專(zhuān)利名稱(chēng)：銀杏葉提取物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銀杏葉提取物的新用途，特別是對(duì)視神經(jīng)保護(hù)的用途。
背景技術(shù)：
視神經(jīng)保護(hù)是針對(duì)那些還沒(méi)有受到損傷或僅僅受到部分損傷，本身處在毒性環(huán)境之中的神經(jīng)元加以保護(hù)的方法。這些細(xì)胞如果不加以干預(yù)，必然受到環(huán)境的毒害而逐漸消亡。對(duì)于損傷異常強(qiáng)烈的疾病，神經(jīng)保護(hù)措施幾乎來(lái)不及發(fā)揮作用。因此，神經(jīng)保護(hù)不適合于細(xì)胞迅速崩解的疾病，而是適合于細(xì)胞緩慢丟失的疾病，如Alzhiemer病和青光眼等。在神經(jīng)系統(tǒng)病變中，原發(fā)性損傷(Primary injury)可能多種多樣，包括缺血、缺氧、外傷、變性、離子濃度改變、氧自由基、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、免疫異常等，然而，神經(jīng)元的繼發(fā)性丟失并不因?yàn)樵l(fā)病變的不同而有所改變，它們都采取了細(xì)胞凋亡的方式。所以，作為神經(jīng)保護(hù)藥物的一種，視神經(jīng)保護(hù)藥物并不是針對(duì)特定的病因，而是針對(duì)基本上共同的損傷通路，即繼發(fā)性損害導(dǎo)致的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡，以及引起凋亡的各種因素。
青光眼是一種主要致盲性眼病，所造成的視功能損害不能逆轉(zhuǎn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球有青光眼患者6600多萬(wàn)人，40歲以上人群的發(fā)病率為2％，根據(jù)這一比例進(jìn)行推算，隨著人口老齡化的加劇，青光眼患者逐漸增多。這種疾病嚴(yán)重影響我國(guó)影響人民的健康水平，阻礙經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。
以往認(rèn)為青光眼是一種眼壓增高的疾病，臨床上發(fā)展起來(lái)名目繁多的降眼壓藥物和手術(shù)治療方法，用以降低患者的眼壓，力求阻斷病情的發(fā)展。到目前為止，降眼壓治療是青光眼唯一的治療方法。然而，在青光眼患者中，即使眼壓降低到正常范圍，仍然有40％的患者視神經(jīng)病變繼續(xù)進(jìn)展，臨床上表現(xiàn)為視野的進(jìn)一步損害，視功能的進(jìn)一步下降，最終引起患者盲目或失明。這是因?yàn)榍喙庋奂词棺鲞^(guò)手術(shù)或用其他方法控制了眼壓，眼底的一種神經(jīng)細(xì)胞——節(jié)細(xì)胞也會(huì)緩慢進(jìn)行丟失，這種細(xì)胞丟失的越多，視功能就越差，最終失明。因此，人們大有談青光眼而色變的感覺(jué)。如何保護(hù)節(jié)細(xì)胞是當(dāng)前的一個(gè)重要課題。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青光眼是一種慢性進(jìn)行性的視神經(jīng)病變，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的慢性進(jìn)行性丟失是其最主要的病理生理學(xué)特征。高眼壓、缺血等原發(fā)性損傷(Primary injury)首先引起一部分視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的丟失，丟失的節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生出許多毒性物質(zhì)，使其周?chē)?jié)細(xì)胞的生存環(huán)境惡化，細(xì)胞膜離子通透性增加，線粒體膜遭受損害，致使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞丟失，這樣的損傷被稱(chēng)為繼發(fā)性損害(Secondarydegeneration)。繼發(fā)性損害一直持續(xù)下去，病變就一直進(jìn)展。由此可見(jiàn)，繼發(fā)性損害是青光眼患者視神經(jīng)病變進(jìn)展的最重要原因。
目前治療青光眼美國(guó)有兩種化學(xué)合成藥物，美金剛和莫尼定，已經(jīng)FDA同意做藥物的臨床實(shí)驗(yàn)，還沒(méi)有得出最后的結(jié)果。世界各國(guó)多家實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)的化學(xué)合成物很多，最終都因副作用太大不能進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
銀杏葉在中醫(yī)界實(shí)用已經(jīng)有幾千年的歷史了，近幾十年人們發(fā)現(xiàn)了許多新用途。它含有黃酮和內(nèi)酯成分，具有擴(kuò)張血管、抗氧化-抗血小板凝聚、抗神經(jīng)組織的作用，特別適用于帕金森綜合癥、海默氏病等神經(jīng)細(xì)胞凋亡的疾病，取得良好效果，該藥在歐美國(guó)家受到廣泛歡迎。特別是在德國(guó)，應(yīng)用十分廣泛。目前在眼科疾病領(lǐng)域也有應(yīng)用銀杏葉提取物進(jìn)行治療的，但主要集中在視網(wǎng)膜動(dòng)脈硬化、病變、改善視網(wǎng)膜血液循環(huán)，以及視疲勞、近視眼等方面的治療，對(duì)于視神經(jīng)的保護(hù)方面還沒(méi)有更深入的研究。國(guó)內(nèi)有一種藥物——燈盞細(xì)辛(即本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中選用的陽(yáng)性對(duì)照藥物)對(duì)視神經(jīng)的保護(hù)有一定作用，但該品屬非醫(yī)保范圍，且價(jià)格較高。
