專利名稱：phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用及其家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和制備方法
phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用及其家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子在制備家蠶定點轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，還涉及含有phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和利用該系統(tǒng)的制備定點轉(zhuǎn)基因家蠶的方法。
背景技術(shù)：
中國是一個蠶絲大國，也是古代絲綢之路的發(fā)源地。家蠶是目前世界上人類利用的最成功和最悠久的經(jīng)濟昆蟲之一，家蠶的馴化、飼養(yǎng)已有約五千年歷史。家蠶作為一種相當重要的鱗翅目模式生物，具有深入研究的重要價值和意義。隨著家蠶基因組框架圖、精細圖和遺傳突變圖譜的完成，標志著家蠶基因組研究已逐步進入功能基因組時代?；蚬δ苎芯考夹g(shù)平臺和特異位點突變材料是推動家蠶功能基因組深入研究的關(guān)鍵，也是推動家蠶作為鱗翅目昆蟲模式化的關(guān)鍵。家蠶研究領(lǐng)域，常用PiggyBac和Minos轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶，但是上述方法均是通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因隨機插入家蠶基因組內(nèi)。由于外源基因在染色體的插入位置或插入拷貝數(shù)不同，會導(dǎo)致外源基因的表達受到位置效應(yīng)的影響，并且可能導(dǎo)致宿主自身所含基因的突變失活，即插入突變現(xiàn)象。而利用位點特異性重組(Site-specific recombination, SSR)技術(shù)則能夠有效克服轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源基因在基因組隨機整合而不具有靶向性和易受整合的位置效應(yīng)影響等缺點。
位點特異性重組技術(shù)是目前實現(xiàn)基因定點插入與定點敲除最有效的手段之一，其作為一項十分有效的、高靶向性的基因功能研究和遺傳改造的方法體系，已被廣泛應(yīng)用于擬南芥、小鼠、果蠅等多種模式生物，正逐漸成為轉(zhuǎn)基因動植物研究領(lǐng)域進行基因操作的強有力工具。目前最常用的位點特異性重組系統(tǒng)包括FLP/FRT、Cre/loxP和phiC31/att系統(tǒng)。鏈霉菌噬菌體phiC31整合酶作為絲氨酸重組酶家族的成員，可催化細菌附著位點(attB位點)和噬菌體附著位點(attP位點)間發(fā)生有效的單向性重組。attB位點和attP位點的最小長度分別為34-bp和39-bp，attB位點和attP位點重組后產(chǎn)生attL和attR2個不同序列的重組位點。在沒有輔因子的情況下，phiC31整合酶無法再介導(dǎo)attL和attR位點間發(fā)生重組反應(yīng)。這種不 可逆的重組以及較短重組位點的特點吸引了許多研究者進一步研究phiC31整合酶在高等真核生物遺傳工程的潛在應(yīng)用價值。目前，phiC31/att系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于擬南芥、小麥、煙草、小鼠，果蠅，蚊子、爪蟾、斑馬魚等高等真核生物的研究中，實現(xiàn)了基因敲除、基因敲入、點突變、缺失突變、染色體大片段刪除等基因工程操作。在家蠶研究中，Nakayama等人于2006年利用phiC31/att系統(tǒng)在體外培養(yǎng)的BmM細胞系中實現(xiàn)了染色體上和染色體外識別位點間的重組Jonemura等人于2012年在家蠶胚胎中實現(xiàn)了利用phiC31整合酶實現(xiàn)的質(zhì)粒之間的盒式交換反應(yīng)(phiC31integrase-RMCE)。以上研究證實了 phiC31整合酶在家蠶細胞和胚胎中的活性。但是，基于phiC31/att系統(tǒng)的位點特異性整合技術(shù)體系尚未在家蠶個體水平上建立。因此，探索利用phiC31/att系統(tǒng)的位點特異性重組技術(shù)來實現(xiàn)家蠶定點轉(zhuǎn)基因的方法，為有效消除插入位置效應(yīng)對基因表達的影響，為家香的基因功能研究、不同蛋白表達研究等提供良好的基礎(chǔ)，同時這也是推動家香功能基因組研究發(fā)展的需要和必然。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的在制備家蠶定點轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供含有phiC31重組酶系統(tǒng)和PiggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；本發(fā)明的目的之三在于提供利用家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因家蠶的方法。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為:
