專利名稱：一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析檢測領(lǐng)域，涉及一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。
背景技術(shù)：
遺傳疾病長期以來一直在困擾著人類，遺傳性視網(wǎng)膜退化是一個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞迅大量死亡的過程，迅速地導(dǎo)致失明。在世界范圍已經(jīng)開展和正在進(jìn)行著大量的研究工作，但是對(duì)于這種疾病的分子生物學(xué)機(jī)制、尤其有關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞迅速死亡的進(jìn)程了解并不深刻；為了更好地了解并進(jìn)而防治這些疾病，大量先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)正被用于這些疾病的研究。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1、ERK2)是一些在細(xì)胞分化、增殖等過程中起作用的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，盡管已經(jīng)有很多材料證明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(ERKl/2)在細(xì)胞凋 亡過程中起著關(guān)鍵性的信號(hào)傳遞、調(diào)控基因表達(dá)的作用；然而尚沒有研究確立了磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P-ERKl/2)水平與遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中細(xì)胞異常死亡進(jìn)程的相關(guān)性，也沒有以磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P-ERKl/2)水平作為遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中細(xì)胞死亡進(jìn)程的判定依據(jù)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，包含如下步驟(I)從帶有遺傳疾病的視網(wǎng)膜組織中分離出核外的總體蛋白；(2)配制變性聚丙烯酰胺凝膠，核外總體蛋白樣品經(jīng)超聲處理后，用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離；(3)用Western Blotting檢測核外總體蛋白樣本中與抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I和抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2特異抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白，進(jìn)行定量分析；(4)與免疫組織化學(xué)確定的細(xì)胞死亡曲線比對(duì)，從而判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程。步驟(I)從帶有遺傳疾病的視網(wǎng)膜組織中分離出核外的總體蛋白的方法為在含多種蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液中將組織勻漿；低速離心，沉淀細(xì)胞核，收集上清液，即為核外總體蛋白樣本。所述的含多種蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液配方為蔗糖O. 25 M
三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7. 5-8. O15 mM
氯化鉀60 mM
氯化鈉15 mM
乙二胺四乙酸pH 8. O5 mM
乙二醇二乙醚二胺四乙酸pH 8. OI mM
精胺O. 15 mM
精脒O. 15 mM
二硫蘇糖醇I mM
苯甲基磺酰氟O. 5 mM
蛋白酶抑制劑25微升/毫升步驟(3)是將電泳分離后的蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜；用抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2的抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上的蛋白反應(yīng)；熒光標(biāo)記與抗體結(jié)合的抗原蛋白條帶，對(duì)其進(jìn)行定量分析。有益效果本研究中首次確立了磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P_ERKl/2)水平與遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中細(xì)胞異常死亡進(jìn)程的相關(guān)性，首次確認(rèn)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I、2(P-ERKl/2)水平作為遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中細(xì)胞死亡進(jìn)程的判定依據(jù)。這一發(fā)現(xiàn)為闡明遺傳性視網(wǎng)膜退化的分子生物學(xué)機(jī)制以及防治這些遺傳疾病提供關(guān)鍵性的重要信息，為臨床遺傳性視網(wǎng)膜退化的診斷提供了參考數(shù)據(jù)。本方法中采用蛋白印跡法(WesternBlotting)是以特異的抗原/抗體反應(yīng)作為基本檢測手段 ；具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品用量小、結(jié)果明確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。可以預(yù)見，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)以及其他信號(hào)傳遞系統(tǒng)應(yīng)該在遺傳病研究、防治中得到進(jìn)一步的重視。


