對(duì)3個(gè)由LIA或LIA-HDAC4感染的視網(wǎng)膜中的每一個(gè)分析800-1000個(gè)克隆。經(jīng)乂11如時(shí)t-檢驗(yàn)廣*p< 0.05。(E)顯示典型的一視桿克隆的視網(wǎng)膜切片，其包括大多數(shù)克隆類(lèi)型。(F)顯示典型的一視桿加一 BP克隆的視網(wǎng)膜切片，它是增加最多的由LIA-HDAC4標(biāo)記的克隆類(lèi)型。圖 4A-4K 說(shuō)明 HDAC4 防止視網(wǎng)膜變性。(A-D)在 PO，用 pCAG_GFP 和 pCAG_HDAC4 (B， D)或pCAG-HDAC6(A，C)對(duì)rdl視網(wǎng)膜電穿孔，并在P50使用抗視紫紅質(zhì)對(duì)鋪片視網(wǎng)膜 (flat-mountretinas)分析視桿光感受器的存活(C和D中的中灰色)。GFP標(biāo)記電穿孔的面積(A 和 B 中的淺灰色和中灰色)(E-J)。pCAG-GFP 和 pCAG_HDAC6 (Ε, F, G)或 pCAG_HDAC4 (H, I，J)和視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子的報(bào)告構(gòu)建體(Mio-DsRed(Il))在PO共電穿孔，在P70分析抗視紫紅質(zhì)(F，I)或報(bào)告活性。(K)在P70，rdl小鼠中HDAC4介導(dǎo)的拯救(rescue)的量化。計(jì)數(shù)電穿孔區(qū)域中每100 μ m切片的liho-DsRed+細(xì)胞數(shù)。從3個(gè)獨(dú)立的電穿孔對(duì)5個(gè)視網(wǎng)膜評(píng)分。 圖5A-5N說(shuō)明，HDAC4可穩(wěn)定HIFl α蛋白質(zhì)，且HDAC4拯救光感受器需要HIFl α。(A-F) HDAC4穩(wěn)定野生型視網(wǎng)膜中的HIFl α。在PO用pCAG_HDAC4和pCAG_GFP或 PCAG-HDAC6和pCAG_GFP對(duì)野生型視網(wǎng)膜電穿孔，并在P14通過(guò)抗HIFl α免疫組織化學(xué)對(duì)視網(wǎng)膜切片進(jìn)行分析。㈧在HDAC4電穿孔的視網(wǎng)膜中，只在HDAC4電穿孔區(qū)域(C，D)，通過(guò)抗-HIFl α (B)在光感受器OS中檢測(cè)到HIFl α蛋白質(zhì)。(E)在HDAC6電穿孔的區(qū)域， 沒(méi)有檢測(cè)到HIFl α的免疫反應(yīng)性(F)。(G-J)HDAC4穩(wěn)定rdl視網(wǎng)膜中的HIFl α。在PO 用 pCAG-HDAC4 和 pCAG_GFP(G，H)或 pCAG_HDAC6 和 pCAG_GFP(I，J)對(duì) rdl 視網(wǎng)膜共電穿孔，并在P22通過(guò)抗-HIFl α免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。(K_N) HDAC4拯救光感受器需要穩(wěn)定的 HIFl α。在 PO 用 pCAG-HDAC4(K，L)或 pCAG_HDAC4 加上顯性陰性(dn)形式的 HIFl α、 pCAG-dnHIFl α (Μ, N)和pCAG_GFP對(duì)rdl視網(wǎng)膜共電穿孔，并在P70通過(guò)視紫紅質(zhì)免疫組織化學(xué)分析桿光感受器的存活。圖6A-6D顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的HDAC4 RNAi篩選。HDAC4傳感器 HDAC4-IRES-GFP與shRNA至HDAC4或shRNA至GAPDH共轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24 小時(shí)分析HDAC4傳感器的減少(knockdown)。共轉(zhuǎn)染pCAG-HcRed以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(A) HDAC4-IRES-GFP被HDAC4 RNAi減少而不被GAPDH RNAi減少(B)，而轉(zhuǎn)染數(shù)量相當(dāng)?shù)募?xì)胞 (C，D)。圖7A-7B顯示HDAC6的過(guò)度表達(dá)拯救BP細(xì)胞免受在野生型視網(wǎng)膜中自然發(fā)生的細(xì)胞死亡。來(lái)自視網(wǎng)膜的P14冷凍切片在PO被pCAG-GFP(A)或pCAG_HDAC6 (B)電穿孔，而 BP細(xì)胞位于INL的上半部分。圖8A-8I顯示HIFl α乙酰化突變體救治視網(wǎng)膜變性。(A-H)在Ρ0，用pCAG_GFP、 Rho-DsRed和 pCAG-wt HIFl α (B, F)、pCAG_HIFlα K532R(C, G)或 pCAG_HDAC4(D,H)對(duì) rdl 視網(wǎng)膜電穿孔，并在P70分析光感受器的存活。(I)在P70，rdl小鼠中的光感受器存活的量化。在電穿孔的區(qū)域，計(jì)數(shù)每IOOym切片的I^ho-DsRed+細(xì)胞數(shù)。每次處理對(duì)3個(gè)視網(wǎng)膜評(píng)分。根據(jù)Student t-檢驗(yàn)，***ρ < 0. 05。圖9A-9C顯示HDAC4主要在發(fā)育的小鼠視網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)于HDAC4 (A)和 1^x6 (B)，Pl視網(wǎng)膜切片進(jìn)行雙免疫染色，在(C)中覆蓋。圖10顯示AAV2/5 HDAC4的注射導(dǎo)致視錐存活。將編碼GFP (對(duì)照)或HDAC4的 AAV 2/5注入PO的rdl小鼠眼睛的視網(wǎng)膜下間隙。在P60，對(duì)視網(wǎng)膜切片，并對(duì)于HDAC4 (淺灰色)或視錐抗原(PNA，中灰色)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。通過(guò)DAPI對(duì)細(xì)胞核染色。在具有HDAC4的視網(wǎng)膜中，如PNA和HDAC4染色的細(xì)胞數(shù)所顯示，更多的視錐存活。在對(duì)照感染中很少有視錐細(xì)胞存活。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)HDAC4、HDAC5和HDAC6各自在神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜) 細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。已發(fā)現(xiàn)HDAC7在視網(wǎng)膜細(xì)胞中具有與HDAC4、5和6類(lèi)似的分布， 且由于它與其他IIa類(lèi)HDAC的高度同源性和類(lèi)似的分布情況，它還參與神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的存活。本發(fā)明進(jìn)一步部分地基于以下發(fā)現(xiàn)=HIFlci也在神經(jīng)(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。因此，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞死亡的方法。 這種方法一般包括將神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞與諸如本文所述的HDAC4、HDAC6、HDAC7 或HDAC5和/或HIFlα核酸分子等試劑接觸。本發(fā)明還提供治療患有視網(wǎng)膜神經(jīng)變性性疾病的受試者的方法。這種方法一般包括向受試者施用有效量的諸如本文所述的HDAC4、 HDAC6、HDAC7或HDAC5和/或HIFl α核酸分子等試劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，核酸分子包含在載體中，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、 腺病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合體、腺伴隨病毒(AAV)、單純皰疹病毒I或II、細(xì)小病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乳頭瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是AAV載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，AAV載體是AAV 2/5或AAV2/8載體。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，核酸分子不包含在載體中。本發(fā)明的原理具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可以用于通過(guò)增加神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的水平來(lái)治療、預(yù)防和/或延遲神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞損失。在某些方面，改變(即增加)生物體中的一種或多種HDAC蛋白質(zhì)(例如，HDAC4、 HDAC5、HDAC7、HDAC9和/或HDAC6)或其部分和/或HIFl α蛋白質(zhì)或其部分的水平，以治療、預(yù)防和/或延緩神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的損失。本發(fā)明的原理也可適用于通過(guò)降低神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的水平，來(lái)促進(jìn)和/或加速神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的損失。 在某些方面，改變(即降低)生物體中的一種或多種HDAC蛋白質(zhì)(例如，HDAC4、HDAC5、 HDAC7、HDAC6和/或HDAC9)或其部分和/或HIFl α蛋白質(zhì)或其部分的水平，以通過(guò)促進(jìn)和/或加速神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的損失治療神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞的異常增殖。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)表達(dá)HDAC4的細(xì)胞質(zhì)突變體來(lái)提高視網(wǎng)膜細(xì)胞的存活。在某些方面，細(xì)胞質(zhì)突變體是HDAC4突變體，與野生型蛋白質(zhì)相比，它更大程度地存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，更小程度地存在于細(xì)胞核中。一些細(xì)胞質(zhì)突變體是本領(lǐng)域已知的；例如， HDAC4-L175AfPHDAC4-A118(WangfPYang(2001)Mol. Cell. Biol. 21 :5992)。在某些方面， 理想的是細(xì)胞質(zhì)HDAC4突變體主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而只有很少存在于細(xì)胞核中。細(xì)胞質(zhì) HDAC4突變蛋白可能根本不存在于細(xì)胞核中。細(xì)胞質(zhì)HDAC4的增多也可以通過(guò)激活或過(guò)度表達(dá)已知促進(jìn)HDAC4在細(xì)胞質(zhì)中的存在提高的蛋白質(zhì)來(lái)完成；例如，CaM激酶I、II、IV、 14-3-3蛋白等(參見(jiàn)，Yang和Gr6goire25(8) :2873. (2005)及其中的參考文獻(xiàn))。增加HIFl α的蛋白水平可以防止rdl小鼠中的視桿感光細(xì)胞的損失。因此，在本發(fā)明的某些方面，神經(jīng)細(xì)胞中的增加的HIFl α水平是需要的。增加的HIFl α水平可以通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)源性表達(dá)的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)HDAC4的過(guò)度表達(dá)。在某些示例性的實(shí)施方式中，增加的HIFl α水平可以通過(guò)其他方法實(shí)現(xiàn)，例如HIFl α蛋白的過(guò)度表達(dá)。過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)實(shí)現(xiàn)，包括本文所述的關(guān)于增加HDAC4蛋白的水平的方法。當(dāng)檢測(cè)到高于內(nèi)源性水平的HIFl α蛋白時(shí)，實(shí)現(xiàn)增加的HIFl α水平。在其他示例性的實(shí)施方式中，可以提供具有組成型活性的HIFl α蛋白質(zhì)。在再另一方面，本發(fā)明人已經(jīng)提供了通過(guò)增加HDAC4和/或HDAC6的水平來(lái)改善雙極(BP)細(xì)胞的存活的方法。可以實(shí)現(xiàn)向BP細(xì)胞的祖細(xì)胞遞送核酸，例如，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。通過(guò)增加祖細(xì)胞中HDAC4和/或HDAC6的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)雙極細(xì)胞的數(shù)目增加。雙極細(xì)胞的數(shù)目增加可以是大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或更大。在某些方面，外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)、和/或外源性HIFl α、和/或其部分在神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞中表達(dá)或接觸該細(xì)胞，使得外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)或外源性HIFl α表達(dá)后的細(xì)胞中的總HDAC (例如，HDAC4和/或 HDAC6)或總HIFl α水平與外源性HDAC或外源性HIFl α表達(dá)前的總HDAC(例如，HDAC4 和/或HDAC6)或總HIFl α水平相比提高。在外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)和 /或HIFl α表達(dá)后的總HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)或總HIFl α水平可以比外源性HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或外源性HIFl α表達(dá)前的總HDAC (例如，HDAC4和/ 或 HDAC6)或總 HIFl α 水平提高大約 5 %、10 %、15 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%,90% ,100%, 150 %,200 %,250 %,300 %,350 %Α00 %>450 %,500 550%,600%, 650 700%,750%, 800 %、850 %、900 %,950%,1000% 或更多。在其他方面，神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞與本文所述試劑接觸，與接觸該試劑前的總HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或總HIFl α水平相比，該試劑降低細(xì)胞中的 HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或HIFl α水平。