1.phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子在制備家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中的應(yīng)用。
2.基于phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，包括piggyBac重組載體、含目的基因表達框的重組載體和phiC31重組酶,所述piggyBac重組載體中含有2個同向排列的attB位點或attP位點，所述含目的基因表達框的重組載體的目的基因表達框兩端錨定有同向的attP位點或attB位點。
優(yōu)選的，所述piggyBac重組載體的attB位點或attP位點5’端含有以眼神經(jīng)組織特異啟動子3XP3啟動紅色熒光蛋白表達的表達框。該表達框也可以表達其他標記物，只要能夠?qū)崿F(xiàn)篩選目的即能實現(xiàn)發(fā)明目的。
更優(yōu)選的,所述P i ggyBac重組載體由如下步驟制備:將2個at tB位點或at tP位點通過酶切位點連入pSLfall80fa載體中，用AscI單酶切后回收含2個同向排列attB位點或attP位點的片段,然后連入pBac[3XP3_DsRedaf]載體,得piggyBac重組載體。piggyBac重組載體也可以采用其他方法構(gòu)建，只要在載體中含有不影響其他功能基因表達的兩個同向排列的attB位點或attP位點即可。
更優(yōu)選的，2個attB位點或attP位點其中一個通過SpeI和XhoI連入pSLfall80fa載體中，另一個通過SphI和BglII連入pSLfall80fa載體中。
優(yōu)選的，所述含目的基因表達框為以眼和神經(jīng)特異啟動子啟動綠色熒光蛋白表達的表達框。
最優(yōu)選的，所述attP位點的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第6_44位所示；所述attB位點的核苷酸序列如SEQ ID N0.5第3_39位所示。
3.利用所述家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)制備定點轉(zhuǎn)基因家蠶的方法，包括如下步驟:
a.將piggyBac重·組載體和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化解除滯育的蠶卵，篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶，然后通過連續(xù)自交建立轉(zhuǎn)基因靶品系；
b.將步驟a所得轉(zhuǎn)基因靶品系產(chǎn)生的蠶卵用含目的基因表達框的重組載體和phiC31重組酶表達體轉(zhuǎn)化，即獲得定點轉(zhuǎn)基因家蠶。
優(yōu)選的，所述phiC31重組酶表達體為表達phiC31重組酶的載體或phiC31重組酶mRNA ο
更優(yōu)選的，所述輔助質(zhì)粒為PHA3PIG。
本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了一種家蠶定點轉(zhuǎn)基因的方法，首次將phiC31/att系統(tǒng)與piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,從而有效地突破了家蠶定點轉(zhuǎn)基因技術(shù)的瓶頸。利用上述技術(shù)路線，可以有效地實現(xiàn)家蠶定點轉(zhuǎn)基因，其具有以下的明顯優(yōu)勢:
①本發(fā)明家蠶定點轉(zhuǎn)基因的方法，可實現(xiàn)將外源目的基因定點整合至預(yù)先確定的家蠶染色體靶位點，從而能夠有效克服單純依靠PiggyBac等轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源目的基因在家蠶基因組隨機整合而不具有靶向性和易受整合的位置效應(yīng)影響等缺點；②本發(fā)明首先利用piggyBac轉(zhuǎn)座子在家蠶基因組插入的隨機性,可建立在家蠶染色體不同位置含有革巴位點插入的多個轉(zhuǎn)基因靶品系，一旦篩選到外源目的基因表達水平最高的一個靶品系，該轉(zhuǎn)基因靶品系含有的靶位點即可作為外源基因的接納位點，隨后利用本發(fā)明定點轉(zhuǎn)基因的方法將有用蛋白基因表達框定點整合至該接納位點，即能夠?qū)崿F(xiàn)用外源蛋白在家蠶體內(nèi)的高效表達，建立高效穩(wěn)定的家蠶生物反應(yīng)器；③本發(fā)明通過家蠶胚胎顯微注射phiC31整合酶表達載體或phiC31整合酶mRNA的方法引入phiC31整合酶的表達，利用phiC31整合酶在發(fā)育早期的家蠶胚胎中介導(dǎo)外源基因在靶位點的定點整合，由于phiC31整合酶表達載體和phiC31整合酶mRNA會在家蠶發(fā)育過程中逐漸降解，從而有效避免了因phiC31整合酶在家蠶體內(nèi)的過量積累而產(chǎn)生毒性的風(fēng)險；④本發(fā)明中供體質(zhì)粒設(shè)計簡便，外源目的基因表達框經(jīng)簡單的酶切連接即可成為用于定點轉(zhuǎn)基因的供體質(zhì)粒。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
圖1家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體pBac{3XP3_DsRed ;attP/attP}和供體質(zhì)粒pSL {attB-3 X P3-EGFP-SV40-attB}結(jié)構(gòu)示意圖(A:重組載體 pBac {3 X P3_DsRed ；attP/attP} ；B:供體質(zhì)粒 pSL{attB-3XP3-EGFP-SV40-attB})。