通過(guò)近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)，初步認(rèn)為銀杏葉提取物具備了視神經(jīng)保護(hù)藥物的條件，首先，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C實(shí)它對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用；第二，從目前的研究看，銀杏葉提取物的眾多成分中起主要作用的有兩類(lèi)，銀杏黃酮和內(nèi)酯成分，分別發(fā)揮抗氧化和擴(kuò)張血管的作用。此外，它能夠抑制谷氨酸導(dǎo)致的NMDA受體毒性興奮，抑制PAF受體興奮導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，抑制淀粉樣物質(zhì)的前體(APP)向淀粉樣物質(zhì)轉(zhuǎn)化，這些都從分子生物學(xué)水平上闡述了銀杏葉提取物做為視神經(jīng)保護(hù)劑的可行性；第三，該藥物能夠達(dá)到靶細(xì)胞，經(jīng)給動(dòng)物口服銀杏葉提取物，發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜上有足夠的該藥物及其代謝產(chǎn)物，說(shuō)明銀杏葉提取物能夠通過(guò)血眼屏障，達(dá)到視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞而發(fā)揮保護(hù)作用。近年來(lái)的研究表明，銀杏葉提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病視網(wǎng)膜病變具有良好作用，這從另一個(gè)側(cè)面反應(yīng)出它能夠在視網(wǎng)膜上發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用銀杏葉提取物制成的視神經(jīng)保護(hù)藥物，能透過(guò)血眼屏障直接作用于視網(wǎng)膜，使視網(wǎng)膜血流增加，并能直接擴(kuò)張眼底血管；還具有抗血小板凝聚、拮抗NMDA受體、抗氧化、對(duì)抗凋亡，在視網(wǎng)膜上達(dá)到有效的藥物濃度等作用，以達(dá)到修復(fù)和保護(hù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、進(jìn)而治療青光眼等疾病的目的。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的它是將銀杏葉提取物與輔料采取常規(guī)工藝制成制劑，用于視神經(jīng)的保護(hù)。
所述的制劑可以是膠囊劑、片劑、注射劑、口服液、顆粒劑。
所述的視神經(jīng)保護(hù)包括青光眼的治療。
所述的制劑中銀杏葉提取物與輔料的重量比例為20％-80％∶80％-20％。
所述的視神經(jīng)保護(hù)是對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的修復(fù)和保護(hù)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于其來(lái)自于植物，含有60多種成分，其中30多種成分都是它在自然界中所特有的，具有毒副作用小，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病有獨(dú)特的療效等優(yōu)點(diǎn)。
下面對(duì)本發(fā)明對(duì)大鼠視神經(jīng)夾傷模型節(jié)細(xì)胞保護(hù)及對(duì)大鼠急性高眼壓節(jié)細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)作詳細(xì)說(shuō)明。


附圖1為本發(fā)明對(duì)大鼠視神經(jīng)夾傷模型節(jié)細(xì)胞保護(hù)存活率的對(duì)照?qǐng)D；附圖2為本發(fā)明對(duì)大鼠視神經(jīng)夾傷模型節(jié)細(xì)胞保護(hù)藥物量效關(guān)系曲線圖；附圖3為本發(fā)明對(duì)大鼠視神經(jīng)高眼壓節(jié)細(xì)胞保護(hù)存活率的對(duì)照?qǐng)D；附圖4為本發(fā)明對(duì)大鼠視神經(jīng)高眼壓節(jié)細(xì)胞保護(hù)藥物量效關(guān)系曲線圖。
一、對(duì)大鼠視神經(jīng)夾傷模型節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)(一)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)大鼠視神經(jīng)夾傷模型，觀察銀杏葉提取物對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
(二)、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所繁育場(chǎng)。