在與試劑接觸之后，HDAC (例如，HDAC4 和/或HDAC6)或HIFl α水平可以降低至與該試劑接觸之前總HDAC(例如，HDAC4和/或 HDAC6)或總 HIFl α 水平的大約 5 % UO % ,15 %,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70 %,80 %, 90% ,100% ,150%,200%,250%,300%,350%,400%,450%,500%,550%,600%,650%, 700 %、750 %、800 %、850 %、900 %,950%,1000% 或更多。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接觸”(即，細(xì)胞與試劑接觸)意在包括在體外將試劑和細(xì)胞在一起溫育(例如，向培養(yǎng)的細(xì)胞添加試劑)或向受試者施用試劑，使得試劑與受試者的細(xì)胞在體內(nèi)接觸。術(shù)語(yǔ)“接觸”不包括將細(xì)胞暴露于可能在受試者中自然存在的試劑(即，可能由于自然的生理過(guò)程而發(fā)生的暴露)。在某些示例性的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于治療、預(yù)防和/或延遲與生物體中的神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)的病癥和疾病(例如，神經(jīng)變性性疾病)的方法和材料。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)變性性疾病”包括但不限于，眼睛的神經(jīng)變性性疾病，諸如，萎縮性黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、醫(yī)源性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜撕裂和裂孔、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈和動(dòng)脈阻塞等。神經(jīng)變性性疾病還包括但不限于某些以血管發(fā)生和神經(jīng)變性為特征的眼科疾病，諸如鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜靜脈或動(dòng)脈阻塞。神經(jīng)變性性疾病進(jìn)一步包括諸如視神經(jīng)病變、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、皮克病、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、植燒酸C: 積癥(Resfum' s disease)、山德霍夫氏病(sandhoff disease)、彌漫性硬化(Schilder disease)、斯-里-奧綜合征(Meele-Richardson-Olszewskidisease)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮、發(fā)作性睡病、神經(jīng)包柔螺旋體病 (neuroborreliosis)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌萎縮癥、脊髓癆、朊病毒疾病(例如，羊瘙癢癥、克雅氏病、Gerstmann-Strassler Scheinker病、牛海綿狀腦病等)、亞歷山大疾病、 阿爾珀病、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、巴廷病、卡納萬(wàn)病(Canavan disease)、科凱恩綜合征 (Cockaynesyndrome)、皮質(zhì)基底節(jié)變性、HIV相關(guān)的癡呆、肯尼迪氏病、克拉貝病、路易體癡呆癥、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型、繼發(fā)于惡性貧血的脊髓亞急性聯(lián)合變性、精神分裂癥、巴廷病等疾病。在某些示例性的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)和/或加速細(xì)胞的損失(例如，神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜)細(xì)胞損失)來(lái)治療、預(yù)防和/或延遲一種或多種與異常神經(jīng)元細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥和/或疾病(例如癌癥)的方法和材料。細(xì)胞增殖病癥意在包括與迅速增殖相關(guān)的疾病。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖病癥”包括以多細(xì)胞生物體中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞亞組的不良或不當(dāng)增殖為特征的疾病。術(shù)語(yǔ) “癌癥”指各類(lèi)惡性腫瘤，其中大部分可侵入周?chē)M織，并可能轉(zhuǎn)移到不同部位(參見(jiàn)，例如， PDR醫(yī)學(xué)辭典第1版(1995)，本文為所有目的引入全部?jī)?nèi)容作為參考)。術(shù)語(yǔ)“瘤”和“腫瘤”是指通過(guò)細(xì)胞增殖比正常細(xì)胞更快速地生長(zhǎng)的不正常的組織。同上。這種不正常的組織顯示部分或完全缺乏結(jié)構(gòu)組織和與正常組織的功能協(xié)調(diào)，它可能是良性的(即良性瘤) 或惡性的(即惡性腫瘤)。本發(fā)明包含的瘤類(lèi)型的例子包括但不限于那些與神經(jīng)組織、造血組織、乳腺、皮膚、骨骼、前列腺、卵巢、子宮、宮頸、肝、肺、腦、喉、膽囊、胰腺、直腸、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺、免疫系統(tǒng)、頭頸、結(jié)腸、胃、支氣管、和/或腎的癌癥相關(guān)的瘤。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物體”包括但不限于人、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、馬、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、小鼠、大鼠、沙鼠、青蛙、蟾蜍及其轉(zhuǎn)基因物種。術(shù)語(yǔ)“生物體”還包括但不限于酵母細(xì)胞、酵母四分體(yeast tetrad)、酵母菌落、細(xì)菌、細(xì)菌菌落、病毒體、病毒顆粒、病毒樣顆粒和/或其培養(yǎng)物等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)元”或“神經(jīng)元細(xì)胞”指能夠接受和傳導(dǎo)來(lái)自神經(jīng)系統(tǒng)的電脈沖的神經(jīng)細(xì)胞。 神經(jīng)細(xì)胞或“神經(jīng)元”通常包括細(xì)胞體、軸突、軸突終端和樹(shù)突，且很容易由本領(lǐng)域的技術(shù)人員識(shí)別。在一個(gè)實(shí)施方式中，神經(jīng)元是“感光細(xì)胞”，即在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的特化的神經(jīng)元。視網(wǎng)膜是薄的、透明的組織，含有大約1. 2億單獨(dú)的視桿細(xì)胞(夜視)和700萬(wàn)視錐細(xì)胞(日間和彩色視覺(jué))以及數(shù)百萬(wàn)其他結(jié)構(gòu)支持和互連細(xì)胞。感光細(xì)胞由“視桿”和“視錐”組成， 它們是視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞。視桿含有視紫紅質(zhì)-視桿感光色素，視錐含有其他不同的感光色素，這些感光色素對(duì)光作出反應(yīng)，并最終引起視網(wǎng)膜的輸出細(xì)胞-神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-的神經(jīng)放電。最終，該信號(hào)被記錄為視覺(jué)皮層和大腦中的其他目標(biāo)位置的視覺(jué)刺激。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞產(chǎn)生、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)多種負(fù)責(zé)光感受器的正常功能和存活的因子。也可以感受光的視網(wǎng)膜神經(jīng)元由光感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞組成。這些細(xì)胞被稱(chēng)為黑視素(melanopsin)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在內(nèi)視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)，具有樹(shù)突和投射到protectunK中腦)、下丘腦中的視交叉上核和外側(cè)膝狀體(丘腦)的長(zhǎng)軸突。視網(wǎng)膜也由位于光感受器(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的雙極細(xì)胞組成。這些細(xì)胞從光感受器向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞傳送信號(hào)。雙極細(xì)胞接受來(lái)自視桿或視錐但不是二者同時(shí)的突觸輸入，它們分別被稱(chēng)為視桿雙極細(xì)胞或視錐雙極細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，感光細(xì)胞是視桿。在一個(gè)實(shí)施方式中，感光細(xì)胞是視錐。在一個(gè)實(shí)施方式中，感光細(xì)胞是細(xì)胞，是雙極細(xì)胞。本發(fā)明的某些方面涉及載體，例如，含有編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白 (和/或其部分)的核酸的表達(dá)載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠運(yùn)送已與之連接的另一種核酸的核酸分子。載體的一個(gè)類(lèi)型是“質(zhì)粒”，它指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片段可以連接到其中。載體的另一種類(lèi)型是病毒載體，其中，另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入其中的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型(印isomal)哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞后整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，從而連同宿主基因組被復(fù)制。此外， 某些載體能夠引導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在本文中被稱(chēng)為“表達(dá)載體”。一般來(lái)說(shuō)，在重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用。然而，本發(fā)明意在包括發(fā)揮相當(dāng)?shù)墓δ艿钠渌问降谋磉_(dá)載體，諸如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“逆轉(zhuǎn)錄病毒”指在其復(fù)制周期中利用逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA被逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。該病毒的這種雙鏈DNA形式能夠被整合進(jìn)入受感染細(xì)胞的染色體中；一旦整合，它被稱(chēng)為“原病毒”。原病毒作為RNA聚合酶II的模板發(fā)揮作用，并引導(dǎo)編碼產(chǎn)生新病毒顆粒所需的結(jié)構(gòu)蛋白和酶的RNA分子的表達(dá)。在原病毒的每個(gè)末端是稱(chēng)為“長(zhǎng)末端重復(fù)”或“LTRs”的結(jié)構(gòu)。LTRs含有許多調(diào)節(jié)信號(hào)，包括轉(zhuǎn)錄控制元件、多腺苷酸化信號(hào)、以及病毒基因組的復(fù)制和整合所需的序列。LTRs的長(zhǎng)度可以為幾百個(gè)堿基對(duì)。術(shù)語(yǔ)“AAV載體”指源自包括但不限于 AAV-l、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5 或 AAVX7 的腺伴隨病毒血清型的載體?！皉AAV載體”指包括AAV核苷酸序列以及外源核苷酸序列的載體。rAAV載體只需要順式的145個(gè)堿基末端重復(fù)就能生成病毒。所有其他的病毒序列不是必需的，且可以提供為反式(Muzyczka(Iggz)CurrjopicsMicrobiol. Immunol. 158 97)。通常情況下，rAAV載體的基因組將只保留反向末端重復(fù)序列(ITR)序列，以使可以被載體有效包裝的轉(zhuǎn)基因的大小最大化。ITR不一定是野生型的核苷酸序列，并可能被改變， 例如，通過(guò)核苷酸的插入、缺失或替代，只要序列提供功能拯救、復(fù)制和包裝即可。在特定的實(shí)施方式中，AAV載體是AAV2/5或AAV2/8載體。合適的AAV載體在以下文獻(xiàn)中有描述，例如，美國(guó)專(zhuān)利 7，056，502 和 Yan 等人(2002) J. Virology 76(5) :2043_2053，本文通過(guò)引入其全部?jī)?nèi)容作為參考。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“慢病毒”指引起緩慢發(fā)育疾病的逆轉(zhuǎn)錄病毒的組(或?qū)?。包含在該組中的病毒包括HIV (人類(lèi)免疫缺陷病毒，包括但不限于1型HIV和2型HIV)-人類(lèi)獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體；維士那-梅地病毒(visna-maedi)，它會(huì)導(dǎo)致羊的腦炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒，它會(huì)導(dǎo)致山羊的免疫缺陷、關(guān)節(jié)炎和腦??；馬傳染性貧血病毒(EIAV)，它會(huì)導(dǎo)致馬的自身免疫性溶血性貧血和腦?。回埫庖呷毕莶《?FIV)，它會(huì)導(dǎo)致貓的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，它會(huì)導(dǎo)致牛淋巴結(jié)病、淋巴細(xì)胞增多癥和可能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，它會(huì)導(dǎo)致類(lèi)人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的免疫缺陷和腦病。這些病毒引起的疾病的特征是潛伏期長(zhǎng)和遷延不愈。通常情況下，病毒潛伏地感染單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它們從這些細(xì)胞擴(kuò)散到其他細(xì)胞。HIV、FIV和 SIV也容易感染T淋巴細(xì)胞(即T-細(xì)胞)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，慢病毒不是HIV。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腺病毒”(“Ad”)指一組具有大約361Λ的線(xiàn)性基因組的雙鏈DNA 病毒。