圖I :經(jīng)Western Blotting檢測的網(wǎng)膜組織樣品中磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I、2 (P-ERK1/2)的水平。A光照4小時(shí)后，采自正常動(dòng)物，受保護(hù)的右眼樣品，B光照4小時(shí)后，采自正常動(dòng)物，受光照的左眼樣品，C光照后I小時(shí)后，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物米集受保護(hù)的右眼樣品，D光照后I小時(shí)后，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集受光照的左眼樣品，E光照后4小時(shí)后,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物米集受保護(hù)的右眼樣品，F(xiàn)光照后4小時(shí)后，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集受光照的左眼樣品，G光照后24小時(shí)后,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物米集受保護(hù)的右眼樣品，H光照后24小時(shí)后，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集受光照的左眼樣品，光照I小時(shí)后視網(wǎng)膜試驗(yàn)樣本中細(xì)胞才開始死亡，所以樣品D中P-ERK1/2不明顯高于樣品C。3-5小時(shí)期間大量細(xì)胞迅速死亡(70%細(xì)胞在此時(shí)間段內(nèi)死亡)，磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P-ERKl/2)水平在F樣品中極大升高，數(shù)倍于對(duì)照樣品E。12小時(shí)細(xì)胞死亡過程基本停止，因?yàn)?5%以上視網(wǎng)膜細(xì)胞已經(jīng)死亡。24小時(shí)以后，其細(xì)胞死亡過程已結(jié)束；樣品H中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P-ERKl/2)水平與受保護(hù)的、沒有發(fā)生視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的G樣品相相似。圖2 :顯示數(shù)字化的磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I (P-ERKl)水平。白色區(qū)域標(biāo)記對(duì)照組織樣品中，黑色為試驗(yàn)樣品中磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I(P-ERKl)水平。圖3 :顯示數(shù)字化的磷酸化·細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(P_ERK2)水平。白色區(qū)域標(biāo)記對(duì)照組織樣品中，黑色為試驗(yàn)樣品中磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(P-ERK2)水平。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)背景說明(圖I):實(shí)驗(yàn)中使用了帶有遺傳性視網(wǎng)膜缺陷的動(dòng)物(犬類)，在視紫色素基因(Opsin)第四密碼子上發(fā)生突變(ACG —AGG)，引起了視紫色素蛋白第四個(gè)氨基酸的改變(由蘇氨酸變成精氨酸，Threonine — Arginine)。這一改變導(dǎo)致視紫色素蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常。很微弱的光照就會(huì)使得這些動(dòng)物的視網(wǎng)膜退化，大量的視網(wǎng)膜細(xì)胞會(huì)迅速死亡。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左眼受到微弱的光照，而右眼則被遮擋，予以保護(hù)的情況下，免疫組織化學(xué)檢測表明右眼視網(wǎng)膜細(xì)胞沒有死亡。左眼視網(wǎng)膜細(xì)胞在I小時(shí)后開始死亡，3-5小時(shí)期間大量細(xì)胞迅速死亡(70%細(xì)胞在此時(shí)間段內(nèi)死亡)，12小時(shí)細(xì)胞死亡過程基本停止，因?yàn)?5%以上視網(wǎng)膜細(xì)胞已經(jīng)死亡。受保護(hù)的右眼中沒有發(fā)生視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。以下結(jié)合附圖通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明特征及其它相關(guān)特征作進(jìn)進(jìn)一步詳細(xì)說明實(shí)施例I(I)提取核外蛋白樣品是本方法的基礎(chǔ)。O. 2-0. 3克視網(wǎng)膜組織樣品中加入I. 5-2. O毫升勻漿緩沖液，用Bio-Gen PR0200勻漿器以10000-15000rpm速度勻漿。勻漿緩沖液配方為
蔗糖O. 25 M
三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH7. 5-8. O 15 mM 氯化鉀60 mM
氯化鈉15 mM
乙二胺四乙酸pH 8. O5 mM
乙二醇二乙醚二胺四乙酸pH 8. OI mM
精胺O. 15 mM
精脒O. 15 mM
二硫蘇糖醇I mM
苯甲基磺酰氟O. 5 mM
蛋白酶抑制劑25微升/毫升