圖2為家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體pBac {3XP3_DsRed ；attB/attB}和供體質(zhì)粒pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40-attP}結(jié)構(gòu)示意圖(A:重組載體 pBac {3 X P3_DsRed ；attB/attB} ；B:供體質(zhì)粒 pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40-attP})。
圖3為phiC31整合酶表達載體pSLA3_Int和原核表達載體pET-1nt結(jié)構(gòu)示意圖(A:表達載體pSLA3-1nt ；B:原核表達載體pET_Int)。
圖4為GO代非滯育蠶卵顯微注射重組載體pBac {3 X P3_DsRed ；attP/attP}與輔助質(zhì)粒PHA3PIG混合液后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖。
圖5 為 G1-P轉(zhuǎn)基因家香檢測結(jié)果圖(A:Southern blotting檢測；B:1nverse PCR檢測)。
圖6為轉(zhuǎn)重組載 體pBac{3XP3-DsRed ;attP/attP}的轉(zhuǎn)基因家蠶基因組結(jié)構(gòu)示意圖。
圖7 為顯微注射 pSLA3_Int 和供體質(zhì)粒 pSL {attB-3 X P3-EGFP-SV40-attB}篩選到陽性轉(zhuǎn)基因家蠶在白光、紅色熒光和綠色熒光下的觀察結(jié)果圖。
圖8為陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶檢測結(jié)果圖(A:Southern blotting檢測；B:基因組PCR檢測，WT表示非轉(zhuǎn)基因家蠶，TTSl-P表示重組前轉(zhuǎn)基因家蠶，TTS3-P (1,2,3)表示陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶)。
圖9為phiC31整合酶介導(dǎo)供體質(zhì)粒pSL {attB-3 X P3-EGFP-SV40_attB}定點整合示意圖。
圖10為GO代非滯育蠶卵注射重組載體pBac {3 X P3_DsRed ；attB/attB}與輔助質(zhì)粒pHA3PIG的混合液后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
圖11為Gl代陽性轉(zhuǎn)基因家蠶的基因組結(jié)構(gòu)示意圖。
圖12 為注射 pSLA3_Int 和供體質(zhì)粒 pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40-attP}混合物后篩選到陽性轉(zhuǎn)基因家蠶個體在白光、紅色熒光和綠色熒光下的觀察結(jié)果。
圖13為陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶個體的檢測結(jié)果圖(A:Southern blotting檢測；B:基因組PCR檢測；WT表示非轉(zhuǎn)基因家蠶；TTS1-B表示重組前轉(zhuǎn)基因家蠶；TTS3-B-1，2，3表示陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶)。
圖14 為 phiC31 整合酶介導(dǎo)的供體質(zhì)粒 pSL{attP-3XP3-EGFP-SV40_attP}定點整合示意圖。
圖15 為注射 phiC31 整合酶 mRNA 和供體質(zhì)粒 pSL{attP-3XP3-EGFP-SV40_attP}混合物陽性轉(zhuǎn)基因家蠶個體在白光、紅色熒光和綠色熒光下的觀察結(jié)果。
具體實施方式
下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明中使用的pCMVInt載體由美國斯坦福大學(xué)Michele P.Calos博士饋贈，并提供載體全序列。
實施例1
一、構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體 pBac {3XP3_DsRed ；attP/attP}
依據(jù)目前家蠶基于piggyBac轉(zhuǎn)座載體的制備轉(zhuǎn)基因家蠶的要求,構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體pBac {3XP3_DsRed ;attP/attP}(圖1A)。具體步驟方法如下:合成attPl-Spel/Xho1-F:5 -ctagtccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggc-3，(SEQ ID N0.1),attPl-Spel/Xho1-RSj -tc￡agcccccaactgagagaactcaaaggttaccccagttgggga-3> (SEQ IDN0.2), attP2-SphI/BglI1-F:5’ -ccccaactggggtaacctttgagttctctcagttggggga-3> (SEQID N0.3)和 attP2_SphI/BglI1-R:5，-^atctcccccaactgagagaactcaaaggttaccccagttggggmiS-3’ (SEQ ID N0.4)四條核苷酸序列，下劃線表示酶切位點粘性末端。