抑制NF-kB在治療有RIZ1基因異常的腫瘤中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及對于腫瘤的治療。更具體的說本發(fā)明涉及通過抑制NF-kB，從而能有針對性的治療存在有RIZl基因表達缺失或下降的腫瘤。
【背景技術】
[0002]RIZl基因，全稱為視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白質(zhì)結合鋅指蛋白I (Retinoblastomaprotein-1nteracting zinc finger gene I)，屬于核蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員。該基因位于人染色體lp36，cDNA全長為7942Kb，包含10個外顯子。基因的啟動子區(qū)存在典型的C P G島結構，易發(fā)生甲基化從而導致自身轉(zhuǎn)錄受到抑制。該基因由于轉(zhuǎn)錄起始的位點不同可表達RIZl以及RIZ2兩種蛋白質(zhì)，其中RIZl蛋白為1718個氨基酸，約250KDa，RIZl蛋白含有PR結構域(domain)，同時還含有8個鋅指結構序列，一個與腺病毒早期蛋白EIA同源的區(qū)，一個GTP模體(motif)，一個SH3模體。PR結構域在RIZ2蛋白中是缺失的。RIZl參與多種重要生物功能。已知的RIZl的主要功能集中在其PR結構域。PR結構域能介導蛋白間的相互作用，穩(wěn)定染色體的結構，從而調(diào)控基因表達。PR結構域同時具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，可以甲基化組蛋白3。組蛋白3甲基化的結果，可以阻滯轉(zhuǎn)錄因子與D N A的結合，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。RIZl的下游基因調(diào)控產(chǎn)物涉及到細胞凋亡，雌激素信號通路，和炎性介質(zhì)等多種功能。(Buvse等人，PNAS 1995 ；Mori等人，Blood 1998 ;Sun等人，Inter JMol Sci 2008 ；Suzuki 等人，Cancer Letter2006)
[0003]RIZl基因?qū)儆谝职┗?，具有抑制腫瘤的特性。其靶基因主要為涉及細胞增殖分化和瘤變過程中的相關基因(如視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白)。目前已知，RIZl蛋白在多種組織細胞中廣泛表達，但在各種腫瘤組織中該基因表達缺失或明顯減低。DNA啟動子區(qū)CpG島甲基化是RIZl基因表達缺失或減低的常見原因。在肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、甲狀腺癌等癌組織以及細胞系中，RIZl啟動子CpG島存在高度甲基化，與RIZl表達缺失或明顯減低顯著相關。甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，DNA中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。當RIZl啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)時，RIZl基因能正常轉(zhuǎn)錄，當其發(fā)生甲基化時，會影響到基因的轉(zhuǎn)錄，導致RIZl基因表達的缺失。在對比肝癌組織時發(fā)現(xiàn)，RIZl水平隨惡變程度進展而呈進行性下降，其表達水平與肝癌的發(fā)生、癌腫人小、進展、患者預后具有臨床相關性。在RIZl表達缺失的腫瘤細胞中，應用去甲基化試劑可以使RIZl基因的重新表達，抑制腫瘤生長。這些觀察提示了在腫瘤中，RIZl基因DNA甲基化是導致該基因缺失的重要原因。(Du 等人，Cancer Research2001 ;Nomoto 等人，BrJCancer2007 ；Huang 等人，Nature Review Cancer 2002 ;Jiang 等人，In J Cancer，1999 ;Herath 等人，J Gastroenterol Hepatol 2006)。然而目前仍不清楚是什么因素導致了 RIZl基因的甲基化?；谝陨显颍芯空邆円恢痹谠噲D尋找導致RIZl基因DNA甲基化的因素和生物調(diào)節(jié)劑，以最終用于腫瘤的基因靶向治療。
[0004]NF-kB(nuclear factor kappa-1ight-chain-enhancer of activated B cells)是重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括RelA(p65)、RelB、c_Rel、p50和P52。其中的p65參與多數(shù)功能，通常以二聚體的形式存在，以p65/p50 二聚體最常見。正常情況NF-kB下參與炎性反應，免疫激活，細胞凋亡等多種生理活動。目前公認，異?；罨腘F-kB活性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。在肝癌的研究中，NF-kB被發(fā)現(xiàn)是介導乙肝病毒誘發(fā)原發(fā)性肝癌的重要因素。同時，在對比正常肝組織、肝硬化組織、肝細胞肝癌組織時發(fā)現(xiàn)，NF-kB水平隨惡變程度進展而呈進行性上升。(Wang等人:NatMed 1999 ;梁帥等人:中國普通外科雜志 2006 ;Luedde 等人:Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2011)。值得注意的是，在肝癌組織中，NF-kB的活性水平的變化與RIZl基因的表達水平的變化呈完全相反的趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可用于治療有RIZl基因表達缺失或功能異常的腫瘤的方法。更具體的說是通過抑制NF-kB的活性，促使RIZl基因恢復表達和正常功能，從而能夠抑制腫瘤細胞的生長，用于腫瘤的治療。
[0006]本發(fā)明首次提出通過抑制NF-kB米用于治療存在有RIZl基因異常的腫瘤的手段。這一發(fā)明是基于以下的科學發(fā)現(xiàn):(I) NF-kB的過度活化，RIZl的甲基化，和RIZl表達缺失或表達下降共同出現(xiàn)在腫瘤細胞中。(2)通過對NF-kB特異性的抑制或基因敲減(geneknockdown)導致NF_kB信號的下降，能夠使RIZl基因的CpG島去甲基化并恢復該基因的表達。(3)NF-kB基因敲減能夠降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I (DNMTl)的轉(zhuǎn)錄，而后者是是促使RIZl基因甲基化的主要酶。(4)在有RIZl基因表達缺失的腫瘤細胞中，NF-kB活性抑制或特異性的基因敲減能夠抑制腫瘤細胞的生長。而這種抑制腫瘤的作用在RIZl基因敲減的情況下則會明顯減弱。這些發(fā)現(xiàn)顯示在腫瘤細胞中，過度活化的NF-kB導致了 RIZl基因的甲基化，并最終導致了 RIZl基因的表達缺失或下降。通過抑制NF-kB，可以逆轉(zhuǎn)這一過程，恢復RIZl的正常表達。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點在于:1.本發(fā)明的針對RIZl基因在腫瘤細胞中表達缺失或下降，是有針對性的靶向治療。采用抑制NF-kB的方法，從而使RIZl基因去甲基化并恢復表達，起到抑制腫瘤細胞生長的作用。2.抑制NF-kB可使用抑制劑和基因沉默的方法。3.在NF-kB基因沉默時，用米做基因敲減的shRNA載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒(含慢病毒)，腺病毒，腺相關病毒。4.通過建立人腫瘤細胞IfepG2裸鼠皮下種植腫瘤模型證實了通過抑制NF-kB能夠抑制腫瘤細胞，建立了一種有效治療腫瘤的手段和方法。
【附圖說明】
[0008]圖1.在腫瘤細胞中，NF-kB活化并在核中聚集。特異性抑制劑或基因敲減可降低NF-kB的活化水平。
[0009]圖2.在腫瘤細胞中，RIZl基因甲基化并且表達缺失。在NF-kB抑制劑TOTC處理或基因敲減的情況下，RIZl基因去甲基化并恢復表達。
[0010]圖3.在腫瘤細胞中，在NF-kB抑制劑TOTC處理或基因敲減的情況下，DNMTl基因轉(zhuǎn)錄為RNA的水平下降。
[0011]圖4.裸鼠成瘤