實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)用藥銀杏葉提取物浸膏(以下簡(jiǎn)稱(chēng)百路達(dá))申請(qǐng)人提供陽(yáng)性對(duì)照藥 燈盞細(xì)辛浸膏購(gòu)自云南省玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司陰性對(duì)照藥 生理鹽水華北藥業(yè)有限公司逆行標(biāo)記物 熒光金(FG) 購(gòu)自美國(guó)熒光金公司(Fluorochrome LtD)麻醉藥品鹽酸氯胺酮注射液上海第一生化藥業(yè)有限公司地西潘注射液天津金耀氨基酸有限公司固定液 多聚甲醛購(gòu)自北京化學(xué)試劑品有限公司(三)、實(shí)驗(yàn)方法1、動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)用SD大鼠90只，雄性，體重200-240克，眼前部檢查、Mydrine散瞳眼底檢查無(wú)異常。用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為5組分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組，每組大鼠各18只。各組大鼠右眼為損傷眼，左眼未做視神經(jīng)夾持，作為正常對(duì)照。
2、夾傷模型及給藥方法大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮3ml/kg進(jìn)行麻醉，剪開(kāi)外眥，在手術(shù)顯微鏡下(OMS-85，拓?fù)淇倒救毡?剪開(kāi)球結(jié)膜并做相應(yīng)的分離，暴露視神經(jīng)。用夾持力40g的微型視神經(jīng)夾(TKF-2型美國(guó))在球后2mm處夾持視神經(jīng)60秒，恢復(fù)球結(jié)膜并縫合外眥傷口。夾持視神經(jīng)時(shí)可見(jiàn)一過(guò)性眼底血管痙攣，夾傷后2分鐘內(nèi)完全恢復(fù)。陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組于視神經(jīng)夾傷后2小時(shí)及此后每天腹腔分別注射生理鹽水5ml/kg、1％燈盞細(xì)辛5ml/kg、0.25％百路達(dá)5ml/kg、1％百路達(dá)5ml/kg和4％百路達(dá)5ml/kg，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為28天。
3、逆行標(biāo)記動(dòng)物安死術(shù)前5天，采用雙上丘注射法逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。6％水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射使動(dòng)物麻醉，將其固定在腦立體定位儀上(900型腦立體定位儀David Kopf儀器公司美國(guó))，牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，用微量注射器吸取3％熒光金(溶于0.9％生理鹽水中)，每側(cè)上丘注射兩點(diǎn)(前囟后-5.9和-6.4，旁開(kāi)1.4，深4.0)，每點(diǎn)注射1.5ul。
4、視網(wǎng)膜鋪片上方12點(diǎn)處球結(jié)膜以逢線標(biāo)記，立即取出眼球固定于4％多聚甲醛磷酸緩沖液中2小時(shí)。沿角膜緣后0.5mm剪開(kāi)眼球，去除角膜和晶狀體，分離視網(wǎng)膜并將其定向平鋪，空氣中自然干燥。Vectashield H-100熒光增強(qiáng)劑及市售無(wú)色指甲油封片。熒光顯微鏡拍攝照片(AH-2奧林巴司公司 日本)，距離視乳頭中心2mm上下左右各拍攝照片一張，照片放大倍數(shù)125×。
5、圖像分析使用聯(lián)想Mustek掃描儀將照片以100dpi掃入計(jì)算機(jī)，使用顆粒分析軟件(CPAS)進(jìn)行節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將上下左右4張照片節(jié)細(xì)胞數(shù)量累加，并轉(zhuǎn)化成節(jié)細(xì)胞密度。右眼節(jié)細(xì)胞密度與左眼節(jié)細(xì)胞密度之比定義為節(jié)細(xì)胞存活率，即節(jié)細(xì)胞存活率＝右眼節(jié)細(xì)胞密度/左眼節(jié)細(xì)胞密度×100。
6、統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS for Windows 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用單因素方差分析(ANOV)，兩兩比較采用均數(shù)t檢驗(yàn)。以p＜0.05具有顯著性差異，以p＜0.01具有高度顯著性差異。
(四)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中由于麻醉及操作意外導(dǎo)致部分大鼠死亡，個(gè)別大鼠因節(jié)細(xì)胞標(biāo)記不良而使標(biāo)本不能使用，各實(shí)驗(yàn)組實(shí)際可使用的大鼠數(shù)量見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組節(jié)細(xì)胞存活率介于41.27％與74.21％之間，平均存活率為60.59％，標(biāo)準(zhǔn)差為±8.78％。按節(jié)細(xì)胞存活率計(jì)算，陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組節(jié)細(xì)胞的存活率分別為73.80％、66.49％和71.60％和74.17。各組節(jié)細(xì)胞存活率及其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見(jiàn)表2。各組平均節(jié)細(xì)胞存活率及其標(biāo)準(zhǔn)差見(jiàn)圖1。