將合成的SEQID N0.1與SEQ ID N0.2在溫度為95°C預(yù)變性5min，然后每60s降溫1°C，降至25°C時保溫5min，最后4°C保存，得attP位點I，退火形成核苷酸鏈帶Spel/Xhol粘性末端；將SEQID N0.3與SEQ ID N0.4在溫度為95°C預(yù)變性5min，然后每60s降溫1°C，降至25°C時保溫5min,最后4°C保存,得attP位點II,退火形成的核苷酸鏈帶Sphl/Bglll粘性末端。然后將attP位點I和attP位點II分別通過Spel/Xhol和Sphl/Bglll連入pSLfall80fa載體(Carsten Horn, et al2000)形成 pSL {attP/attP},再用 AscI 單酶切 pSL {attP/attP}載體，回收384bp的包含2個同向排列attP位點的片段并連接入pBac [3XP3_DsRedaf] (AichunZhao, et al2010)載體，形成重組載體 pBac {3XP3_DsRed ；attP/attP}。
構(gòu)建的重組載體pBac{3XP3_DsRed ；attP/attP}以眼神經(jīng)組織特異啟動子3XP3啟動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標記,其后含有2個同向排列的39bp的attP位點。
二、供體質(zhì)粒 pSL{attB-3XP3-EGFP-SV40_attB} 的構(gòu)建
以pSLfall80fa為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建被2個同向排列的34bp的attB位點錨定目的基因表達框的序列，并將該表達框連接進入pSLfall80fa載體產(chǎn)生供體質(zhì)粒(圖1B)。具體構(gòu)建步驟如下:合成 attBl-Spel/Xho1-F:5，-ctagtgtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgCgC-Sj(SEQ ID N0.5),attBl-Spel/Xho1-R:5J-tcgagcgcgcccggggagcccaagggcacgccctggcac旦_3，(SEQ ID N0.6),attB2-SphI/BglII_F:5，-￡gtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgeg這_3，(SEQ ID N0.7)和 attB2-SphI/BglI1-R:5，-gatctcgcgcccggggagcccaagggcacgccctRRcacRcatR-3，(SEQ ID N0.8)四條核苷酸序列，下劃線表示酶切位點粘性末端。將合成的SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6在95°C預(yù)變性5min，然后每60s降溫1°C，至25°C時保溫5min,最后于4°C保存,得attB位點I，所得核苷酸序列兩端含有SpeI和XhoI粘性末端；將SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8在95°C預(yù)變性5min，然后每60s降溫1°C，至25°C時保溫5min,最后于4°C保存，得attB位點II，所得核苷酸序列兩端含有SphI和BglII酶切位點的粘性末端。將獲得的attB位點I和attB位點II分別通過SpeI與XhoI以及SphI與BglII連入 pSLfal 180fa 載體中，形成 pSL {attB/attB}。
將pSL{3XP3-EGFP_SV40}載體(參見 Long, D.P.，Zhao, A.C.，Chen, X.J., Zhang, Y., Lu,W.J., Guο , Q., Handler,A.M., Xiang, Z.H., 2012.FLPrecombinase—mediated site-specific recombination in silkworm, Bombyx mor1.PloS 0ne7, e40150.GenBank:KC897088)利用 XhoI/SphI 雙酶切，回收 1.3kb 的3XP3-EGFP-SV40表達框序列，將其連接入相同酶切的pSL {attB/attB}載體，形成供體質(zhì)粒 pSL{attB-3XP3-EGFP-SV40-attB}。
三、構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體pBac{3XP3_DsRed ；attB/attB}
依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中基于piggyBac轉(zhuǎn)座載體的獲得轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù),構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體pBac{3XP3_DsRed ;attB/attB}(圖2A)。具體構(gòu)建方法如下:用AscI單酶切上述得到的pSL {attB/attB}載體，回收375bp的包含2個attB位點同向排列的片段并連接入 pBac {3XP3_DsRedaf}載體 ，形成重組載體 pBac {3XP3_DsRed ;attB/attB}。構(gòu)建的重組載體pBac{3XP3-DsRed ；attB/attB}以眼神經(jīng)組織特異啟動子3 XP3啟動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標記,其后含有2個同向排列的34bp的attB位點。