(2)勻漿30秒；整個(gè)勻漿過程在冰浴中進(jìn)行，每勻漿10秒，須停機(jī)冷卻10秒。(3)勻漿后低速離心(2000_2500g，10分鐘，4°C )收集上清液，即為核外總體蛋白樣本，存儲(chǔ)在低溫中，待用。細(xì)胞核沉淀物另作處理。(4)用BioLogics3000型超聲波勻漿器(BioLogics公司產(chǎn)品)處理蛋白樣品，使用50-60%功率。整個(gè)過程在冰浴中進(jìn)行，超聲處理3次，每次處理10-15秒鐘，冷卻10秒鐘。(5)用含有十二烷基硫酸鈉的變性緩沖系統(tǒng)配制聚丙烯酰胺凝膠，包括濃縮膠和分離膠；在每個(gè)蛋白樣品中加入凝膠樣品緩沖液，充分混合后在沸水浴中加熱10-15分鐘，12000-15000g離心10分鐘，取出上清，加至凝膠中，進(jìn)行電泳分離。(6)將電泳分離后的蛋白從凝膠上用電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜。(7)用抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(P_ERKl/2) (Santa CruzBiotechnology, Inc.產(chǎn)品)的抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上的蛋白反應(yīng)；(8)熒光標(biāo)記與抗體結(jié)合的特異蛋白條帶，對(duì)其進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖2、圖3 ；(9)將磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2 (P-ERK1/2)水平與免疫組織化學(xué)檢測所顯示的細(xì)胞死亡進(jìn)程作比對(duì)，可以確認(rèn)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l、2(ERKl/2)水平變化與細(xì)胞死亡密切的相關(guān)性。·
以上所述的即為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
權(quán)利要求
1.一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于包含如下步驟(1)從帶有遺傳疾病的視網(wǎng)膜組織中分離出核外的總體蛋白；(2)配制變性聚丙烯酰胺凝膠，核外總體蛋白樣品經(jīng)超聲處理后，用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離；(3)用WesternBlotting檢測核外總體蛋白樣本中與抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I 和抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2特異抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白，進(jìn)行定量分析；(4)與免疫組織化學(xué)確定的細(xì)胞死亡曲線比對(duì)，從而判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟(I) 從帶有遺傳疾病的視網(wǎng)膜組織中分離出核外的總體蛋白的方法為在含多種蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液中將組織勻漿；低速離心，沉淀細(xì)胞核，收集上清液，即為核外總體蛋白樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于所述的含多種蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液配方為蔗糖O. 25 M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH7. 5-8. O15 mM氯化鉀60 mM氯化鈉15 mM乙二胺四乙酸pH 8. O5 mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸pH 8. OI mM精胺O. 15 mM精脒O. 15 mM二硫蘇糖醇I mM苯甲基磺酰氟O. 5 mM蛋白酶抑制劑25微升/毫升
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法，其特征在于步驟(3) 是將電泳分離后的蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜；用抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2的抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上的蛋白反應(yīng)；熒光標(biāo)記與抗體結(jié)合的抗原蛋白條帶， 對(duì)其進(jìn)行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析檢測領(lǐng)域，公開一種判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程的方法。首先從病變視網(wǎng)膜組織中分離出核蛋白以外的總體蛋白樣本，用蛋白印跡法檢測核外總體蛋白樣本中與抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(P-ERK1/2)特異抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白，進(jìn)行定量分析；經(jīng)與免疫組織化學(xué)檢測到的視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程比對(duì)，從而判定視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡進(jìn)程。本發(fā)明依據(jù)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2的水平的變化可判定遺傳性視網(wǎng)膜退化過程中細(xì)胞死亡進(jìn)程；為闡明遺傳疾病組織細(xì)胞死亡以及探討防止和治療的手段提供了關(guān)鍵性的重要信息。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102928602SQ20111022536
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者顧烽, 劉軍, 王平, 顧大年, 李則孝 申請(qǐng)人:劉軍, 顧烽, 王平