表1 實(shí)驗(yàn)中各組最終的大鼠數(shù)量(只)陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組高劑量組動(dòng)物數(shù)量18161518 16各組節(jié)細(xì)胞存活率的單因素方差分析表明，它們之間存在顯著性差異(p＜0.05)。兩兩比較顯示，陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組之間存在顯著性差異(p＜0.05見(jiàn)表3)。說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照藥物燈盞細(xì)辛與三個(gè)劑量組的百路達(dá)都能有效地保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，各組間的兩兩比較見(jiàn)表3。
在用藥組之中，低劑量用藥組與陰性對(duì)照組之間存在顯著性差異(p＝0.032)，中劑量用藥組與低劑量用藥組之間存在顯著性差異(p＝0.038)，而高劑量用藥組與中劑量用藥組之間未見(jiàn)顯著性差異(p＝0.33)，但其節(jié)細(xì)胞存活率仍然有所提高，從71.60％提高到74.17％。三個(gè)劑量組的量效關(guān)系見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，低劑量的百路達(dá)就可以保護(hù)節(jié)細(xì)胞，隨著劑量的增加，其保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，百路達(dá)的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用有比較好的量效關(guān)系。
陽(yáng)性對(duì)照組與低劑量用藥組之間節(jié)細(xì)胞存活率存在顯著性差異(p＝0.023)，兩者的藥物劑量也相差了4倍。在劑量相同時(shí)，即中劑量組中，就與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異(p＝0.48)。本研究還發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組與高劑量用藥組之間無(wú)顯著性差異(p＝0.92)。
表2.各組節(jié)細(xì)胞存活率、平均值及標(biāo)準(zhǔn)差陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組 高劑量組50.5957.2368.9859.3979.4261.5272.5166.4785.8874.1661.7876.1360.2762.9664.0468.9050.8 66.1172.3475.1765.5580.6177.1873.3680.8663.2875.7475.1573.6688.0053.6655.7 60.5376.7669.2453.9080.7571.6273.4577.3051.2580.2069.3280.9773.4041.2776.1258.5976.5678.3072.5474.8865.5677.2274.57
64.4383.4262.86 62.670.2550.2184.1262.35 77.28 84.2467.0373.2470.84 68.76 73.6868.3886.2861.45 66.61 61.9374.2173.0876.39 62.0961.87 58.8960.33 65.79平均值60.5973.8066.49 71.60 74.17標(biāo)準(zhǔn)差8.78 10.485.627.578.39表3.各組節(jié)細(xì)胞存活率的兩兩比較(p值)陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組 高劑量組陰性對(duì)照0.0004 0.032 0.0003 0.00003陽(yáng)性對(duì)照 0.023 0.48 0.92低劑量組 0.038 0.003中劑量組0.33(五)、討論1、視神經(jīng)夾傷模型視神經(jīng)夾傷模型常用于視神經(jīng)保護(hù)藥物的研究，本研究采用了常見(jiàn)的夾傷方法，即在顳側(cè)做球結(jié)膜切口，于球后2mm夾持視神經(jīng)。這種方法不需過(guò)度牽拉視神經(jīng)，暴露清楚操作容易，所造成的視神經(jīng)損傷基本一致。我們使用40g微型視神經(jīng)夾夾傷視神經(jīng)60秒，導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞平均丟失39.41％±8.78％，模型節(jié)細(xì)胞的丟失比較穩(wěn)定。夾傷時(shí)僅造成視網(wǎng)膜血管短時(shí)痙攣，不造成血管永久閉塞，視網(wǎng)膜血管均在2分鐘內(nèi)恢復(fù)，實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有一只大鼠因視網(wǎng)膜永久性缺血而被排除在實(shí)驗(yàn)之外。