四、供體質(zhì)粒pSL{attP-3XP3-EGFP-SV40_attP}的構(gòu)建
以pSLfal 180fa為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建含有被2個同向的長度為39bp的attP位點錨定目的基因表達框的序列，并將該表達框連接進入pSLfal 180fa載體產(chǎn)生供體質(zhì)粒(圖2B)。具體構(gòu)建方法如下:利用XhoI/SphI雙酶切pSL{3XP3-EGFP-SV40}載體，回收1.3kb的3XP3-EGFP-SV40表達框序列，將其連接入經(jīng)相同酶切的pSL {attP/attP}載體，形成供體質(zhì)粒 pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40-attP}。
五、phiC31整合酶表達載體的構(gòu)建
根據(jù)phiC31整合酶基因序列(GenBank:⑶564445.1)設(shè)計擴增引物，上游引物 Int-F-Kpnl:5，-tataggtaccgtcgccgacatgacaca—3’ (SEQ ID N0.9),下劃線為KpnI 酶切位點；下游引物 Int-R-Sph1:5’ -tatagcatgcacgcgtaagcttggg-3’ (SEQ IDN0.10)，下劃線為SphI酶切位點，然后以pCMVInt載體(參見Groth，A.C., Olivares, E.C., Thyagarajan, B., Calos, Μ.P.,2000.A phage integrase directs efficientsite-specific integration in human cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A97, 5995 -6000.)為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min進行30個循環(huán)，然后72°C延伸8min，最后4°C保存，PCR擴增得到1.9kb的phiC31整合酶基因片段，經(jīng)KpnI/SphI雙酶切后連接進入pSLfall80fa載體形成pSL-1nt。
根據(jù)家蠶肌動蛋白A3多聚腺苷酸信號序列(A3polyA) (GenBank:U49854.1)設(shè)計擴增引物，上游引物 A3polyA_F_Sph1:5’ -gcatgcatgcaggaagtgcttctaagcgt_3’ (SEQ IDN0.11),下劃線為 SphI 酶切位點；下游引物 A3poIyA-R-BamH1:5’ -gcatggatccgtgctcctagcgtaactgtc-3’ (SEQ ID N0.12)，下劃線為BamHI酶切位點，然后以家蠶基因組為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，57.5°C退火30s，72°C延伸30s進行30個循環(huán)，然后72°C延伸5min，最后4°C保存，經(jīng)PCR擴增得到0.37kb的家蠶肌動蛋白A3多聚腺苷酸信號序列(A3polyA)片段，然后經(jīng)Sphl/BamHI雙酶切連接進入pSL_Int載體形成 pSL-1nt_A3polyA。
根據(jù)家蠶A3啟動子序列(GenBank:U49854.1)設(shè)計擴增引物，上游引物A3_F_Sac1:5，-tatcgagctcatgcgcgttaccatatatggtg-3' (SEQ ID N0.13),下劃線為 SacI酶切位點；下游引物 A3_R_Kpn1:5’ -tataggtacccttgaattagtctgcaagaaaag-3’ (SEQ IDN0.14)，下劃線為KpnI酶切位點，然后以pHA3PIG質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，PCR擴增條件是94°C預(yù)變性5min ;94°C變形30s，60°C退火30s，72°C延伸35s進行30個循環(huán)，然后72°C延伸5min，最后4°C保存，擴增得到0.65kb的家蠶A3啟動子片段，然后經(jīng)Sacl/Kpnl雙酶切連接進入pSL-1nt-A3po lyA載體形成phiC31整合酶表達載體pSLA3_Int (圖3A)。
六、構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄phiC31整合酶mRNA的原核表達載體
根據(jù)phiC31整合酶基因序列設(shè)計擴增引物,上游引物Int-F-NcoI:5J-aatccatgggcatgacacaaggggttgtg-3’(SEQ ID N0.15),下劃線為 NcoI 酶切位點；下游引物 Int-R-XhoI5’-atactcgagctacgccgctacgtcttc_3’ (SEQ ID N0.16),下劃線為 XhoI 酶切位點，然后同樣以pCMVInt載體為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變形30s，60°C退火30s，72°C延伸2min進行30個循環(huán)，然后72°C延伸8min，最后4°C保存，經(jīng)PCR擴增得到1.9kb的phiC31整合酶基因片段。將擴增得到的基因片段連接pMD19-T simple載體(Takara)形成T-1nt質(zhì)粒，由于phiC31整合酶基因序列中含有一個NcoI酶切位點，因此用NcoI和XhoI不完全酶切T-1nt質(zhì)粒，然后將酶切獲得1.9kb的目的片段連接入pET28a(+ )載體(Novagen),形成重組原核表達載體pET-1nt (圖3B)。
