專利名稱：一種小麥白粉病菌菌株的長期保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物病原菌保存方法的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小麥白粉病菌單孢菌株的長期保存方法。
背景技術(shù)：
小麥(Triticum aestivum L.)是現(xiàn)今世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)極易受細(xì)菌、真菌、病毒等病害影響。在小麥病害中，白粉病是發(fā)生范圍最廣、對產(chǎn)量影響較大的病害之一。小麥?zhǔn)馨追劬：?，在葉片和穗子上出現(xiàn)粉狀斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)葉片發(fā)黃早枯，植株矮小細(xì)弱，光合作用降低，呼吸作用加強(qiáng)，分蘗數(shù)減少，成穗率降低，千粒重下降，一般可減產(chǎn)5% 10%，流行時(shí)可使小麥減產(chǎn)10% 30%。小麥白粉病是由白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici, Bgt)引起的真菌病害，其病原菌是專化型的活體寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上生長。病菌的繁殖轉(zhuǎn)接均需在小麥活體幼苗上每隔10天左右進(jìn)行一次(常規(guī)保存方法)。此外，分生孢子的繁殖收集耗時(shí)長，工作量大，另一方面往往會產(chǎn)生交互污染，致使特定致病性菌株的丟失。因此，建立長期保存方法可以該病菌種群遺傳多樣性、分子抗藥性監(jiān)測大大縮減時(shí)間加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。同時(shí)，保存的不同白粉病菌致病型菌株接種小麥品種，可全面、準(zhǔn)確評價(jià)品種的抗病性，為小麥育種提供輔助。

因此，人們迫切希望在實(shí)驗(yàn)室條件下,尋求一種操作簡便、省時(shí)省力、節(jié)能、并能減少交互感染，延長小麥白粉病菌株保存時(shí)間的方法，以便于開展小麥白粉菌毒性變異及寄主與病原菌互作關(guān)系的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對現(xiàn)行小麥白粉病原菌在小麥活體保存上所存在的保存期短、費(fèi)時(shí)、費(fèi)工及在頻繁轉(zhuǎn)接過程中易產(chǎn)生交互污染等的缺陷，提出一種操作簡便、省時(shí)省力、并能較少不同菌株間的交互污染，能較長時(shí)間保存小麥白粉病菌株的方法，以保證小麥白粉病原菌相關(guān)研究工作的正常開展。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):本發(fā)明一方面涉及一種小麥白粉病菌菌株的長期保存方法，其特征在于包括如下步驟:(I)單孢菌株的采集:從田間采集僅帶有單個(gè)孢子堆的小麥葉片，葉片正面朝上放在含苯駢咪唑的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上，在超凈臺中用牙簽挑取孢子輕輕涂抹葉片上，置于生長間培養(yǎng)(17 土 IV，17-19h光照/天)8-10天，待產(chǎn)生大量新鮮分生孢子，作為初繁菌株備用;(2)單孢菌株的擴(kuò)繁:將上述小麥植株第一葉剪成2.5-3.5cm長葉段擺滿在含有苯并咪唑的保鮮培養(yǎng)基上，在接種塔內(nèi)對上述離體葉段接種預(yù)先初繁繁殖好的新鮮分生孢子，置于生長間培養(yǎng)(17± 1°C，17-19h光照/天)8-10天，產(chǎn)生大量新鮮的分生孢子，待收集保存；(3)分生孢子的收集:在超凈工作臺上對(2)產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)行收集，將培養(yǎng)皿倒扣在硫酸紙上，輕輕用鑷子敲打2-3次，收集到離心管中，每收集一個(gè)菌株更換一張硫酸紙，防止菌株間的交互污染；(4)硅膠緩慢干燥:將直徑3-6mm硅膠顆粒置于離心管中，置于23土 TC下干燥4_6h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低溫冰箱保存。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的超低溫冰箱保存的時(shí)間為1，3，6或12月以上。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的保鮮劑由每百毫升蒸餾水加入0.4-0.6g瓊脂+2-4mL0.1-0.3%的苯并咪唑配制而成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的方法還包括菌株的復(fù)活步驟，所述的復(fù)活步驟為將步驟(4)所述的離心管放入4°C冰盒中使其緩慢升溫，然后按照步驟(I)所述的方法接種到新鮮的葉段中。在本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的菌株的復(fù)活率為90%以上，優(yōu)選為100%。本發(fā)明能夠使小麥白粉病菌的保存時(shí)間更長，由常規(guī)的方法10-12d延長至I年，且方法簡便實(shí)用?？朔顺Ｒ?guī)保存方法操作繁瑣、耗費(fèi)人力、物力較大等缺點(diǎn)，以保證小麥白粉病原菌相關(guān)研究工作的正常開展。本發(fā)明可以在小麥病害研究與育種機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。