2、燈盞細(xì)辛的作用 燈盞細(xì)辛能明顯地保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，此結(jié)果與以往的研究相一致，這從另一個(gè)方面也說(shuō)明了該模型的穩(wěn)定性和可靠性。1％燈盞細(xì)辛組與0.25％百路達(dá)組相比有顯著性差異(p＜0.05)，很可能是燈盞細(xì)辛的有效劑量高于0.25％百路達(dá)的4倍，藥物劑量的差異導(dǎo)致了對(duì)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用的不同。當(dāng)燈盞細(xì)辛與百路達(dá)在同等劑量下，濃度同為1％時(shí)，兩者的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
3、百路達(dá)的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低、中、高劑量組的百路達(dá)均具有節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用。低劑量組節(jié)細(xì)胞存活率比陰性對(duì)照組提高了5.9％，中劑量組節(jié)細(xì)胞存活率比低劑量組提高5.11％。高劑量組節(jié)細(xì)胞存活率比中劑量組提高2.57％。不同劑量的百路達(dá)表現(xiàn)出很好的量效關(guān)系，隨著藥物濃度的提高，節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用不斷增強(qiáng)，并且中劑量組與低劑量組之間還存在著顯著性差異(p＜0.05)。雖然中劑量組與高劑量組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，但高劑量組節(jié)細(xì)胞存活率比中劑量組仍然有所提高。
4、百路達(dá)的作用的機(jī)制 首先百路達(dá)能夠到達(dá)視網(wǎng)膜，采用放射性同位素標(biāo)記的方法，給大鼠口服百路達(dá)，結(jié)果表明百路達(dá)及其代謝產(chǎn)物能夠在視網(wǎng)膜上達(dá)到一定的藥物濃度。其次，百路達(dá)發(fā)揮了擴(kuò)血管作用，研究表明，正常志愿者口服百路達(dá)后彩色多普勒顯示眼動(dòng)脈血流量增加了24％。目前認(rèn)為，百路達(dá)具有多種作用，包括對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制NMDA受體毒性興奮，阻斷谷氨酸毒性作用，抑制血小板凝集，對(duì)抗凋亡等。它對(duì)缺血/缺氧、機(jī)械損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。近來(lái)研究顯示，視網(wǎng)膜上廣泛存著血小板活化因子(PAF)受體，它的異常興奮導(dǎo)致了節(jié)細(xì)胞的丟失，使視神經(jīng)損害不斷加重。百路達(dá)能抑制PAF受體的興奮，從而達(dá)到保護(hù)節(jié)細(xì)胞目的。
總之，百路達(dá)能有效地保護(hù)大鼠視神經(jīng)夾傷模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在低劑量時(shí)就表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，隨著劑量的提高節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用更加明顯，有很好的量效關(guān)系。百路達(dá)屬于植物藥范疇，毒副作用小，使用安全。
二、對(duì)大鼠急性高眼壓模型節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)(一)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)大鼠急性高眼壓視網(wǎng)膜缺血再灌注模型，觀察百路達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
(二)、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所繁育場(chǎng)。
實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)用藥 百路達(dá)浸膏 申請(qǐng)人提供陽(yáng)性對(duì)照藥 燈盞細(xì)辛浸膏 購(gòu)自云南省玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司陰性對(duì)照藥 生理鹽水 華北藥業(yè)有限公司逆行標(biāo)記物 熒光金(FG) 購(gòu)自美國(guó)熒光金公司(Fluorochrome LtD)麻醉藥品 鹽酸氯胺酮注射液 上海第一生化藥業(yè)有限公司地西潘注射液 天津金耀氨基酸有限公司固定液 多聚甲醛 購(gòu)自北京化學(xué)試劑品有限公司(三)、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)用SD大鼠90只，雄性，體重200-240克，眼前部檢查、Mydrine散瞳眼底檢查無(wú)異常。用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為5組分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組，每組大鼠各18只。