專利名稱：：栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的cDNA序列及其獲得方法。
背景技術(shù)：
：栽培小麥Brock強(qiáng)抗白粉病，對華北地區(qū)流行的15號優(yōu)勢小種免疫?？拱追鄄√匦苑治鲎C實，Brock存在一個抗白粉病新基因，位于染色體3BL上(Wangetal.，PlantProductionScience,2004,7(3):319;Wangetal"PlantProductionScience,2005,8(5):578)。由于小麥中抗白粉病基因抗性退化和抗源的缺乏，克隆Brock中的新基因，對于抗病機(jī)理研究和抗白粉病育種都有重要意義，為此，我們利用經(jīng)白粉菌15號優(yōu)勢小種脅迫5d的Brock總RNA為模板，以帶接頭的OligodT為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后根據(jù)已發(fā)表的NBS類抗病基因同源序列設(shè)計簡并引物進(jìn)行PCR，結(jié)果獲得一條比預(yù)期分子量大的cDNA片段(NBS片段一般為500bp左右)，將其克隆并測序，發(fā)現(xiàn)該片段兩端分別有上游和接頭引物，進(jìn)而進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)該片段與報道的小麥的TCTP(translationallycontrolledtumorprotein,TCTP)基因的cDNA序列(gi|21070378)有97%的同源性。翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein,TCTP)最初是在鼠腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的(ChitpatimaS,etal.，iV"de/c爿c/rfs及es，1988，16(5):2350)，受翻譯過程所阻遏，與腫瘤生長相關(guān)(BohmH，Wa/.，5/oc/^附./",，1989，19:277)，因此被命名為翻譯控制腫瘤蛋白(GrossB，Wfl/.，iV"c/e/c^lc/rfsWese<wr/i，1989，17:8367;BommerUA，"fl/.，CW/Mo/B/o/i^,1994，40:633)，但是以后的研究發(fā)現(xiàn)TCTP的表達(dá)也受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(XuA，etal"丑/oc/w附/，1999，342:683;KangBS，a/.,/Gewe,，1996，18(2):143)。除腫瘤細(xì)胞外，TCTP還存在于許多除腎細(xì)胞外的人類的正常細(xì)胞中(ThawP，etal.，A^^r""肌o/，2001，8(8):701)，并先后在許多生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)TCTP，其中包括植物、蚯蚓、寄生蟲、水螅、酵母等。研究表明，TCTP具有多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞外組胺釋放(MacDonaldSM，e,fl/"腸歸，1995，269:688)，微管和鈣結(jié)合蛋白(YannickG，e,fl/"7ow7m/o/CW/S"e""，1999，112:1257)、抗凋亡等(SinhaP，Wfl/"Afo/ec"/fl,(mrf^/oc/^m/cfl/Z^nw/to/^j,2000，121:107)，并且發(fā)現(xiàn)TCTP在高等植物中也廣泛存在，重金屬(Al)脅迫(VladimirE,etal"J^"/vi"/o/fi"A:/7en'附e",^^flMj;，2003，54:2745)、黑暗誘導(dǎo)(KimiyoSO，e"/"CW/尸一o/，1998，39(3):357)均可引起TCTPmRNA的積累和表達(dá)。TCTP的這一特性啟示我們，它可能也與小麥的抗白粉病特性有關(guān)。為此，我們用RACE方法，獲得了該基因的全長cDNA，并對該cDNA進(jìn)行了基因的結(jié)構(gòu)分析、氨基酸序列推導(dǎo)、特征結(jié)構(gòu)預(yù)測和白粉菌誘導(dǎo)實驗，我們獲得了Brock中的TCTP全長基因，功能分析證實了我們的推測，它參與了小麥對白粉菌的抗性反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開了栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的新基因cDNA序列。本發(fā)明的另一個目的在于公開了栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的TCTP基因cDNA序列編碼的168aa多肽鏈氨基酸序列。該多肽鏈具有2個特征結(jié)構(gòu)區(qū)(TCTPl和TCTP2)和7個可能的功能位點。本發(fā)明的再一個目的在于公開了栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的新基因cDNA序列的獲得方法。本發(fā)明提供了根據(jù)小麥NBS類抗病基因保守序列設(shè)計的簡并引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和RACE技術(shù)，獲得全長為766bp的完整TCTP基因，與已發(fā)表的小麥TCTP基因有98%的同源性，該基因包括一個507bp的開放閱讀框，36bp的5'端非翻譯區(qū)，223bp的3'端非翻譯區(qū)。編碼一個168aa的多肽鏈氨基酸，與己發(fā)表的小麥TCTP基因編碼的氨基酸序列有99%的同源性。