七、phC31整合酶mRNA的制備
用XhoI酶切所得重組原核表達載體pET-1nt使其完全線性化，隨后用酚/氯仿抽提純化酶切產(chǎn)物，并用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。然后參照mMESSAGE mMACHINEjiT7Ultra Kit說明書對phiC31整合酶的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行加帽和加尾反應(yīng)，20 μ L體系的加帽反應(yīng)混合體系中含有I μ g線性化質(zhì)粒，混勻后于37°C水浴下加帽反應(yīng)2小時，然后加入I μ L DNaseI,并于37°C水浴條件下孵育15分鐘終止反應(yīng)；在完全終止加帽反應(yīng)的混合體系中加入加尾反應(yīng)試劑，混勾后于37 C水浴鮮育I小時完成加尾反應(yīng)，最后用MEGAc I ear Kit回收加帽加尾反應(yīng)后的phiC31整合酶mRNA，并用RNAse-free Water溶解并保存于_80°C待用。
實施例2
一、轉(zhuǎn)基因靶品系的建立
用二化滯育家蠶品系大造作為原始材料，親代蠶卵經(jīng)16°C低溫催青處理以解除子代蠶卵的滯育；將10-15nL總濃度為400ng/y L的重組載體pBac {3XP3_DsRed ；attP/attP}與輔助質(zhì)粒pHA3PIG的混合液注射至解除滯育的294粒GO代蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25°C、相對濕度為85%的環(huán)境中催青孵化，孵化獲得80頭GO代蟻蠶，然后將蟻蠶用桑葉飼養(yǎng)至化蛾，獲得74頭GO代蠶蛾，將獲得的蠶蛾通過回交共獲得40圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察，然后篩選發(fā)紅色熒光的蛾圈，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)篩選獲得3個發(fā)紅色熒光的蛾圈，共獲得27頭在眼部發(fā)紅色熒光的陽性轉(zhuǎn)基因家蠶，其轉(zhuǎn)化效率為7.5%。將獲得的發(fā)紅色熒光的陽性轉(zhuǎn)基因家蠶利用inverse PCR和Southernblotting鑒定，并將檢測轉(zhuǎn)基因個體命名為Gl-Ρ，檢測結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，在其中I個陽性蛾圈中PiggyBac轉(zhuǎn)座子在Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶染色體中系單拷貝數(shù)插入，插入位點定位至第20號染色體，所得Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶基因組的結(jié)構(gòu)示意圖如圖6所示。將該蛾圈的Gl代陽性轉(zhuǎn)基因蠶蛾自交并連續(xù)傳代培養(yǎng)七代，將獲得的純合G8代轉(zhuǎn)基因家蠶系作為轉(zhuǎn)基因靶品系I代(Transgenic target strainl，TTS1)，即建立轉(zhuǎn)基因靶品系TTS1-P。
二、建立定點轉(zhuǎn)基因家蠶系
將濃度為IOOOng/μ L 的供體質(zhì)粒 pSL{attB-3XP3-EGFP-SV40_attB}和濃度為600ng/ μ L的pSLA3-1nt質(zhì)粒混合液通過顯微注射導(dǎo)入由轉(zhuǎn)基因靶品系I代蠶蛾自交獲得的241粒非滯育TTS2-P蠶卵中；隨后用無毒的膠水封閉注射孔(注意注射需在蠶卵產(chǎn)下后6小時內(nèi)完成)；將注射完成的蠶卵在質(zhì)量分數(shù)為35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min，然后置于25°C、相對濕度85%的條件下催青直到孵化，將孵化的115頭TTS2-P蟻蠶飼養(yǎng)至化蛾，獲得28頭TTS2-P蠶蛾，然后將獲得的蠶蛾通過回交獲得22圈TTS3-P蠶卵，所得蠶卵用Olympme電動宏觀熒光顯微鏡觀察，觀察眼部同時發(fā)紅色和綠色熒光的陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶(圖7)。結(jié)果表明獲得I個 含有定點轉(zhuǎn)基因家蠶個體的陽性蛾圈，共獲得5頭在眼部同時發(fā)紅色和綠色熒光的陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶，重組效率為4.55%。提取陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶的基因組DNA,用基因組PCR和Southern blotting驗證,結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示位于供體質(zhì)粒上的2個attB分別和TTS2-P家蠶基因組中的2個attP位點發(fā)生了位點特異性重組反應(yīng)，從而介導(dǎo)3XP3-EGFP-SV40表達框定點整合至靶品系家蠶基因組，其原理如圖9所示。最后，將獲得的陽性定點轉(zhuǎn)基因個體飼養(yǎng)、傳代，即完成陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶系的建立。