各組大鼠右眼為損傷眼，左眼未做急性高眼壓模型，作為正常對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)方法1、缺血再灌注模型及給藥方法大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮3ml/kg進(jìn)行麻醉，右眼用Mydrin-P散瞳劑散瞳，瞳孔開(kāi)大后，在手術(shù)顯微鏡下(OMS-85，拓?fù)淇倒? 日本)將連接生理鹽水瓶輸液管的7號(hào)小兒頭皮針刺入大鼠前房，避免損傷虹膜及晶體，鹽水瓶至與實(shí)驗(yàn)眼垂直距離150cm處，此高度可在眼內(nèi)形成110mmHg(15.96Kpa)的眼壓，此時(shí)肉眼可見(jiàn)球結(jié)膜蒼白，眼底鏡可見(jiàn)視網(wǎng)膜缺血，維持60分鐘。而后降低鹽水瓶達(dá)動(dòng)物水平，撥出針頭，可見(jiàn)眼結(jié)膜充血，視網(wǎng)膜血液重新再灌注。陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組于急性高眼壓損傷后2小時(shí)及此后每天灌胃生理鹽水5ml/kg、1％燈盞細(xì)辛5ml/kg(購(gòu)自云南省)、0.25％百路達(dá)5ml/kg、1％百路達(dá)5ml/kg和4％百路達(dá)5ml/kg。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為28天。
2、逆行標(biāo)記動(dòng)物安死術(shù)前5天，采用雙上丘注射法逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。6％水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射使動(dòng)物麻醉，將其固定在腦立體定位儀上(900型腦立體定位儀David Kopf儀器公司 美國(guó))，牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，用微量注射器吸取3％熒光金(溶于0.9％生理鹽水中)，每側(cè)上丘注射兩點(diǎn)(前囟后-5.9和-6.4，旁開(kāi)1.4，深4.0)，每點(diǎn)注射1.5ul。
3、視網(wǎng)膜鋪片在上方球結(jié)膜以碳素標(biāo)記，立即取出眼球固定于4％多聚甲醛磷酸緩沖液中2小時(shí)。沿角膜緣后0.5mm剪開(kāi)眼球，去除角膜和晶狀體，分離視網(wǎng)膜并將其定向平鋪，空氣中自然干燥。Vectashield H-100熒光增強(qiáng)劑及市售無(wú)色指甲油封片。熒光顯微鏡拍攝照片(AH-2奧林巴司公司 日本)，距離視乳頭中心2mm上下左右各拍攝照片一張，照片放大倍數(shù)125×。
剔除標(biāo)準(zhǔn)1)前房穿刺致眼內(nèi)出血及眼內(nèi)炎，嚴(yán)重?fù)p傷虹膜及晶狀體。2)RGCs熒光標(biāo)記不良，部分區(qū)域標(biāo)記不上。
圖像分析及統(tǒng)計(jì)方法使用聯(lián)想Mustek掃描儀將照片以100dpi掃入計(jì)算機(jī)，使用顆粒分析軟件(CPAS)進(jìn)行節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將上下左右4張照片節(jié)細(xì)胞數(shù)量累加，并轉(zhuǎn)化成節(jié)細(xì)胞密度。右眼節(jié)細(xì)胞密度與左眼節(jié)細(xì)胞密度之比定義為節(jié)細(xì)胞存活率，即節(jié)細(xì)胞存活率＝右眼節(jié)細(xì)胞密度/左眼節(jié)細(xì)胞密度*100。使用SPSS for Windows 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用單因素方差分析(ANOV)，兩兩比較采用均數(shù)t檢驗(yàn)。以p＜0.05具有顯著性差異，以p＜0.01具有高度顯著性差異。
(四)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中由于麻醉及操作意外導(dǎo)致部分大鼠死亡，個(gè)別大鼠因節(jié)細(xì)胞標(biāo)記不良而使標(biāo)本不能使用。各實(shí)驗(yàn)組實(shí)際可使用的大鼠數(shù)量見(jiàn)表4。陰性對(duì)照組節(jié)細(xì)胞存活率介于53.97％與76.59％之間，平均存活率為67.54％，標(biāo)準(zhǔn)差為±7.50％。按節(jié)細(xì)胞存活率計(jì)算，陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組節(jié)細(xì)胞的存活率分別為74.25％、73.47％、78.85％和81.14％。各組節(jié)細(xì)胞存活率及其平均值見(jiàn)表5。各組平均節(jié)細(xì)胞存活率及其標(biāo)準(zhǔn)差見(jiàn)圖3。
表4 實(shí)驗(yàn)中各組最終的大鼠數(shù)量(只)陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組 高劑量組動(dòng)物數(shù)量15 1312 13 14各組節(jié)細(xì)胞存活率的單因素方差分析表明，它們之間存在顯著性差異(p＜0.05)。兩兩比較顯示，陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量用藥組、中劑量用藥組和高劑量用藥組之間存在顯著性差異(p＜0.05all groups)。說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照藥物燈盞細(xì)辛與三個(gè)劑量組的銀杏葉提取物都能有效地保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。高劑量銀杏葉提取物保護(hù)作用好于1％燈盞細(xì)辛組。各組間的兩兩比較見(jiàn)表6。