這是迄今為止在小麥白粉菌誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)的又一個新的應(yīng)答基因。本發(fā)明公開的栽培小麥Brock中受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列，為小麥抗白粉病分子機(jī)理研究提供了可靠的依據(jù)，同時拓展了TCTP基因在植物應(yīng)用中的新功能。本發(fā)明的技術(shù)方案如下-栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的TCTP基因cDNA序列，其特征在于它與小麥TCTP基因有98X的同源性，cDNA全長766bp;有一個長36bp的S'UTR和長223bp的3'UTR以及長507bp的開放閱讀框；編碼一個168aa的多肽鏈，cDNA序列為ACAAGCTTT^CGGCGACGAGCTTCTGTCGGATTCGTTCCCTTACAGGGAGCTGGAGAACGGCGTGCTCTGGGAAGTCGATGGCCATTGGGTCGTTCAAGGAGCAGTTGATGTGGACATTGGAGCCAATCCCTCTGCTGAGGGTGGTGGTGATGATGAGGGTGTTGATGACCAGGCCGTGAAGGTGGTTGACATTGTTGACACCTTCCGTCTTCAGGAGCAACCTGC竹TTGACAAGAAGCAGTTTATCTCTCACATGAAGCAAGAAGAATGTTGAGTCCGCCACAAAGTATCTTCTTAGCAAGCTCAAGGACCTTCAGTTCTTTGTTGGCGAGAGCATGCATGATGATGGCGGCGTGGTGTTCGCCTACTACAAGGAGGGAGCTGCTGATCCAACTTTCCTGTACTTTGCACATGGGCTTTCTGCCCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO.l)其中上述序列的陰影部分為編碼序列，ATG示起始密碼子，TAA示終止密碼子。本發(fā)明的基因編碼區(qū)長507bp，編碼一個長168aa多肽鏈，多肽鏈氨基酸序列為MLVYODKLSGDELLSDSFPYRELENGVLWEVDGHWVVOGAVDVDIGANPSAEGGGDDEGVDDOAVKVVDIVDTFRLOEOPAFDKKOFISHMKRY腦LSAKLEGDDLDAFKKNVESATKYIXSKLKDLOFFVGESMHDDGGVVFAYYKEGAADPTFLYFAHGLKEVKC(SEQIDNO.2)TCTP2其中TCTP1、TCTP2為多肽鏈氨基酸序列的兩個結(jié)構(gòu)特征區(qū)。本發(fā)明所述的栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的TCTP基因cDNA序列，它是用同源克隆技術(shù)采用下述方法得到的以抗白粉病普通小麥Brock為材料，提取白粉菌脅迫5天的總體RNA，根據(jù)小麥NBS類抗病基因保守序列設(shè)計的簡并引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得比預(yù)期大、與TCTP基因cDNA有97^同源性的653bpcDNA片段，通過RACE技術(shù)，獲得全長為766bp的完整TCTP基因，與已發(fā)表的小麥TCTP基因有98%的同源性，該基因包括一個507bp的開放閱讀框，36bp的5'非翻譯區(qū)，223bp的3'非翻譯區(qū)；編碼一個168aa的多肽鏈，與已發(fā)表的小麥TCTP基因編碼的氨基酸序列有99%的同源性；ScanProsite分析表明，該多肽鏈具有TCTP1和TCTP2兩個特征結(jié)構(gòu)區(qū)和7個可能的功能位點，通過7個可能的功能位點以預(yù)測這些序列及其編碼的基因的生物功能。表達(dá)半定量PCR分析表明，Brock中的TCTP基因受白粉菌誘導(dǎo)，并隨染菌時間增長，表達(dá)量增加。具體的制備方法如下1、所用實驗材料為抗白粉病小麥品種Brock，小麥白粉菌15號小種；2、總體RNA的提取采用酸性異硫氰酸胍法，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和1%的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；3、以感染小麥白粉菌5天的葉片總體RNA為模板，以5，-CCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，為逆轉(zhuǎn)錄引物(SEQIDNO.3),在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Fl:5，-GGIGGIGTIGGNAAAACAAC-3，(SEQIDNO.4)和Rl:5'-GAGAGIGCIAGIGGNAGGCC-3，(SEQIDNO.5)簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一個長653bp的目標(biāo)片段，將目標(biāo)片段回收、純化、克隆、測序，其堿基序列為CGTGCTCTGGGAAGTCGATGGCCATTGGGTCGTTCAAGGAGCAGTTGATGTGGACATTGGAGCCAATCCCTCTGCTGAGGGTGGTGGTGATGATGAGGGTGTTGGTTGGCGAGAGCATGCATGATGATGGCGGCGTGGTGTTCGCCTACTACAAGGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO.6);4、BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該片段與已發(fā)表的小麥TCTP基因有98X的同源性;5、用RACE方法獲得該TCTP全長基因為766bp;6、用表達(dá)半定量PCR方法檢測白粉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該TCTP基因隨白粉菌15號生理小種誘導(dǎo)時間的加長而表達(dá)量增加。