實施例3
用二化滯育家蠶品系大造作為原始材料，親代蠶卵經(jīng)16°C低溫催青處理以解除子代蠶卵的滯育，將10-15nL總濃度為400ng/y L的重組載體pBac {3XP3_DsRed ；attB/attB}與輔助質(zhì)粒pHA3PIG的混合液注射至解除滯育的108粒GO代蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25°C、相對濕度為85%的高濕度環(huán)境中催青孵化，將孵化的10頭GO代蟻蠶桑葉收集飼養(yǎng)至化蛾，獲得8頭GO代蠶蛾，通過回交共獲得50圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖10所示。通過觀察篩選獲得I個發(fā)紅色熒光的蛾圈，共獲得I頭在眼部發(fā)紅色熒光的陽性轉(zhuǎn)基因蠶，其轉(zhuǎn)化效率為20%，所得陽性轉(zhuǎn)基因家蠶的基因組結(jié)構(gòu)示意圖如圖11所示。將獲得的該頭Gl代陽性轉(zhuǎn)基因蠶飼養(yǎng)至化蛾，并將蠶蛾回交以獲得G2代陽性家蠶,然后經(jīng)inverse PCR和Southern blotting鑒定,并將檢測轉(zhuǎn)基因個體命名為Gl-B (圖5)。結(jié)果顯示piggyBac轉(zhuǎn)座子在Gl-B轉(zhuǎn)基因家蠶的Gl代陽性轉(zhuǎn)基因家蠶染色體中系單拷貝數(shù)插入，插入位點定位至第I號染色體；篩選由該蠶蛾回交產(chǎn)生的G2代蛾圈，并將陽性轉(zhuǎn)基因蠶蛾自交并連續(xù)傳代培養(yǎng)六代，獲得的G8代轉(zhuǎn)基因家蠶系(包含純合的雄性家蠶和半合子的雌性家蠶個體)。將獲得的G8代轉(zhuǎn)基因家蠶系作為轉(zhuǎn)基因革巴品系I代(Transgenic target strainl, TTS1),即建立轉(zhuǎn)基因祀品系TTS1-B。
通過顯微注射將濃度為IOOOng/ μ L 的 pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40_attP}質(zhì)粒和濃度為600ng/l.! L的pSLA3-1nt質(zhì)?；旌弦汗餐瑢?dǎo)入到由TTSl-B代蠶蛾自交獲得的480粒非滯育TTS2-B蠶卵中；隨后用無毒的膠水封閉注射孔(注意注射需在蠶卵產(chǎn)下后6小時內(nèi)完成);將注射完成的蠶卵在質(zhì)量分數(shù)為35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min，然后置于25°C、相對濕度85%的條件下催青直到孵化，將孵化的313頭TTS2-B蟻蠶飼養(yǎng)至化蛾，獲得120頭TTS2-B蠶蛾，然后通過回交共獲得104圈TTS3-B蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖12所示。結(jié)果表明共獲得3個定點轉(zhuǎn)基因家蠶的陽性蛾圈，共獲得23頭在眼部同時發(fā)紅色和綠色熒光的定點轉(zhuǎn)基因家蠶，重組效率為2.88%。提取陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶個體基因組DNA,經(jīng)基因組PCR和Southern blotting驗證,結(jié)果如圖13所示。結(jié)果顯示位于供體質(zhì)粒上的2個attP分別和TTS2-B家蠶基因組中的2個attB位點發(fā)生了位點特異性重組反應(yīng)，從而介導(dǎo)3XP3-EGFP-SV40表達框定點整合至靶品系家蠶基因組，其原理如圖14所示。最后，將獲得的陽性定點轉(zhuǎn)基因個體飼養(yǎng)、傳代，即完成陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶系的建立。
實施例4
以實施例2中獲得的轉(zhuǎn)基因靶品系TTSl-B作為原始材料，通過顯微注射將濃度為IOOOng/ μ L 的供體質(zhì)粒 pSL {attP-3 X P3-EGFP-SV40-attP}和濃度為 800ng/ μ L 的 phiC31整合酶mRNA混合液共同導(dǎo)入到由TTSl-B代蠶蛾自交獲得的312粒非滯育TTS2-B蠶卵中；隨后用無毒的膠水封閉注射孔(注意注射需在蠶卵產(chǎn)下后6小時內(nèi)完成)；將注射完成的蠶卵在質(zhì)量分數(shù)為35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min，然后置于25°C、相對濕度85%的條件下，進行催青直到孵化，然后將孵化的136頭TTS2-B蟻蠶飼養(yǎng)至化蛾，獲得43頭TTS2-B蠶蛾，然后通過回交共獲得38圈TTS3-B蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖15所示。結(jié)果表明篩選獲得2個含有定點轉(zhuǎn)基因家蠶個體的陽性蛾圈，共獲得16頭在眼部同時發(fā)紅色和綠色熒光的陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶，重組效率為5.26%。提取陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶個體基因組DNA,經(jīng)基因組PCR和Southern blotting驗證,其結(jié)果與圖13相同。結(jié)果顯示，位于供體質(zhì)粒上的2 個attP分別和TTS2-B家蠶基因組中的2個attB位點發(fā)生了位點特異性重組反應(yīng)，從而介導(dǎo)3XP3-EGFP-SV40表達框定點整合至靶品系家蠶基因組；最后，獲得的陽性定點轉(zhuǎn)基因個體飼養(yǎng)、傳代，即完成陽性定點轉(zhuǎn)基因家蠶系的建立。