參見(jiàn)，例如，Berkner 等人，Curr. iTop. Microbiol. Immunol.，158 :39-61 (1992)。在一些實(shí)施方式中，基于腺病毒的載體是基于Ad-2或Ad-5的載體。參見(jiàn)，例如，Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol.，158 :97-123,1992 ；Ali 等人，1994GeneTherapy 1:367-384 ；美國(guó)專(zhuān)利4，797，368和5，399，346。源自腺病毒株Ad型5dl324或其他腺病毒株(例如，Ad2、 Ad3、Ad7等)的合適的腺病毒載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。重組腺病毒是有利的，因?yàn)樗鼈儾恍枰至鸭?xì)胞為有效的基因遞送載體，且可用于感染多種細(xì)胞類(lèi)型。此外，引入的腺病毒DNA (和其中包含的外來(lái)DNA)沒(méi)有整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，而保持為游離型，從而避免在引入的DNA整合到宿主基因組(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)的情況下，由于插入突變可能導(dǎo)致發(fā)生的潛在的問(wèn)題。此外，腺病毒基因組攜帶外來(lái)DNA的能力相對(duì)于其他基因遞送載體較大(可達(dá) 8 千堿基)(Haj-Ahmand 等人 J. Virol. 57，267-273 [1986])。在一個(gè)實(shí)施方式中，腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒。目前使用的大多數(shù)復(fù)制缺陷型腺病毒載體具有病毒El和E3基因的全部或部分缺失，但保留多達(dá)80 %的腺病毒遺傳物質(zhì)。全部病毒編碼區(qū)域缺失的腺病毒載體也在以下文獻(xiàn)中有描述=Kochanek等人和 Chamberlain等人(美國(guó)專(zhuān)利5，985，846和美國(guó)專(zhuān)利6，083, 750)。這些病毒在缺乏由第二病毒(被稱(chēng)為“輔助”病毒)所提供的病毒產(chǎn)物的情況下，無(wú)法作為病毒復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方式中，腺病毒載體是“無(wú)病毒(gutless)”載體。這些載體含有最少量的腺病毒DNA，且不能表達(dá)任何腺病毒抗原(因此稱(chēng)為“無(wú)病毒”)。無(wú)病毒復(fù)制缺陷型Ad 載體提供了顯著優(yōu)勢(shì)容納外來(lái)DNA的大插入片段，同時(shí)當(dāng)無(wú)病毒復(fù)制缺陷型腺病毒載體用于基因治療中時(shí)，完全消除了表達(dá)導(dǎo)致對(duì)于病毒蛋白的免疫應(yīng)答的腺病毒基因的問(wèn)題。 產(chǎn)生無(wú)病毒復(fù)制缺陷型Ad載體的方法已在以下文獻(xiàn)中描述，例如，屬于Kochanek等人的美國(guó)專(zhuān)利5，981，225和屬于Chamberlain等人的美國(guó)專(zhuān)利6，063，622和6，451，596 ；Parks等人，PNAS 93 13565 (1996)和 Lieber 等人，J. Virol. 70 :8944-8960 (1996)。在另一實(shí)施方式中，腺病毒載體是“條件復(fù)制型腺病毒”(“CRAd”)。CRAd通過(guò)以下方法遺傳修飾以在特定的細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制(i)用組織特異性啟動(dòng)子替代病毒啟動(dòng)子； 或(ii)刪除只被靶細(xì)胞補(bǔ)償?shù)膶?duì)于復(fù)制重要的病毒基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠識(shí)別上皮細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。其他本領(lǐng)域已知的腺病毒載體可以在本發(fā)明的方法中使用。例子包括具有用于改變向性的重組纖維蛋白的Ad載體(例如，vanBeusechem等人，2000Gene Ther. 7 :1940-1946 中描述)、蛋白酶預(yù)處理過(guò)的病毒載體(例如，Kuriyama等人，2000Hum. Gene Ther. 11 2219-2230中描述)、E^i溫度敏感突變Ad載體(例如，Engelhardt等人，1994Hum. Gene Ther. 5 :1217-1229 中描述)和“無(wú)病毒Id 載體(例如，Armentano 等人，1997J. Virol. 71 2408-2416 ；Chen 等人，1997Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94 :1645-1650 ；Schieder 等人， 1998Nature Genetics 18 180-183 中描述)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸的形式的本發(fā)明的核酸(例如，編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列)，這意味著重組表達(dá)載體包括在用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)上選定的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，其可操作地連接待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體中，“可操作地連接”表示感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接到調(diào)控序列(例如，當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。這些調(diào)控序列在以下文獻(xiàn)中有描述，例如， Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185，Academic Press， San Diego,Calif. (1990)。調(diào)控序列包括那些在許多類(lèi)型的宿主細(xì)胞中引導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)和只在某些宿主細(xì)胞中引導(dǎo)核苷酸序列的表達(dá)的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于以下因素待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入到宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其部分，包括由本文所述的核酸編碼的融合蛋白或其部分(例如，一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組cDNA)和 RNA分子(例如，mDNA)及使用核苷酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離本發(fā)明的方法所用的核酸分子。使用感興趣的核酸序列的全部或部分作為雜交探針，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，如 Sambrook, J. , Fritsh, E. F.禾口Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 所述)分離核酸分子?！胺蛛x的”核酸分子是與存在于該核酸的天然來(lái)源中的其他核酸分子分開(kāi)的核酸分子。例如，關(guān)于基因組DNA，術(shù)語(yǔ)“分離的”包括與基因組DNA與其自然關(guān)聯(lián)的染色體分開(kāi)的核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸分子不含在得到所述核酸分子的生物體的基因組DNA 中天然地位于所述核酸分子側(cè)翼的序列(即位于核酸分子5'和3'末端的序列)。也可以使用基于感興趣的核酸分子序列設(shè)計(jì)的合成的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離用于本發(fā)明方法的核酸分子。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA、mRNA 或者基因組DNA作為模板并使用合適的寡核苷酸引物，可以擴(kuò)增用于本發(fā)明方法的核酸分子。此外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如，使用自動(dòng)DNA合成儀，制備對(duì)應(yīng)于感興趣的核苷酸序列的寡核苷酸。也可以制備用于本發(fā)明方法的核酸，例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)化學(xué)合成本發(fā)明的核酸?；瘜W(xué)合成聚脫氧核苷酸的各種方法是已知的， 包括已在市售的DNA合成儀中自動(dòng)化的固相合成(參見(jiàn)，例如，Itakura等人的美國(guó)專(zhuān)利 4，598，049 ；Caruthers 等人的美國(guó)專(zhuān)利 4，458，066 ；和 Itakura 的美國(guó)專(zhuān)利 4，401，796 和 4，373，071，本文引入作為參考)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的試劑是編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸分子。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，cDNA(全長(zhǎng)或部分cDNA序列)被克隆到重組表達(dá)載體中，且該載體被轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。例如，通過(guò)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或通過(guò)篩查合適的cDNA文庫(kù)，可以獲得cDNA。在cDNA分離或擴(kuò)增后，將DNA片段引入合適的表達(dá)載體中。例如，基于編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸分子的核酸序列使用核苷酸序列，可以制備適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該蛋白質(zhì)的形式的、編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子可以存在于誘導(dǎo)型構(gòu)建體中。在另一實(shí)施方式中，核酸分子可以存在于導(dǎo)致組成型表達(dá)的構(gòu)建體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，在缺乏載體的情況下，本發(fā)明的核酸分子可以被遞送到細(xì)胞 (例如神經(jīng)元細(xì)胞)或受試者。在某些實(shí)施方式中，使用病毒載體、優(yōu)選本領(lǐng)域已知其基因治療用途的病毒載體，本發(fā)明的核酸分子可以被遞送到細(xì)胞(例如神經(jīng)元細(xì)胞)或受試者。用于形成載體或病毒體的技術(shù)在〃 Working Toward Human GeneTherapy,"第觀(guān)章， Recombinant DNA,第二版,Watson, J. D.等人，編，New York-Scientific American Books, 第 567-581 頁(yè)(1992)中有概括描述。Wilson, J. Μ.，Clin. Exp. Immunol. 107(Suppl. 1) 31-32 (1997), 以及 Nakanishi, Μ. , Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systemsl2 263-310(1995) ；Robbins，P. D.，等人，Trends Biotechnol. 16 :35-40 (1998) ；Zhang，J.，等人，Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401 (1996)；禾口 Kramm，C. Μ.，等人，Brain Pathology 5:345-381(1995)中提供了對(duì)于合適的病毒載體或病毒體的概述。這樣的病毒載體可以從含有 RNA 的病毒(Vile，R. G.，等人，Br. Med Bull. 51 :12-30(1995))或含有 DNA 的病毒(Ali M.，等人，Gene Ther. 1 :367-384(1994))衍生。用于基因治療且因此適用于本發(fā)明的病毒載體系統(tǒng)的例子包括以下系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Vile, R.G.，同上；美國(guó)專(zhuān)禾Ij 5，741，486 和 5, 763, 242)；腺病毒(Brody, S. L.，等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 716 :90-101 (1994) ；Heise, C.等人，Nat. Med. 3 :639-645 (1997))； 腺病毒 / 逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合體(Bilbao, G.，等人，F(xiàn)ASEB J. 11 =624-634(1997) ；Feng, Μ.， 等人，Nat. Biotechnol. 15 :866-870(1997))；腺伴隨病毒(Flotte, T. R.和 Carter, B. J.， Gene Ther. 2 :357-362(1995)；美國(guó)專(zhuān)利 5，756，283)；單純皰疹病毒 I 或 II (Latchman， D. S. , Mol. Biotechnol. 2 179-195 (1994)；美國(guó)專(zhuān)利 5，763，217 ;Chase，M.，等人， NatureBiotechnol. 16 :444-448(1998)) ;_/]、__ (Shaughnessy, Ε.,等)κ, Semin Oncol. 23 :159-171 (1996))；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(Donburg, R.，Gene Therap. 2 301-310(1995))。染色體外的復(fù)制載體也可以用于本發(fā)明的基因治療方法。這樣的載體在Calos, M. P. (1996)TrendsGenet. 12 :463-466中有描述，本文引入其全部?jī)?nèi)容作為參考?？梢杂米骰蜻f送的載體的其他病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、乳頭瘤病毒、痘苗病毒、 慢病毒、以及結(jié)合了兩種或多種病毒的有利特征的雜合或嵌合載體(Nakanishi，Μ. (1995) Crit. Rev. Therapeu. Drug CarrierSystems 12 :263-310 ；Zhang, J.,等人(1996) Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401 Jacoby, D. R.，等人(1997) Gene Therapy 4 :1281-1283)。。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的方法的病毒載體是AAV載體。在特定的實(shí)施方式中，病毒載體是AAV2/5或AAV2/8載體。