在用藥組之中，低劑量用藥組與陰性對(duì)照組之間存在顯著性差異(p＝0.0040)，高劑量用藥組與低劑量用藥組之間存在顯著性差異(p＝0.0178)，而高劑量用藥組與中劑量用藥組之間未見(jiàn)顯著性差異(p＝0.0540)，但其節(jié)細(xì)胞存活率仍然有所提高，從79％提高到81％。三個(gè)劑量組的量效關(guān)系見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，百路達(dá)浸膏低劑量就可以保護(hù)節(jié)細(xì)胞，隨著劑量的增加，其保護(hù)作用增強(qiáng)。百路達(dá)浸膏的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用有比較好的量效關(guān)系。
陽(yáng)性對(duì)照組與高劑量用藥組之間存在顯著性差異，陽(yáng)性對(duì)照組與低中劑量用藥組之間均未見(jiàn)顯著性差異。陽(yáng)性對(duì)照組的藥物濃度與中劑量用藥組的藥物濃度相當(dāng)，比低劑量用藥組藥物濃度高4倍。
表5.各組節(jié)細(xì)胞存活率(％)陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組 高劑量組74.8682.1067.7577.9671.8667.1662.9164.1478.0785.2967.8270.5373.5290.4279.0066.4264.5078.6965.4382.8482.2671.1573.8474.6887.6968.4583.4875.3276.3384.9160.1277.1482.4782.3077.4859.2366.0073.7873.0878.7166.6080.8171.8383.6068.3853.9777.4675.9980.4982.9471.3474.1776.4380.5782.2374.3976.9667.9483.0787.5261.2878.04 79.1181.5762.67 85.5776.59
平均值 67.54 74.25 73.47 78.85 81.14標(biāo)準(zhǔn)差 7.506.74 5.05 5.99 5.65表6.各組節(jié)細(xì)胞存活率的的比較(p值)陽(yáng)性對(duì)照 低劑量組 中劑量組 高劑量組陰性對(duì)照0.02 0.03 0.0002 0.00008陽(yáng)性對(duì)照 0.75 0.08 0.008低劑量組 0.02 0.001中劑量組 0.32(五)、討論1、關(guān)于急性高眼壓模型研究節(jié)細(xì)胞損傷特點(diǎn)及視神經(jīng)保護(hù)藥物，利用大鼠急性高眼壓模型模型比較成熟。在我們的實(shí)驗(yàn)中，采用前房穿刺的方法升高眼壓，并維持110mmHg，持續(xù)60分鐘。這個(gè)壓力使大鼠視網(wǎng)膜完全缺血，這一點(diǎn)可以通過(guò)觀察眼底血管得以證明。此動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)眼的條件一致，如相同的壓力和相同的持續(xù)時(shí)間，操作簡(jiǎn)單，易控制，費(fèi)用低，這為進(jìn)一步的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)研究及篩選神經(jīng)保護(hù)藥物奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了缺血60分鐘，陰性對(duì)照組中節(jié)細(xì)胞平均存活率為67.54±7.50％，該模型節(jié)細(xì)胞丟失比例較穩(wěn)定。Selles-Navarro I等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用熒光金行上丘逆行標(biāo)記RGCs后，胞漿內(nèi)熒光金的存在不超過(guò)3周。隨時(shí)間進(jìn)展可能熒光金丟失熒光或被代謝。本研究于動(dòng)物處死前5天行熒光金逆行標(biāo)記上丘，標(biāo)記的RGCs呈金黃色強(qiáng)熒光，各象限均勻。通過(guò)熒光金上丘逆行標(biāo)記RGCs，便于RGCs的定量、定性研究。
2、燈盞細(xì)辛的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用我們的結(jié)果與以往的研究相一致，以節(jié)細(xì)胞存活率為指標(biāo)，燈盞細(xì)辛有明顯的保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。1％燈盞細(xì)辛組的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用與4％百路達(dá)組有顯著性差異(P＜0.05)，而與0.25％及1％百路達(dá)組沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，表明1％燈盞細(xì)辛與0.25％及1％百路達(dá)保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用相當(dāng)，4％百路達(dá)比1％的燈盞細(xì)辛的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用強(qiáng)。