最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.phiC31重組酶系統(tǒng)和PiggyBac轉(zhuǎn)座子在制備家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中的應(yīng)用。
2.基于phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:包括piggyBac重組載體、含目的基因表達框的重組載體和phiC31重組酶,所述piggyBac重組載體中含有2個同向排列的attB位點或attP位點，所述含目的基因表達框的重組載體中目的基因表達框兩端錨定有同向的attP位點或attB位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:所述piggyBac重組載體的attB位點或attP位點5’端含有以眼神經(jīng)組織特異啟動子3XP3啟動紅色熒光蛋白表達的表達框。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:所述piggyBac重組載體由如下步驟制備:將2個attB位點或attP位點通過酶切位點連入pSLfall80fa載體中，用AscI單酶切后回收含2個同向排列attB位點或attP位點的片段，然后連入pBac [3 XP3-DsRedaf]載體,得 piggyBac 重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:2個attB位點或attP位點的其中一個attB位點或attP位點通過SpeI和XhoI連入pSLfall80fa載體中，另一個attB位點或attP位點通過SphI和BglII連入pSLfall80fa載體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:所述含目的基因表達框為以眼神經(jīng)組織特異啟動子啟動綠色熒光蛋白表達的表達框。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，其特征在于:所述attP位點的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第6-44位所示；所述attB位點的核苷酸序列如SEQ IDN0.5第3-39位所示。
8.利用權(quán)利要求2-7任一項所述家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)制備定點轉(zhuǎn)基因家蠶的方法，其特征在于，包括如下步驟: a.將piggyBac重組載體和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化解除滯育的蠶卵，篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶，然后通過連續(xù)自交建立轉(zhuǎn)基因靶品系； b.將步驟a所得轉(zhuǎn)基因靶品系產(chǎn)生的蠶卵用含目的基因表達框的重組載體和phiC31重組酶表達體轉(zhuǎn)化，即獲得定點轉(zhuǎn)基因家蠶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述phiC31重組酶表達體為表達phiC31重組酶的載體或phiC31重組酶mRNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方 法，其特征在于:所述輔助質(zhì)粒為PHA3PIG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用及其家蠶定點轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和制備方法，將phiC31重組酶系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)家蠶轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，先piggyBac轉(zhuǎn)座載體中連入2個同向排列的attB位點或attP位點，并將此載體轉(zhuǎn)化家蠶，然后篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶作為靶品系，再利用phiC31重組酶與兩端由同向的attB位點或attP位點錨定目的基因表達框的載體轉(zhuǎn)化靶品系，即可實現(xiàn)目的基因表達框定點轉(zhuǎn)化至piggyBac轉(zhuǎn)座載體的2個attB位點或attP位點之間，從而實現(xiàn)家蠶定點轉(zhuǎn)基因的目的，其操作方法簡單，為家蠶基因功能研究提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/63GK103232977SQ20131018185
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者趙愛春, 龍定沛, 陸威健, 郭慶, 向仲懷 申請人:西南大學(xué)