這種載體在例如美國(guó)專(zhuān)利7，056，502中有描述，本文引入其全部?jī)?nèi)容作為參考。載體包括一種或多種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，其選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。合適的啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV) 啟動(dòng)子和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他病毒和真核細(xì)胞啟動(dòng)子。用于治療目的的基因治療載體的構(gòu)建及其引入患病動(dòng)物的指導(dǎo)原則，可以從上述出版物以及美國(guó)專(zhuān)利 5，631，236,5, 688，773,5, 691，177,5, 670，488,5, 529，774,5, 601，818 和PCT公開(kāi)WO 95/06486中獲得，本文引入其全部?jī)?nèi)容作為參考。—般來(lái)說(shuō)，感興趣的細(xì)胞的病毒感染方法是本領(lǐng)域已知的。該病毒可以接觸感興趣的神經(jīng)元細(xì)胞，或者可選擇地，可以被注射進(jìn)入患有神經(jīng)變性性疾病的受試者。本文所述的核酸(例如，載體DNA)可以通過(guò)本領(lǐng)域的任何合適的方法遞送。例如， 遞送可以通過(guò)注射(例如，玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射)、基因槍?zhuān)ㄟ^(guò)將核酸應(yīng)用在凝膠、油或乳膏中，通過(guò)電穿孔，利用脂基轉(zhuǎn)染試劑，或通過(guò)任何其他合適的轉(zhuǎn)染法。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指向宿主細(xì)胞引入外來(lái)核酸(例如DNA) 的本領(lǐng)域公認(rèn)的各種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、 脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(例如，使用市售試劑，例如LIPOFECTIN (Irwitrogen Corp.，San Diego, CA)、LIPOFECTAMINE (Invitrogen)、FUGENE (Roche Applied Science, Basel, Switzerland) > JETPEI (Polyplus-transf ection Inc. , New York, NY)、EFFECTENE (Qiagen, Valencia, CA)、DREAMFECT (( Biosciences，F(xiàn)rance)等)、 或電穿孔(例如，在體內(nèi)電穿孔)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適的方法可以在Sambrook，等人(MolecularCloning :A Laboratory Manual.第二片反，Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.，1989)禾口其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。本發(fā)明的核酸分子可以被插入載體中和用作基因治療載體?；蛑委熭d體可以遞送到受試者，例如，通過(guò)靜脈注射、局部施用(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5，3 ，470)、立體定向注射(參見(jiàn)，例如，Chen 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 :30 )，或通過(guò)體內(nèi)電穿孔(參見(jiàn)，例如，Matsuda 和 C印ko Q007) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 104 :1027)?；蛑委熭d體的藥物制劑可以包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，也可以包括包埋有基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。另外，當(dāng)可以完全由重組細(xì)胞產(chǎn)生完整的基因遞送載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)時(shí)，藥物制劑可以包含一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞?？梢允褂糜糜诤怂徇f送的任何合適的病毒，包括但不限于，腺病毒、腺伴隨病毒、 逆轉(zhuǎn)錄病毒等。例如，LIA逆轉(zhuǎn)錄病毒可以用于遞送核酸(C印ko等人(1998)Curr. Top. Dev. Biol. 36 :51 ；Dyer 和 C^pko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。病毒滴度可能會(huì)變化，以改變表達(dá)水平。病毒滴度可以在任何合適的范圍內(nèi)。例如，病毒滴度可以具有大約IO5Cfu/ ml、106cfu/m、107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml、1010cfu/ml、10ncfu/ml 或更高的上限。病毒滴度可以具有大約 1013cfu/ml、1012cfu/ml、10ncfu/ml、1010cfu/ml、109cfu/ml、108cfu/ml、 107cfu/mlU06cfu/ml或更低的下限。通常，病毒滴度范圍為大約106cfu/ml至108cfu/ml。 更通常，范圍為大約107cfu/ml至108cfu/ml。待增加的病毒的量也可能是變化的。增加的病毒或其他核酸和試劑的量可以在任何合適的范圍內(nèi)。例如，該量可以具有大約ΙΟΡμΙ、 200μ ,300μΚ 400μΚ 50()μ1、750μ 、ιοοομ Ι、125()μ1、Ι500μ 1 或更高的上限。 該量可以具有大約125Ρμ1、1000 μ 1,750 μ 1、500μ 1、400μ 1,300 μ 1,200 μ 1、100μ 1、 50μ 1、25μ 1或更低的下限。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)用于一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分在原核或真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如，一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分可以在細(xì)菌細(xì)胞(諸如大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞進(jìn)一步在Goeddel，Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中討論。另夕卜， 重組表達(dá)載體可以在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶。原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)最經(jīng)常使用含有引導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體在大腸桿菌中進(jìn)行。融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)、通常向重組蛋白的氨基末端添加許多氨基酸。這樣的融合載體通常具有三個(gè)目的1)增加重組蛋白的表達(dá)；幻增加重組蛋白的溶解度，和幻通過(guò)在親和純化中作為配體來(lái)幫助重組蛋白的純化。通常，在融合表達(dá)載體中，在融合部分和重組蛋白的連接處引入蛋白水解切割位點(diǎn)，使得融合蛋白純化后重組蛋白能夠與融合部分分離。這樣的酶及其同源識(shí)別序列，包括)(a 因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Wiarmacia BiotechInc ；Smith, D. B.禾口 Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31-40) ；pMAL(NewEngland Biolabs, Beverly, ΜΑ)；和pRIT5 (Pharmacia，Piscataway, N. J.)，它們分別向目標(biāo)重組蛋白上融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A。在另一實(shí)施方式中，HDAC和/或HIFl α蛋白質(zhì)和/或其部分的表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的載體的例子包括 pYepSecl(Baldari, et.al. , (1987)EMBO J. 6 :229-234) ；pMFa(Kurjan 禾口 Herskowitz， (1982)Cell 30:933-943) ；ρJRY88 (Schultz 等人，(1987)Gene 54:113-123)； pYES2 (InvitrogenCorporation, San Diego, Calif.)禾口 picZ (Invitrogen Corporation)。另外，使用桿狀病毒載體，可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)HDAC和/或HIFl α蛋白質(zhì)和 /或其部分?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括 pAc 系歹Ij (Smith 等人(1983)Mol. Cell Biol. 3 :2156-2165)和 pVL 系歹lj (Lucklow 禾口 Summers(1989)Virology 170:31-39)。在再另一實(shí)施方式中，使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed，B. (1987) Nature 329 :840)和 pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMB0 J. 6 :187-195)。當(dāng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)控元件提供。例如，常用的啟動(dòng)子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對(duì)于原核和真核細(xì)胞的其他合適的表達(dá)系統(tǒng)參見(jiàn)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh, Ε. F.和Maniatis， Τ. Molecular Cloning :ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. , 1989 的第 16禾口 17章。在另一實(shí)施方式中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠優(yōu)先在特定細(xì)胞類(lèi)型中引導(dǎo)核酸表達(dá)(例如，組織特異性調(diào)控元件用來(lái)表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)控元件是本領(lǐng)域已知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性的例子包括視網(wǎng)膜細(xì)胞類(lèi)型特異的啟動(dòng)子(例如，視紫紅質(zhì)調(diào)控序列 Cabp5、Cralbp, Nrl、Crx, Ndrg4、簇蛋白、feix、Hesl 等(Matsuda 和 C印ko，同上))，白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性的，Pinkert等人(1987)Genes Dev. 1 :268)，淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton(1988)Adv. Immunol. 43 :235)，尤其是T細(xì)胞受體的啟動(dòng)子(Winoto和Baltimore (1989) EMBO J. 8 :729)和免疫球蛋白的啟動(dòng)子(Banerji等人 (198 Cell 33 :729 ；Queen 和 Baltimore (1983) Cell 33 :741)，神經(jīng)元特異性的啟動(dòng)子 (例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne 和 Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 :5473)，胰腺特異性的啟動(dòng)子(Edlund等人(1985)kience 230 :912)，和乳腺特異性的啟動(dòng)子(例如， 乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利4，873，316和歐洲申請(qǐng)沈4，166)。也包含發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，例如， 小鼠hox啟動(dòng)子(Kessel和Gruss (1990) kienceM9 :374)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes和 Tilghman(1989)Genes Dev. 3 :537)。本發(fā)明的另一方面涉及已引入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文可以互換使用。可以理解，這些術(shù)語(yǔ)不僅指特定的受試細(xì)胞， 也指這種細(xì)胞的后代或可能的后代。因?yàn)榭赡苡捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而在后代出現(xiàn)某些修飾，這種后代可能實(shí)際上不與親代細(xì)胞相同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分可以在細(xì)菌細(xì)胞(諸如大腸桿菌)、病毒細(xì)胞(諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。也提供了用于確定調(diào)節(jié)劑的篩選分析，所述調(diào)節(jié)劑即候選或測(cè)試化合物或藥物 (例如，肽類(lèi)、環(huán)肽類(lèi)、擬肽類(lèi)、小分子類(lèi)、有機(jī)小分子類(lèi)或其他藥物)，它們對(duì)于本文所述的一種或多種蛋白質(zhì)或其部分(例如，一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分) 具有刺激或抑制效果。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“小的有機(jī)分子”指具有以下分子量的自然存在的或合成的有機(jī)分子超過(guò)大約25道爾頓且小于大約3000道爾頓，通常小于大約2500道爾頓，更通常小于大約2000道爾頓，通常為大約100至大約1000道爾頓，更通常為大約200至大約500道爾頓。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于篩選候選或測(cè)試化合物的試驗(yàn)，所述化合物是本文所述的一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的底物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于篩選候選或測(cè)試化合物的試驗(yàn)，所述化合物結(jié)合或調(diào)節(jié)本文所述的一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的活性。