圖1:低溫保存12月后囷株致病力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，小麥廣譜高感白粉病品種:鄭麥98，苯并咪唑:化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；干燥硅膠:美國西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)瓊脂:化學(xué)純，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；封口膜:美國parafilm公司生產(chǎn)；實(shí)施例1、小麥白粉病菌菌株緩慢干燥長期保存該方法按以下步驟進(jìn)行:1、單孢菌株的采集與擴(kuò)繁:菌株采集前10天先播種廣譜高感小麥白粉病菌品種“鄭麥98”至一葉一心，備用；從田間采集僅帶有單個(gè)孢子堆的葉片，剪取預(yù)先準(zhǔn)備好的小麥植株第一葉中斷3cm長，葉片正面朝上放在含苯駢咪唑的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上，在超凈臺中用牙簽挑取孢子輕輕涂抹葉片上，置于生長間培養(yǎng)(17土 l°C，18h光照)8-10天，待產(chǎn)生大量新鮮分生孢子，作為初繁菌株備用。將上述小麥植株第一葉剪成3cm長葉段擺滿在鮮培養(yǎng)基上(由IOOmL蒸餾水+0.5g瓊脂+3mL0.2%的苯并咪唑比例配制而成)，在接種塔(15 X 22 X 22cm)內(nèi)對上述離體葉段接種預(yù)先初繁繁殖好的新鮮分生孢子，置于生長間培養(yǎng)(17 土 IV，18h光照/天)8-10天，產(chǎn)生大量新鮮的分生孢子，待收集保存；2、分生孢子的收集:在超凈工作臺上對(I)產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)行收集，將培養(yǎng)皿倒扣在硫酸紙上，輕輕用鑷子敲打培養(yǎng)皿蓋2-3次\，收集到1.5mL離心管中，每收集一個(gè)菌株都需更換一張硫酸紙，防止菌株間的交互污染。同時(shí)用75%酒精對超凈臺滅菌。收集到的分生孢子質(zhì)量以20mg左右為宜；3、硅膠緩慢干燥:將3-4塊的硅膠顆粒(直徑3-6_)置于步驟(2)離心管中，置于23°C下干燥5h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低溫冰箱保存1，3，6和12月；4、分生孢子的致病力測定:在實(shí)際應(yīng)用中，可將步驟(3)所述的離心管放入4°C冰盒中使其緩慢升溫，以免孢子驟熱開裂，然后按照步驟(I)所述的方法接種到新鮮的葉段中。置于生長間中培養(yǎng)(17±l°C，18h光照)8-10天。觀察孢子致病力；5、比較不同保存時(shí)間下菌株的復(fù)活率:按照該方法進(jìn)行不同保存時(shí)間下菌株復(fù)活率的比較。共計(jì)保存20個(gè)菌株，保存時(shí)間分別為1，3，6和12月，以常規(guī)方法保存作為對照。通過致病力檢測表明，采用該方法菌株能夠存活至少12月，且菌株的復(fù)活率為100% (表I和圖1)，而常規(guī)保存雖然也能達(dá)到100%復(fù)活率，但要每隔10天轉(zhuǎn)接種I次，耗時(shí)費(fèi)工，不適合大規(guī)模保存菌株，而本發(fā)明的方法所保存的菌株I年接種一次。表I不同保存時(shí)間下小麥白粉菌株存活率的比較(20個(gè)菌株)
權(quán)利要求
1.一種小麥白粉病菌菌株的長期保存方法，其特征在于包括如下步驟: (1)單孢菌株的采集:從田間采集僅帶有單個(gè)孢子堆的小麥葉片，葉片正面朝上放在含苯駢咪唑的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上，在超凈臺中用牙簽挑取孢子輕輕涂抹葉片上，置于生長間培養(yǎng)(17土 TC，17-19h光照/天)8-10天，待產(chǎn)生大量新鮮分生孢子，作為初繁菌株備用； (2)單孢菌株的擴(kuò)繁:將上述小麥植株第一葉剪成2.5-3.5cm長葉段擺滿在含有苯并咪唑的保鮮培養(yǎng)基上，在接種塔內(nèi)對上述離體葉段接種預(yù)先初繁繁殖好的新鮮分生孢子，置于生長間培養(yǎng)(I 7 ± I °C，17-19h光照/天)8-10天，產(chǎn)生大量新鮮的分生孢子，待收集保存； (3)分生孢子的收集:在超凈工作臺上對(2)產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)行收集，將培養(yǎng)皿倒扣在硫酸紙上，輕輕用鑷子敲打2-3次，收集到離心管中，每收集一個(gè)菌株更換一張硫酸紙，防止菌株間的交互污染； (4)硅膠緩慢干燥:將直徑3-6mm硅膠顆粒置于離心管中，置于23±1°C下干燥4_6h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低溫冰箱保存。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，所述的超低溫冰箱保存的時(shí)間為1，3，6或12月以上。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，所述的保鮮劑由每百毫升蒸餾水加入0.4-0.6g瓊脂+2-4mL0.1-0.3%的苯并咪唑配制而成。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，，所述的方法還包括菌株的復(fù)活步驟，所述的復(fù)活步驟為將步驟(4)所述的離心管放入4°C冰盒中使其緩慢升溫，然后按照步驟(I)所述的方法接種到新鮮的葉段中。
5.按照權(quán)利要求4所 述的方法，所述的菌株的復(fù)活率為90%以上，優(yōu)選為100%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥白粉病菌菌株長期保存方法，該方法包括(1)單孢菌株的擴(kuò)繁；(2)分生孢子的收集；(3)硅膠緩慢干燥5h后；再置于-70℃冰箱保存等步驟。本發(fā)明能夠使小麥白粉病菌的保存時(shí)間更長，由常規(guī)的方法10-12d延長至1年，且方法簡便實(shí)用?？朔顺Ｒ?guī)保存方法操作繁瑣、耗費(fèi)人力、物力較大等缺點(diǎn)，以保證小麥白粉病原菌相關(guān)研究工作的正常開展。本發(fā)明可以在小麥病害研究與育種機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N1/04GK103224888SQ201310180918
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者喻大昭, 龔雙軍, 楊立軍, 曾凡松, 史文琦, 向禮波, 汪華, 張學(xué)江, 薛敏峰 申請人:喻大昭