3、百路達(dá)的節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用我們通過(guò)大鼠急性高眼壓模型，以節(jié)細(xì)胞存活率為指標(biāo)，結(jié)果表明，低、中、高劑量組的百路達(dá)均具有節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用。低劑量組節(jié)細(xì)胞存活率比陰性對(duì)照組提高了5.93％，中劑量組比低劑量組提高了5.38％，高劑量組比中劑量組提高了2.29％。不同劑量的百路達(dá)表現(xiàn)出很好的量效關(guān)系。隨著藥物濃度的提高，節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用不斷增強(qiáng)，雖然中劑量組與高劑量組之間無(wú)顯著性差異，但高劑量組節(jié)細(xì)胞存活率有所提高。
4、百路達(dá)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制銀杏葉提取液主要含有24％的黃酮醇苷、6％的內(nèi)脂和7％花青素前體，還有一些未定性的化合物。其保護(hù)視神經(jīng)的機(jī)理可能是1.具有拮抗血小板活化因子的作用，銀杏內(nèi)脂目前被認(rèn)為是最有臨床應(yīng)用前景的天然血小板活化因子受體拮抗劑，2.清除自由基，銀杏葉提取物中的還原性羥基功能團(tuán)，可直接發(fā)揮抗氧化作用，清除氧自由基，減輕或阻滯脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化引起的視網(wǎng)膜功能與形態(tài)學(xué)的損傷。3.對(duì)血液循環(huán)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，銀杏提取液能夠增加腦血管及周?chē)艿难髁浚寡蹌?dòng)脈血流增加24％。4.對(duì)缺血損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)脂可改善缺血-再灌注損傷對(duì)心肌和肝的損害，提高肝缺血大鼠的存活率，顯著降低肝缺血損傷。同時(shí)，它還能夠減少谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的過(guò)載。
總之，百路達(dá)與燈盞細(xì)心都能保護(hù)大鼠視神經(jīng)夾傷模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，百路達(dá)是銀杏葉提取物，屬于植物藥范疇，毒副作用小，使用安全。它的作用很可能是多側(cè)面、多靶點(diǎn)的。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式以制取銀杏葉浸膏40毫克規(guī)格的膠囊為例參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)處方 以10萬(wàn)粒計(jì)單位kg銀杏葉干浸膏 4.00乳糖 14.82硬脂酸鎂 0.29微粉硅膠 0.39工藝取銀杏葉浸膏加乳糖混合打粉，制粒，硬脂酸鎂、微粉硅膠過(guò)篩后與之混合，然后整粒，裝膠囊。每粒含銀杏葉浸膏40mg，含總黃酮醇苷9.6mg。
根據(jù)銀杏葉提取物在青光眼節(jié)細(xì)胞保護(hù)方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議成人服用劑量為1～2粒/天。
本發(fā)明還可用常規(guī)工藝制成注射劑、片劑、口服液、顆粒劑。
權(quán)利要求
1.一種銀杏葉提取物的用途，其特征在于它是將銀杏葉提取物與輔料采取常規(guī)工藝制成制劑，用于視神經(jīng)的保護(hù)。
2.按照權(quán)利要求1所述的銀杏葉提取物的用途，其特征在于所述的制劑可以是膠囊劑、片劑、注射劑、口服液、顆粒劑。
3.按照權(quán)利要求1所述的銀杏葉提取物的用途，其特征在于所述的視神經(jīng)保護(hù)包括青光眼的治療。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的銀杏葉提取物的用途，其特征在于所述的制劑中銀杏葉提取物與輔料的重量比例為20％-80％∶80％-20％。
5.按照權(quán)利要求1或3所述的銀杏葉提取物的用途，其特征在于所述的視神經(jīng)保護(hù)是對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的修復(fù)和保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種銀杏葉提取物的用途，它是將銀杏葉提取物與輔料采取常規(guī)工藝制成制劑，用于視神經(jīng)的保護(hù)。本發(fā)明由于來(lái)自于植物，含有60多種成分，其中30多種成分都是它在自然界中所特有的，具有毒副作用小，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病有獨(dú)特的療效等優(yōu)點(diǎn)，是一種視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)的理想藥物。
文檔編號(hào)A61K9/16GK1546091SQ20031010944
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者徐亮, 馬科, 胡林森, 謝躍進(jìn), 徐 亮 申請(qǐng)人:上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司