使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)方法中的許多方法之一，可以獲得本發(fā)明的測(cè)試化合物，所述組合文庫(kù)方法包括生物文庫(kù)、空間尋址平行固相或溶液相文庫(kù)、需要去卷積的合成文庫(kù)方法、“一珠一化合物”文庫(kù)方法和使用親和色譜法選擇的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)方法限于肽庫(kù)，而其他4種方法適用于化合物的肽、非肽類(lèi)低聚物或小分子文庫(kù)(Lam， K.S. (1997)Anticancer Drug Des. 12 :145)。本文所述的測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分、和/ 或編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列，可以摻入適于施用的藥物組合物中。這樣的組合物通常包含核酸分子或蛋白質(zhì)和藥學(xué)可接受的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”意在包括與藥品施用相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。這些用于藥用活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑，考慮它們?cè)诮M合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入組合物中。在本發(fā)明的一方面，治療性核酸分子或含有它的載體采取含有藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物的形式。如本文所用，“藥學(xué)可接受的載體”包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體適于眼內(nèi)、腸胃外、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部或肌肉內(nèi)施用。在另一實(shí)施方式中，載體適于口服。藥學(xué)可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散體和用于即時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。這些用于藥用活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。除了與基因治療載體不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑，考慮它們?cè)诒景l(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入組合物中。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物以可注射組合物的形式施用。載體可以制備為可注射的液體溶液或懸浮液。制劑也可乳化。合適的賦形劑是，例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果需要，制劑可能含有少量的輔助物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑、佐劑或免疫增強(qiáng)劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，核酸分子和/或載體可以摻入適于眼內(nèi)施用的組合物。例如，組合物可以被設(shè)計(jì)用于玻璃體內(nèi)、結(jié)膜下(subconjuctival)、眼球筋膜下(sub-tenon)、眼周、眼球后、脈絡(luò)膜上、和/或鞏膜內(nèi)施用，例如，通過(guò)注射，以有效地治療視網(wǎng)膜疾病。此外，縫合的或可再裝的圓頂(dome)可以放置在施用部位上，以防止或減少活性劑以非優(yōu)選方向“洗出”、濾出和/或擴(kuò)散。如本文所述，相對(duì)高粘度的組合物可用于提供有效的、優(yōu)選基本上持續(xù)的核酸分子和/或載體的遞送，例如，通過(guò)注射到眼后段。粘度誘導(dǎo)劑可以用于維持核酸分子和/或載體處于理想的懸浮形式，從而防止組合物沉積于眼睛的底部表面。這種組合物可以按照美國(guó)專(zhuān)利5，292, 724所述來(lái)制備，其完整內(nèi)容通過(guò)引入作為參考。通過(guò)將適當(dāng)溶劑中的所需量的本文所述的測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或 HIFl α蛋白和/或其部分、和/或編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列與上述的一種或多種成分合并，(如需要)接著過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌注射溶液。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)將活性化合物摻入包含基本分散介質(zhì)和需要的上述其他成分的無(wú)菌載體中來(lái)制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，該方法由先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何其他所需的成分的粉末?？诜M合物一般包含惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以被封入明膠膠囊或壓縮成片。出于口服治療施用的目的，活性成分可以與賦形劑合并，并以片劑、錠劑、或膠囊形式使用。也可以使用用作漱口水的流體載體來(lái)制備口服組合物，其中，流體載體中的化合物經(jīng)口服應(yīng)用，漱口并吐出或吞咽?？梢园帉W(xué)相容的粘合劑和/或輔助材料作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以包含任何以下成份或性質(zhì)類(lèi)似的化合物粘合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如淀粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂或^erotes ；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙香味。在一個(gè)實(shí)施方式中，用載體制備本文所述的測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或 HIFl α蛋白和/或其部分、和/或編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列，所述載體保護(hù)化合物免受身體的迅速消除，諸如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到?、生物相容性的聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。這類(lèi)制劑的制備方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是明顯的。該材料也可以從Alza Corporation and Nova PharmaceuticalsJnc商購(gòu)取得。 脂質(zhì)體懸浮液(包括應(yīng)用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，美國(guó)專(zhuān)利4，522，811 所述的方法。鼻組合物一般包括鼻噴劑和吸入劑。鼻噴劑和吸入劑可以包含一種或多種活性成分和賦形劑諸如防腐劑、粘度調(diào)節(jié)劑、乳化劑、緩沖劑等。鼻噴劑可以向鼻腔應(yīng)用，用于局部和/或全身應(yīng)用。鼻噴劑可以通過(guò)適于遞送計(jì)量的活性成分的非加壓分散器分散。鼻吸入劑通過(guò)口服吸入遞送到肺部，用于局部和/或全身應(yīng)用。鼻吸入劑可以通過(guò)用于遞送計(jì)量的一種或多種活性成分的密閉容器系統(tǒng)分散。在一個(gè)實(shí)施方式中，鼻吸入劑與氣霧劑一起使用。這可以通過(guò)制備含化合物的水噴霧劑、脂質(zhì)體制劑或固體顆粒來(lái)完成?？梢允褂梅撬?如氟碳拋射劑)懸浮液?？梢允褂寐暡▏婌F器(sonicnebulizer)以盡量減少將試劑暴露于可導(dǎo)致化合物降解的剪切。
通常情況下，通過(guò)將試劑的水溶液或懸浮液與常規(guī)藥學(xué)可接受的載體和穩(wěn)定劑一起配制來(lái)制備水性氣溶膠。載體和穩(wěn)定劑隨具體化合物的要求而變化，但通常包括非離子表面活性劑(吐溫、Pluronics或聚乙二醇)、無(wú)害的蛋白質(zhì)類(lèi)如血清白蛋白、山梨醇酐酯、 油酸、卵磷脂、氨基酸類(lèi)諸如甘氨酸、緩沖液類(lèi)、鹽、糖或糖醇。氣霧劑一般是從等滲溶液制備。全身施用也可以通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方法實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，在制劑中使用適用于待透過(guò)的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑是本領(lǐng)域公知的，且包括，例如，用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)使用鼻噴劑或栓劑實(shí)現(xiàn)經(jīng)粘膜施用。 對(duì)于經(jīng)皮施用，將活性化合物制成本領(lǐng)域公知的軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。也可以以用于直腸遞送的栓劑(例如，使用傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，諸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備本文所述的測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或HIFl α 蛋白和/或其部分、和/或編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列。以易于施用和劑量均勻的劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物是特別有利的。 本文使用的劑量單位形式指適合作為用于待治療的受試者的單一劑量的物理離散的單位， 每個(gè)單位包含與所需藥物載體結(jié)合的預(yù)定量的活性化合物，該量被計(jì)算為產(chǎn)生需要的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由以下因素規(guī)定并直接取決于它們活性化合物的獨(dú)特特性、待達(dá)到的特定療效和本領(lǐng)域中固有的組合用于個(gè)體治療的活性化合物的限制?？梢酝ㄟ^(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中，使用標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序，確定本文所述的測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分、和/或編碼一種或多種HDAC 和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列的毒性和治療效果，例如，確定LD50(群體的 50%致死的劑量)和ED50(群體的50%治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)，它可以表示為比例LD50/ED50。顯示大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。雖然可以使用顯示毒副作用的化合物，但應(yīng)注意設(shè)計(jì)將這種化合物靶向受影響的組織的部位的遞送系統(tǒng)，以盡量減少對(duì)于未受感染的細(xì)胞的潛在的損害，從而減少副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)分析和/或動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制一系列的用于人類(lèi)的劑量。劑量通常位于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，其包括有很少或沒(méi)有毒性的ED50。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，取決于所用的劑型和所用的施用途徑。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，可以從細(xì)胞培養(yǎng)分析初步估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量，以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可以被用來(lái)更準(zhǔn)確地確定人類(lèi)有用的劑量。可以測(cè)定血漿中的水平，例如， 通過(guò)高效液相色譜法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及一種治療神經(jīng)變性性疾病(例如，視網(wǎng)膜神經(jīng)變性性疾病)的方法，包括向受試者施用治療有效量的試劑的步驟，例如，一種或多種測(cè)試化合物、一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其突變體和/或其部分、和/或編碼一種或多種HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其突變體和/或其部分的核酸序列。在本發(fā)明的某些方面，眼睛的神經(jīng)變性性疾病與視錐細(xì)胞的活力降低相關(guān)。在本發(fā)明的其他方面，眼睛的神經(jīng)變性性疾病與視桿細(xì)胞的活力降低相關(guān)。在另外的方面，眼睛的神經(jīng)變性癥是遺傳疾病。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)向受試者“施用，，包括通過(guò)可向受試者的所需位置遞送組合物的任何合適的途徑，向受試者分配、遞送或應(yīng)用組合物，包括通過(guò)眼內(nèi)(視網(wǎng)膜下或玻璃體下)施用或靜脈內(nèi)施用進(jìn)行遞送。可選擇地或結(jié)合起來(lái)，遞送是通過(guò)局部、腸胃外或口服途徑、腦內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、皮下/皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、口腔施用、經(jīng)皮施用和通過(guò)直腸、 結(jié)腸、陰道、鼻內(nèi)或呼吸道途徑施用。一般情況下，提供治療有效量的試劑(例如，核酸分子)，以引起理想效果，例如， 抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡。待施用的載體的量，根據(jù)治療的次數(shù)和量，也取決于其他因素，例如待治療的受試者的臨床狀態(tài)、年齡和重量，以及該病癥的嚴(yán)重性。需要進(jìn)行施用的活性成分的精確量取決于基因治療專(zhuān)家的判斷，并且對(duì)于每個(gè)個(gè)體患者是特定的。一般來(lái)說(shuō)，以每毫升大約IxlO5至大約IxlO9菌落形成單位(cfu)的滴度施用病毒載體，雖然范圍可能會(huì)變化。優(yōu)選滴度范圍為大約IxlO6至大約lxl08Cfu/ml。試劑的治療有效量(即，有效劑量)可以為大約0. 001至30毫克/千克體重，優(yōu)選大約0. 01至25毫克/千克體重，更優(yōu)選大約0. 1至20毫克/千克體重，甚至更優(yōu)選大約1至10毫克/千克、2至9毫克/千克、3至8毫克/千克、4至7毫克/千克或5至6 毫克/千克體重。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，某些因素可能會(huì)影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、以前的治療、受試者的一般健康和/或年齡和其他現(xiàn)有的疾病。此外，用治療有效量的試劑治療受試者可以包括單一的治療，或優(yōu)選地，可以包括一系列治療。也可以理解，用于治療的抑制劑的有效劑量可能會(huì)在特定療程中增加或減少。劑量的變化可能是由于本文所述的診斷分析的結(jié)果。藥物組合物可以與施用說(shuō)明書(shū)一起包括在容器、包裝或分散器中。在一個(gè)實(shí)施方式中，用攜帶所需的核酸分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系， 以形成生產(chǎn)者細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，包括，例如，電穿孔、 CaPO4沉淀、或使用脂質(zhì)體?？赡苻D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于B0SC23、Bing、PE501、 PA317、Ψ-2、Ψ-ΑΜ、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、Ψ-CRE, Ψ—CRIP、GP+E86、GP+envAml2 和DAN細(xì)胞系。關(guān)于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞和如何構(gòu)建它們的指導(dǎo)原則可以從以下文獻(xiàn)中獲得Short 等人，J. Neurosci. Res. 27 :427-433 (1990) ；Miller, A. D.，Human Gene Ther.1 :5-14(1990) ；Danos, 0, “ Construction ofRetroviral Packaging Cell Lines," in Methods in Molecular Biology(M. Collins,編)，第 8 卷，The Humana Press Inc.，Clifton, N. J.，17-26 (1991) ；Murdoch, B.，等人，Gene Therapy 4 :744-749(1997)； 及美國(guó)專(zhuān)利5，529，774和5，591，624，本文引入其全部?jī)?nèi)容作為參考逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也已經(jīng)用水泡性口炎病毒(VSV)包膜糖蛋白G( “假型”)成功地包裝。這些載體更穩(wěn)定，且可以濃縮至109cfu/ml，使它們能夠直接注射(Burns，J. C.等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :8033-8037)。生產(chǎn)者細(xì)胞然后可以被移植到所需的位置附近或其中，例如，眼內(nèi)。直接注射高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)者細(xì)胞(Murdoch, B.，等人，Gene Ther. 4 :744-749(1997) ；Onodera, M.，等人，Hum Gene Ther. 8 :1189-1194 (1997))應(yīng)該允許用逆轉(zhuǎn)錄病毒序列有效原位感染 (Rainov, N. G.,等人，Cancer Gene Ther. 3 :99-106(1996) ；Ram, Ζ.,等人，Cancer Res. 53 83-88(1993))。眼內(nèi)注射的生產(chǎn)者細(xì)胞一般不從注射部位遷移。此外，盡管它們可能被宿主排斥，但不會(huì)發(fā)生持續(xù)5-10天，到這一時(shí)間會(huì)發(fā)生附近細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Ram，Z.，等人，J. Neurosurg. 79 :400-407(1993)). 一般情況下，載體生產(chǎn)者細(xì)胞(VPC)劑量范圍為大約2. 5x108VPC至大約lxl09VPC。生產(chǎn)者細(xì)胞的確切量最終由技術(shù)人員根據(jù)許多因素確定，包括但不限于可用的注射量、患者的臨床狀況和該病癥的嚴(yán)重性。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的病毒載體的病毒基因組應(yīng)進(jìn)行修飾，以消除或限制其復(fù)制能力，但是，復(fù)制條件病毒在本發(fā)明中也是有用的，能夠靶向某些細(xì)胞的復(fù)制載體也是有用的。(參見(jiàn)，例如，Zhang, J.等人(1996)Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401)。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種病毒載體用于攜帶多種核酸分子，例如，編碼HDAC4和 HDAC6的基因。在另一項(xiàng)實(shí)施方式中，使用兩種病毒載體，它們各攜帶一種或多種感興趣的基因。如果使用兩種病毒載體，它們可以源自相同或不同類(lèi)型的病毒，且可以同時(shí)或相繼施用(即，不考慮特定的順序)。也可以使用用于基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法，優(yōu)選其在基因療法中的用途為本領(lǐng)域已知的方法來(lái)遞送核酸分子(Nakanishi，M.，Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systems 12 :263-310(1995) ；Abdallah, B.,等 A, Biol Cell 85 :1-7(1995) ；Zhang, J., 等人’ Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401(1996) ；Philips, S. C. , Biologicals 23 :13-16 (1995) ；Lee, R. J. and Huang, L. , Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14 173-206(1997))。這些用于基因遞送的非病毒載體的例子包括原核載體、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物、非病毒T7自身基因(autogene)載體(Chen，X.，等人，Hum. Gene Ther. 9 :7四_736 (1998))、促融脂質(zhì)體、核酸(“裸DNA”)的直接注射、顆?；蚴荏w介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、雜合載體諸如DNA-腺病毒結(jié)合物或包括非病毒和病毒成分的其他分子結(jié)合物、星射狀聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物(starburstpolyamidoamine dendrimers) (Kukowska-Latallo, J. F.,等人，Proc Natl Acad Sci USA 93:4897-4902(1996); Tang, Μ· X.，等人，Bioconjug. Chem. 7 :703-714(1996))、陽(yáng)離子肽(ffyman, T. B.，等人， Biochemistry 36 :3008-3017(1997))和哺乳動(dòng)物人工染色體(Ascenzioni，F(xiàn).，等人， Cancer Lett. 118 135-142(1997))。此外，本發(fā)明提供了上述方法的實(shí)施方式，其中，使用任何細(xì)胞載體、優(yōu)選其在基因治療中的應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定的細(xì)胞載體，遞送核酸分子。這些用于基因治療的細(xì)胞載體的例子包括內(nèi)皮細(xì)胞(Rancourt，C.，等人，Clin. Cancer Res. 4 265-270 (1998) ；Qjeifo, J. 0.，等人，Cytokines Mol. Ther. 2 :89-101 (1996))，和巨噬細(xì)胞，包括腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞(Zufferey，R.，等人，Nat. Biotechnol. 15 :871-875(1997)； Naldini, L.，等人，Science 272 :263-267 (1996))，它們可以各自使用病毒或非病毒載體修飾，以攜帶所需的核酸分子，從而表達(dá)所需的基因產(chǎn)物。其他合適的非病毒載體對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。通過(guò)包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列，以實(shí)現(xiàn)雙順?lè)醋有攀?bicistronic message)上的多個(gè)基因的協(xié)調(diào)表達(dá)，可以提高基因遞送。IRES是含有500_600bp的序列，是小核糖核酸病毒(包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒(EMCV))的5'非轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的典型特征。參見(jiàn)，例如，Ghattas, I. R.，等人，Molecular and Cellular Biologyll 5848-5859(1991) ；Morgan，R. Α.，等人，Nucleic Acids Research20 1293-1299 (1992)。這種方法已被用于白細(xì)胞介素-12的兩個(gè)亞基的高效逆轉(zhuǎn)錄病毒共表達(dá)(Tahara，H.，等人， J. Immunol. 154 :6466-6474(1995))。另一種選擇是，載體含有在不同啟動(dòng)子控制下的多個(gè)基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在癥狀(諸如視桿損失導(dǎo)致的夜盲)發(fā)作前，向患有神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜病癥或處于發(fā)展為神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜病癥的危險(xiǎn)中的受試者(例如，具有神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜疾病家族史的受試者)施用本文所述的試劑。在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方式中，在癥狀(諸如視桿損失導(dǎo)致的夜盲)發(fā)作后，向患有神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜病癥或處于發(fā)展為神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜病癥的危險(xiǎn)中的受試者(例如，具有神經(jīng)變性性視網(wǎng)膜病癥家族史的受試者)施用本文所述的試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，該受試者的視錐是活的?？梢岳斫猓衙枋龅谋景l(fā)明的實(shí)施方式僅僅是例示本發(fā)明的原理的一些應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文的教導(dǎo)作出許多修改，而不背離本發(fā)明的真正精神和范圍。 本文為了所有目的引入本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容作為參考。闡述下面的實(shí)施例作為本發(fā)明的代表。這些實(shí)施例不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍， 且鑒于目前的公開(kāi)內(nèi)容、附圖以及所附的權(quán)利要求，其他相當(dāng)?shù)膶?shí)施方式是明顯的。實(shí)施例下面的材料和方法用于實(shí)施例I-V。動(dòng)物野生型CDl和視網(wǎng)膜變性rdl (FVB染色)小鼠購(gòu)自Charles RiverLaboratory。HDAC4 RNAi和體內(nèi)電穿孔HDAC4 RNAi 靴序列 GGAGATGCTGGCCATGAAGCA (SEQ IDNO :1)被克隆到 pBS/U6 RNAi 構(gòu)建體中(Matsuda 和 C印kc^2004)Proc. Natl. Acad. ki. USA 101:16)。為了產(chǎn)生 HDAC4 RNAi抗性表達(dá)載體，利用簡(jiǎn)并密碼子，使shRNA靶序列突變(突變的核苷酸以小寫(xiě)字母表示)為GGAaATGCTaGCtATGAAaCA(SEQ ID NO :2)。pCAG-HDAC4、pCAG_HDAC6和pCAG-dnHIFl α 構(gòu)建體用于體內(nèi)電穿孔。篩選發(fā)現(xiàn)有效shRNA的方案如前面所述。同上。TUNEL分析、免疫組織化學(xué)和熒光顯微鏡檢查如前所述，進(jìn)行TUNEL分析和免疫組織化學(xué)(Chen和C^pko (2007) BMC Dev. Biol.7:78M24)。使用LEICA TCS SP2共聚焦顯微鏡處理視網(wǎng)膜切片的熒光圖像。使用 Nikon ECLIPSE ElOOO顯微鏡處理鋪片視網(wǎng)膜的熒光圖像。使用的第一抗體HDAC4(Sigma， 1 200)，使用 0. 1 μ g/ μ 1 的 HDAC4 的阻斷肽 MSSQSHPDGLSGRDQPVEL (SEQ ID NO 3)；對(duì)于視紫紅質(zhì)的 Rho4D2( (Molday 和 MacKenzie (1983) Biochemistry22 :653Μ25) 1 100)；活化的胱天蛋白酶 _3(Cell Signaling, 1 200) ；HIFl α (R&DSystems, 1 300)。克隆分析如前所述，使用不能復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒LIA進(jìn)行克隆分析(Cepko等人(1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36 :51 ；Dyer 和 C^pko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。LIA 逆轉(zhuǎn)錄病毒如前所述制備，并具有大約IX 107CfU/ml的滴度。將半微升病毒懸浮液注射到PO小鼠視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙。視網(wǎng)膜在P21被固定，并對(duì)由病毒感染的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞生成的細(xì)胞進(jìn)行AP染色。實(shí)施例I :HDAC的過(guò)度表達(dá)為了檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜的HDAC4表達(dá)，使用單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。在內(nèi)成神經(jīng)細(xì)胞層(INBL)中具有強(qiáng)信號(hào)的Pl視網(wǎng)膜中(圖1A)檢測(cè)HDAC4免疫反應(yīng)性。在INBL中，如用1^x6 ( 一種核蛋白質(zhì))抗體共免疫染色顯示，它主要被從發(fā)育的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞 (AC)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞核排除(圖9)。在由有絲分裂的祖細(xì)胞和新生感光細(xì)胞組成的整個(gè)ONBL中，觀(guān)察HDAC4的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)模式。HDAC4免疫反應(yīng)性在成熟的視網(wǎng)膜中較低(圖 1B)。它在感光細(xì)胞的內(nèi)段(IS)中被檢測(cè)到，但在外段(OS)或位于外核層(ONL)的細(xì)胞體中沒(méi)有檢測(cè)到。在內(nèi)核層(INL)中，在BP細(xì)胞和AC的細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到微弱的免疫反應(yīng)性。 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)和進(jìn)程所在的兩個(gè)叢狀層中，觀(guān)察到核染色。HDAC4的免疫反應(yīng)性是特異性的，因?yàn)樗豢贵w與同源阻斷肽的預(yù)溫育破壞(圖1C，1D)。為了研究HDAC4在體內(nèi)的功能，通過(guò)體內(nèi)電穿孔將具有針對(duì)HDAC4的shRNA的質(zhì)粒(圖 6)電穿孔進(jìn)入 PO 小鼠視網(wǎng)膜(Matsuda 和(^pkoOO(M)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :16)。為了標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，同時(shí)電穿孔質(zhì)粒pCAG-GFP，該質(zhì)粒編碼由具有廣泛活性的啟動(dòng)子CAG驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)。針對(duì)GAPDH的shRNA用作成功的RNA靶向事件的對(duì)照。用GAPDH shRNA電穿孔的視網(wǎng)膜顯示，大部分電穿孔的細(xì)胞是視桿光感受器，小部分為位于INL中的BP細(xì)胞、AC和小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)((同上)和圖2A)。當(dāng)靶向HDAC4時(shí)，GFP+細(xì)胞數(shù)急劇下降(圖I)，在P6極少見(jiàn)到(圖2B)，在P8或以后沒(méi)有觀(guān)察到GFP+細(xì)胞。GFP+ 細(xì)胞的損失表明HDAC4是存活所需要的。觀(guān)察到的RNAi表型不是由于脫靶效應(yīng)，因?yàn)楣搽姶┛椎谋磉_(dá)抗HDAC4 shRNA的HDAC4等位基因的pCAG載體導(dǎo)致出現(xiàn)象GAPDH對(duì)照一樣多的GFP+細(xì)胞(圖2C)。為了進(jìn)一步研究HDAC4 shRNA是否導(dǎo)致細(xì)胞死亡，在P5進(jìn)行TUNEL分析。在用針對(duì)HDAC4的shRNA電穿孔的區(qū)域檢測(cè)到許多TUNEL+細(xì)胞(圖2E)。在同樣的HDAC4 shRNA 電穿孔視網(wǎng)膜的非電穿孔區(qū)域(圖2E)，觀(guān)察到極少數(shù)TUNEL+細(xì)胞(圖2F)，類(lèi)似于在GAPDH shRNA對(duì)照(圖2D)中觀(guān)察到的數(shù)量。只有小部分的TUNEL+細(xì)胞顯示GFP表達(dá)(箭頭，圖 2E)。不打算受限于科學(xué)理論，這種觀(guān)察結(jié)果可能是由于TUNEL只檢測(cè)那些經(jīng)受細(xì)胞凋亡的最后階段的細(xì)胞的事實(shí)。為了檢測(cè)凋亡級(jí)聯(lián)的較早期階段，分析了胱天蛋白酶的活化。用識(shí)別胱天蛋白酶-3的活化(裂解的)形式(在DNA裂解之前具有活性的執(zhí)行胱天蛋白酶) 的抗體對(duì)P5視網(wǎng)膜切片染色。相比GAPDH RNAi對(duì)照(圖2G，21)，在HDAC4 RNAi樣品(圖 2J)中觀(guān)察到更多的具有活化的胱天蛋白酶-3染色的細(xì)胞。HDAC4 RNAi視網(wǎng)膜中的大多數(shù)活化的胱天蛋白酶-3+細(xì)胞是GFP+(箭頭，圖2H)。使用來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的視網(wǎng)膜，對(duì)于HDAC4 RNAi平均有6. 5士 1. 6個(gè)細(xì)胞(每100 μ m切片)被評(píng)分為活化胱天蛋白酶-3+ 的，相比而言，對(duì)于GAPDH RNAi為0.沘士0. 07個(gè)細(xì)胞。通過(guò)將pCAG-HDAC4體內(nèi)電穿孔到PO小鼠視網(wǎng)膜中，實(shí)現(xiàn)HDAC4的過(guò)度表達(dá)。當(dāng)視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生完成時(shí)，在P14收集電穿孔的視網(wǎng)膜(Young(1985)Anat. Rec. 212 :199)。 在對(duì)照pCAG-GFP電穿孔(圖3A)中，超過(guò)80%的GFP+細(xì)胞成為ONL中的光感受器，而大約10%的GFP+細(xì)胞成為INL上半部分中的BP細(xì)胞(Matsuda和Cepko (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16))。然而，當(dāng)過(guò)度表達(dá)HDAC4時(shí)(圖，在被BP細(xì)胞占據(jù)的區(qū)域的 INL中觀(guān)察到更多的GFP+細(xì)胞，且它們的突起延伸到IPL。在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中，過(guò)度產(chǎn)生 BP 細(xì)胞，到 P14 許多被消除(Young(1984) Anat. Rec. 212 :199)。如前所述進(jìn)行TUNEL分析、免疫組織化學(xué)和熒光顯微鏡檢查(Chen和C^pko (2007) BMC Dev.Biol.7 :78)。使用LEICA TCS SP2共聚焦顯微鏡處理視網(wǎng)膜切片的熒光圖像。使用Nikon ECLIPSEE1000顯微鏡處理鋪片視網(wǎng)膜的熒光圖像。使用如下的第一抗體HDAC4 (Sigma;原液以1 200稀釋供使用)；使用0. 1 μ g/μ 1的HDAC4的阻斷肽 MSSQSHPDGLSGRDQPVEL (SEQ ID NO 3)；對(duì)于視紫紅質(zhì)的 Rho4D2 ((MacKenzie (1983) Biochemistry 22 :653)；原液以1 100稀釋供使用)；活化的胱天蛋白酶-3 (Cell Signaling，原液以1 200稀釋供使用)；和HIFl α (R&D Systems，原液以1 300稀釋供
使用)。實(shí)施例II =HDAC的表達(dá)改善感光細(xì)胞的存活通過(guò)電穿孔的HDAC4表達(dá)抑制視桿光感受器的死亡。在PO小鼠視網(wǎng)膜的電穿孔導(dǎo)致許多視桿的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但視錐很少(Matsuda 和(^pkoOO(M)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 16)。進(jìn)行pCAG-HDAC4或pCAG-HDAC6向PO視網(wǎng)膜中的電穿孔。HDAC6包括在特異性試驗(yàn)中，因?yàn)樗罱驯蛔C明能夠救治果蠅(Drosophila)中的視網(wǎng)膜變性(^iao等人Q001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。在P50收集視網(wǎng)膜，這一時(shí)間點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)視桿在對(duì)照、未處理的 rdl視網(wǎng)膜中死亡的時(shí)間。用抗視紫紅質(zhì)(一種視桿特異性的標(biāo)記)的抗體對(duì)鋪片視網(wǎng)膜染色。在由共電穿孔的PCAG-GFP標(biāo)記的轉(zhuǎn)染區(qū)中(圖4A，B)，許多視桿被HDAC4拯救(圖 4D)而不被HDAC6拯救(圖4C)。作為對(duì)于視桿存在的另外的分析，使用視紫紅質(zhì)的報(bào)告質(zhì)粒 Rho-DsRed 檢測(cè)紫紅質(zhì)啟動(dòng)子的活性(Matsuda 和 C^pko (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :16)，該質(zhì)粒中2. 2kb的視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsRed (—種紅色熒光蛋白)的表達(dá)。 Rho-DsRed與pCAG-HDAC4共電穿孔進(jìn)入PO rdl視網(wǎng)膜。在P70收獲的組織顯示，由抗視紫紅質(zhì)免疫組織化學(xué)(圖41)標(biāo)記的視桿，在GFP標(biāo)記的電穿孔的區(qū)域(圖4H)中表達(dá)視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子(圖4J)。HDAC6-電穿孔的視網(wǎng)膜(圖4E)沒(méi)有表現(xiàn)出視紫紅質(zhì)免疫反應(yīng)性細(xì)胞(圖4F)，也沒(méi)有視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子活性(圖4G)。對(duì)于HDAC4處理的視網(wǎng)膜，每100 μ m切片平均評(píng)分24. 3士7. 2個(gè)視紫紅質(zhì)+細(xì)胞，在HDAC6電穿孔的視網(wǎng)膜(圖4K)或HDAC4處理的非電穿孔區(qū)域中，觀(guān)察到O個(gè)視紫紅質(zhì)+細(xì)胞。HDAC6沒(méi)有拯救患病的視桿光感受器的死亡。然而，HDAC6在保護(hù)雙極細(xì)胞免受rdl視網(wǎng)膜(圖4E，4H)以及野生型視網(wǎng)膜(圖 7)中自然發(fā)生的細(xì)胞死亡方面如同HDAC4—樣有效。視錐光感受器的存活取決于視桿光感受器的存活，因此HDAC4處理的視網(wǎng)膜也具有更多的視錐光感受器是可能的。在P70收集HDAC4電穿孔的視網(wǎng)膜(圖40)，并用標(biāo)記視錐的花生凝集素(PNA)染色。相比HDAC6電穿孔的視網(wǎng)膜(圖4L-4N)，HDAC4明顯增加了具有拯救的視桿的區(qū)域(圖4P)的視錐密度(圖4Q)。只在HDAC4電穿孔的區(qū)域觀(guān)察到增加的視錐密度(圖4R-4T)。實(shí)施例III 過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)HDAC防止視桿感光細(xì)胞的損失HDAC4主要在野生型鼠光感受器的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)(圖1B，4U，4X)。測(cè)試細(xì)胞質(zhì) HDAC4對(duì)于光感受器存活的效應(yīng)。HDAC4-L175A是不與MEF2轉(zhuǎn)錄因子相互作用因此停留在細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞質(zhì)突變體。也測(cè)試位于核中的突變體HDAC-3SA。HDAC-3SA突變體的3 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，這將導(dǎo)致突變體停留在核中(Vega等人QO(M)Cell 119 555 ；Zhao等人(2001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。將這些等位基因的每個(gè)電穿孔進(jìn)入 PO的rdl小鼠視網(wǎng)膜，且通過(guò)抗視紫紅質(zhì)免疫組織化學(xué)分析視桿光感受器的存活。細(xì)胞質(zhì) HDAC4-L175A突變體保留rdl桿體至少到P70 (圖4V，4Y)。核HDAC4-3SA突變體未能拯救甚至直到P50 (圖4W，4Z)。因此，細(xì)胞質(zhì)HDAC4-L175A有效防止視桿感光細(xì)胞損失。實(shí)施例IV =HIFl α蛋白質(zhì)和視網(wǎng)膜細(xì)胞變性
HIFla蛋白質(zhì)在氧動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用(Semenza(2000) J. Appl. Physiol. 88 :1474 ；Semenza(2006)Exp. Physiol. 91 :803)，并參與與代謝、血管生成、紅細(xì)胞生成、糖酵解、心血管發(fā)育和系統(tǒng)O2動(dòng)態(tài)平衡(GENEATLAQ有關(guān)的基因的活化。在正常情況下，HIFl α蛋白質(zhì)在成熟的小鼠視網(wǎng)膜中不能檢測(cè)到。低氧預(yù)處理可穩(wěn)定HIFl α并保護(hù)光感受器免于光致視網(wǎng)膜變性(Grimm等人Q002)Nat. Med. 8 :718)。HIFl α蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性通過(guò)賴(lài)氨酸乙酰化調(diào)節(jié)。乙酰轉(zhuǎn)移酶ARDl對(duì)HIFl α的乙酰化提高其泛素化和蛋白酶體降解(Jeong等人(2002) Cell 111 :709)。為了測(cè)試HDAC是否能夠穩(wěn)定HIFl α，在PO將 HDAC4和HDAC6各電穿孔進(jìn)入野生型或rdl視網(wǎng)膜。在成熟的視網(wǎng)膜上進(jìn)行對(duì)于HIFl α的免疫組織化學(xué)方法。在野生型光感受器的OS中檢測(cè)到HIFl α蛋白質(zhì)(圖5Α，5Β)，但只是在電穿孔的區(qū)域(圖5C，5D)。在HDAC6電穿孔之后沒(méi)有檢測(cè)到HIFl α的免疫反應(yīng)性(圖 5E，5F)。同樣，HDAC4但不是HDAC6(圖5I，5J)導(dǎo)致HIFl α蛋白質(zhì)出現(xiàn)在rdl視網(wǎng)膜的光感受器的核/核周(圖5G，5H)。為了研究rdl小鼠中的HDAC4介導(dǎo)的光感受器拯救是否需要HIFl α，占優(yōu)勢(shì)的陰性 HIFl α (dnHIFl α )構(gòu)建體(Jiang 等人(I"6) J. Biol. Chem. 271 :17771)與 pCAG_HDAC4 在PO共電穿孔進(jìn)入rdl視網(wǎng)膜，并在P70通過(guò)抗視紫紅質(zhì)監(jiān)測(cè)感光器的存活。盡管單獨(dú)的 HDAC4導(dǎo)致光感受器的保護(hù)(圖5K，5L)，但dnHIFl α消除了 HDAC4的光感受器存活效應(yīng) (圖 5Μ，5Ν)。為了進(jìn)一步研究HIFl α的乙酰化是否可以在拯救rdl視網(wǎng)膜中的視桿細(xì)胞死亡方面發(fā)揮作用，通過(guò)在PO在體內(nèi)電穿孔進(jìn)入rdl視網(wǎng)膜來(lái)測(cè)試比其野生型更穩(wěn)定的 HIFl α的組成型活性乙酰突變體HIFlaK532R(Jeong等人QO(^)Cell 111 :709)和野生型HIFla。通過(guò)在P70共電穿孔的I^ho-DsRed監(jiān)測(cè)視桿光感受器的存活。通過(guò)計(jì)數(shù)每 100 μ m切片的Rho+細(xì)胞數(shù)量化HIFl a、HIFl a K532R和HDAC4的存活效應(yīng)(圖81)。雖然對(duì)照GFP電穿孔沒(méi)有檢測(cè)到視桿(圖8々，8幻，但野生型!1正1(1保護(hù)了少量視桿(圖8B， 8F)。HIFl a K532R比野生型HIFl α拯救更多的視桿(圖8C，8G)。HDAC4在拯救視桿光感受器方面最有效(圖8D，8H)。不受限于科學(xué)理論，HDAC4相比HIFl a K532R更大的效力可能是由于HDAC4具有除了 HIFl α之外的靶標(biāo)，或者可能是這樣的情況HIF1 a K532R不象 HDAC4介導(dǎo)的去乙?；驢IFl α的野生型等位基因那樣有效。實(shí)施例V 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的HDAC4的表達(dá)保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞免于細(xì)胞死亡進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒譜系分析，以研究增多的HDAC4蛋白質(zhì)是否保護(hù)雙極(BP)細(xì)胞。 如圖3C中所示，以前的譜系分析表明，PO視網(wǎng)膜祖細(xì)胞能產(chǎn)生視桿光感受器和BP細(xì)胞，以及許多克隆只有單視桿。許多BP細(xì)胞自然死亡；因此，可能一些僅有視桿的克隆是由于最初具有視桿和BP 細(xì)胞的克隆的BP細(xì)胞損失。如果HDAC4的表達(dá)能防止雙極細(xì)胞死亡，用編碼HDAC4的譜系追蹤逆轉(zhuǎn)錄病毒感染應(yīng)該導(dǎo)致具有BP細(xì)胞的克隆增加，以及具有單視桿的克隆減少。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，使用表達(dá)HDAC4的不能復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒LIA進(jìn)行克隆分析。使用不能復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒LIA的分析如前所述進(jìn)行(Cepko等人(1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36 51 ；Dyer, C. L. Cepko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。LIA 逆轉(zhuǎn)錄病毒如前所述制備，并具有大約lX107cfu/ml的滴度。將半微升病毒懸浮液注射到PO小鼠視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙。 視網(wǎng)膜在P21被固定，并對(duì)于由病毒感染的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞生成的細(xì)胞進(jìn)行AP染色。在P0，在體內(nèi)用對(duì)照LIA病毒和包含HDAC基因的病毒(LIA-HDAC4)感染視網(wǎng)膜。在P21收集組織，并分析克隆中的細(xì)胞數(shù)量和類(lèi)型(圖3D)。僅含有視桿細(xì)胞的克隆(圖3E)減少大約 13%，從對(duì)照LIA感染的61. 2%降至LIA-HDAC4感染的47. 9%。與此同時(shí)，相比LIA克隆的5. 7%,LIA-HDAC4克隆中含有1個(gè)視桿加1個(gè)BP(圖3F)的克隆的百分比增加大約2倍 (14. 9% )。含有2個(gè)視桿加1個(gè)BP的克隆數(shù)也統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地增加，從LIA感染的3. 4%升至LIA-HDAC4感染的5. 7%。當(dāng)1個(gè)視桿加1個(gè)BP與2個(gè)視桿加1個(gè)BP這兩類(lèi)一起添加時(shí)，包含BP的總克隆從LIA感染的9. 增加至LIA-HDAC4感染的20.6%。這些結(jié)果與BP 細(xì)胞的存活增加一致，并且與HDAC4 RNAi治療的發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)，這兩者在本文中都進(jìn)一步說(shuō)明。以下總結(jié)了實(shí)施例I-IV的結(jié)果。使用小鼠視網(wǎng)膜作為檢驗(yàn)HDAC4的體內(nèi)功能的模型系統(tǒng)，人們發(fā)現(xiàn)，HDAC4在神經(jīng)元存活方面起著至關(guān)重要的作用。RNAi引起的HDAC4減少導(dǎo)致通過(guò)胱天蛋白酶_3活化途徑的廣泛的凋亡細(xì)胞死亡。HDAC4的過(guò)度表達(dá)拯救BP細(xì)胞免于自然發(fā)生的細(xì)胞死亡。更重要的是，從治療的角度來(lái)看，HDAC4拯救rdl小鼠中的光感受器免于死亡。使用編碼限制在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的蛋白質(zhì)的HDAC4的等位基因，HDAC4的促進(jìn)存活功能被證明是由細(xì)胞質(zhì)HDAC4介導(dǎo)的。雖然核HDAC4不能救治視網(wǎng)膜變性，但是以其他視網(wǎng)膜細(xì)胞類(lèi)型為代價(jià)導(dǎo)致AC的產(chǎn)生增加。這些數(shù)據(jù)表明，HDAC4在不同的細(xì)胞室中具有不同的功能。HDAC4介導(dǎo)的rdl小鼠中光感受器變性的救治需要HIFl α的轉(zhuǎn)錄活性。有趣的是，HDAC6并沒(méi)有導(dǎo)致小鼠中HIFl α蛋白質(zhì)增加或促進(jìn)視桿的存活。它在果蠅中救治變性是在一個(gè)蛋白酶體受損的模型中，其中認(rèn)為需要HDAC6誘導(dǎo)自我吞噬(Pandey等人Q007) Nature447 :859)。不打算受限于科學(xué)理論，這個(gè)功能可能是由于其導(dǎo)致其被分類(lèi)為第II類(lèi)但不是IIa類(lèi)HDAC的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，而HDAC4是IIa類(lèi)HDAC(Yang和Gregoire (2005) Mol. Cell. Biol. 25 :287 。因此，超過(guò)一個(gè)的神經(jīng)元細(xì)胞存活途徑是受HDAC的調(diào)節(jié)。 由于HDAC4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(Bolger和Yao Q005) J. Neurosci. 25 :9544)，這些數(shù)據(jù)表明HDAC4對(duì)其他神經(jīng)變性性疾病可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，HDAC抑制劑作為抗癌治療藥物可能是有效的。實(shí)施例VI如以上實(shí)施例III所述，已證明HDAC4基因可以被遞送到體內(nèi)的視桿光感受器，并抑制視桿死亡以及視錐死亡。使用電穿孔遞送該基因，這導(dǎo)致視桿轉(zhuǎn)導(dǎo)而不是視錐轉(zhuǎn)導(dǎo)。這表明，HDAC4可以通過(guò)視桿固有的過(guò)程拯救視桿。然而，視錐的拯救是間接的，因?yàn)樵摶虿槐贿f送到視錐。在患有色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的人以及動(dòng)物中，這種疾病的基因只在視桿中表達(dá)， 然而，視桿死亡后接著視錐死亡。因此，視錐的存活是由于鄰近的視桿的存活。因此，如通過(guò)電穿孔實(shí)驗(yàn)所證明的，在RP中促進(jìn)視桿的存活應(yīng)該能促進(jìn)視錐的存活。由于電穿孔沒(méi)有轉(zhuǎn)導(dǎo)所有細(xì)胞，且由于它不是穩(wěn)定的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，因此開(kāi)發(fā)基因轉(zhuǎn)移的替代方法。病毒載體可以產(chǎn)生更廣泛和更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒載體也具有比電穿孔能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)更廣泛的物種的優(yōu)勢(shì)。已創(chuàng)造了轉(zhuǎn)導(dǎo)HDAC4基因的腺伴隨病毒(AAV)。這是可以感染感光細(xì)胞的AAV2/5 病毒。CMV啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子已被用來(lái)驅(qū)動(dòng)表達(dá)。CMV啟動(dòng)子載體已被用于在出生后第O 天(PO)感染RP的rdl小鼠模型。結(jié)果表明，它能夠直接促進(jìn)視錐存活。感染后視桿仍然死亡，這是由于從這個(gè)載體表達(dá)HDAC4的延遲。通常情況下，具有CMV啟動(dòng)子的AAV2/5直到感染幾乎4周后才表達(dá)高水平的病毒基因。由于視桿到P21在rdl中死亡，預(yù)期它們不會(huì)存活。然而，視錐的死亡具有慢得多的動(dòng)力學(xué)，在大約P21開(kāi)始，持續(xù)到外周直到大約3 個(gè)月(P90)，此時(shí)大部分視錐已經(jīng)死亡。AAV2/5-HDAC4的感染導(dǎo)致更多的視錐存活，特別是在中心視網(wǎng)膜，直至至少P60(圖10)。只表達(dá)GFP的對(duì)照病毒不顯示顯著的視錐存活，特別是到這個(gè)階段在外周。(圖10)這些數(shù)據(jù)表明，可以治療已損失其視桿且正在經(jīng)歷視錐視覺(jué)損失(即日間和彩色視覺(jué))的RP患者。此外，由于視桿的死亡動(dòng)力學(xué)在RP患者中慢得多，使用這種方法也將使視桿存活。實(shí)施例VII如以上實(shí)施例VI所述，已經(jīng)表明，AAV2/5-HDAC4對(duì)rdl感光細(xì)胞的感染導(dǎo)致視錐存活直到至少P60。然而，由于在此動(dòng)物模型中的快速視桿死亡速率與AAV2/5載體表達(dá) HDAC4的延遲，視桿沒(méi)有存活。因此，為了證明HDAC4表達(dá)也可以導(dǎo)致視桿存活，使用具有比上述rdl小鼠模型慢的死亡動(dòng)力學(xué)的視網(wǎng)膜變性小鼠模型。例如，使用視紫紅質(zhì)敲除小鼠(Mio-/-)。HDAC4基因在可操作地連接到組成型啟動(dòng)子的病毒載體中表達(dá)。該構(gòu)建體用于通過(guò)電穿孔、視網(wǎng)膜下和/或玻璃體內(nèi)注射感染感光細(xì)胞。根據(jù)本文提出的證據(jù)，預(yù)計(jì)結(jié)果將顯示該構(gòu)建體能夠直接促進(jìn)視桿的存活。
權(quán)利要求
1.一種抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，包括將所述細(xì)胞與增強(qiáng)HDAC4、HDAC5、HDAC6、 HDAC7或HIFl α的表達(dá)和/或活性的試劑接觸，從而抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡。
2.一種治療或預(yù)防受試者中的神經(jīng)變性性病癥的方法，包括向所述受試者施用增強(qiáng) HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7或HIFl α的表達(dá)和/或活性的試劑，從而治療或預(yù)防所述受試者中的所述神經(jīng)變性性病癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述神經(jīng)元細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述視網(wǎng)膜細(xì)胞選自雙極細(xì)胞、視桿感光細(xì)胞和視錐感光細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述試劑是核酸分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述核酸分子包括包含突變的HDAC4基因，所述突變導(dǎo)致外源性HDAC4定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述HDAC4是HDAC4-L175A。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括沒(méi)有被ARDl?；腍IFla基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括沒(méi)有被泛素化的HIFlα基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括沒(méi)有被蛋白酶體降解的 HIFl α基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括包含導(dǎo)致外源性HIFlα具有組成型活性的突變的HIFl α基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述神經(jīng)元細(xì)胞死亡是自然發(fā)生的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述神經(jīng)元細(xì)胞死亡由神經(jīng)變性性病癥引起。
15.根據(jù)權(quán)利要求2或14所述的方法，其中，所述神經(jīng)變性性病癥是年齡相關(guān)性黃斑變性。
16.根據(jù)權(quán)利要求2或14所述的方法，其中，所述神經(jīng)變性性病癥是色素性視網(wǎng)膜炎。
17.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包含在載體中。
18.—種抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，包括將所述細(xì)胞與抑制所述細(xì)胞中HDAC4降解的試劑接觸，從而抑制所述神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。
19.一種抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，包括將所述細(xì)胞與防止ARDl乙?；黾?xì)胞中的HIFl α的試劑接觸，從而抑制所述神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，HIFlα泛素化被抑制。
21.—種抑制雙極細(xì)胞死亡的方法，包括將所述細(xì)胞與增強(qiáng)所述細(xì)胞中HDAC6的表達(dá)和/或活性的試劑接觸，從而抑制所述雙極細(xì)胞的死亡。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合體、腺伴隨病毒(AAV)、單純皰疹病毒I或II、細(xì)小病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乳頭瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述載體是AAV載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述AAV載體是AAV2/5或AAV2/8載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)改變視網(wǎng)膜細(xì)胞中的HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HIF1α中的一種或多種的表達(dá)來(lái)抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的方法。
文檔編號(hào)A61K31/70GK102170783SQ200980139144
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日
發(fā)明者C·L·塞普科, 陳波 申請(qǐng)人:哈佛學(xué)院院長(zhǎng)等