本發(fā)明栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的TCTP基因cDNA序列，與已發(fā)表的小麥TCTP基因序列相比的優(yōu)點和有益效果我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，Brock中存在一個強(qiáng)抗白粉病新基因(Wangetal.，PlantProductionScience,2004,7(3):319;Wangetal"PlantProductionScience,2005,8(5):578)，因此，我們試圖通過植物抗病基因保守序列NBS結(jié)構(gòu)特點設(shè)計簡并引物，來嘗試克隆Brock中的抗白粉病新基因，結(jié)果卻得到1條比預(yù)期分子量大的cDNA片段，克隆、測序并序列比對后發(fā)現(xiàn)其與小麥的TCTP基因有97X的同源性，是BrockTCTP基因的3'末端部分。TCTP基因最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織(GrossB，7V"c/e/c^"Vfa/^efl"A，1989，17:8367),編碼翻譯控制腫瘤蛋白，后來在其它組織中也相繼發(fā)現(xiàn)。TCTP是一類廣泛存在于動物、植物及酵母菌中的序列上高度保守、表達(dá)量很高的蛋白家族，它的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和翻譯2個水平調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，生長因子、環(huán)境污染、異常刺激均可影響其表達(dá)。最初認(rèn)為，TCTP是一類生長相關(guān)蛋白，近年來的研究則表明，TCTP功能涉及促進(jìn)組胺釋放(MacDonaldSM，Sc/ewce,1995，269:688)、細(xì)胞凋亡(SinhaP,Mo/ec"/flrflwrf加0cAem/cfl/i^raw'totog);，2000，121:107)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，黑暗可以誘導(dǎo)牽牛中TCTPmRNA積累(KimiyoSO，戶/fl"/CW/iVi"/o/，1998，39(3):357);草莓果實成熟過程中，營養(yǎng)器官內(nèi)TCTP含量增加(L叩ezAP，戶/flwtora附，2006，50(3):447);Al誘導(dǎo)可以使黃豆根內(nèi)TCTP基因表達(dá)的增強(qiáng)(VladimirE，Jo"/7ifl/o/五x/;eW附e"/fiWfl"j;，2003，54:2745)。上述研究表明，植物中，TCTP基因的表達(dá)明顯受外界環(huán)境條件的誘導(dǎo)。為了分析強(qiáng)抗白粉病小麥Brock中TCTP基因是否參與抗性反應(yīng)，我們在獲得了BrockTCTP3'末端后，利用RACE方法，克隆了159bp的5'末端，它的堿基序列為TT(SEOIDNO.7)，其中本序列的3'端與序列SEQIDNO.6的5'端有46bp重疊(劃線堿基部分)，因此可以將上述2個序列拼接成一個具有完整閱讀框的全長為766bp的BrockTCTP基因cDNA，該cDNA與已發(fā)表的小麥TCTP基因(gi/21070378)有98%同源性，編碼一個168aa的多肽鏈，該多肽鏈與發(fā)表的小麥TCTP蛋白的氨基酸序列(AF508970)具有99%的同源性；ScanProsite分析表明，該獲得的TCTP推測的氨基酸序列含有2個TCTP特征結(jié)構(gòu)域(TCTP，和TCTP2)以及7個可能的功能單位。表1BrockTCTP基因編碼的氨基酸序列功能單位的ScanProsite分析_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述結(jié)果表明我們獲得了抗白粉病小麥Brock中的TCTP基因。從我們利用表達(dá)半定量分析方法檢測該基因與白粉菌脅迫的應(yīng)答關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后，Brock中的TCTP的mRNA明顯積累，并隨著誘導(dǎo)時間的延長而積累增加，說明植物中的TCTP基因功能涉及對白粉菌抗性反應(yīng)。這是迄今為止在小麥白粉菌誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)的又一個新的應(yīng)答基因。該發(fā)明為小麥抗白粉病分子機(jī)理研究提供了可靠的依據(jù)，同時拓展了TCTP基因在植物中的新功能。圖l:小麥總RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2:小麥總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3:BrockTCTP3，末端擴(kuò)增結(jié)果；M為DL2000Marker,1為RT-PCR產(chǎn)物；圖4:BrockTCTP基因5'末端片段擴(kuò)增結(jié)果，M為DL2000Marker,1為PCR產(chǎn)物；圖5:BrockTCTP基因全序列結(jié)果，陰影部分為編碼序列；圖6:BrockTCTP基因編碼的多肽鏈；圖7:BrockTCTP基因表達(dá)半定量分析，染菌處理的不同時期圖。具體實施例方式(結(jié)合附圖具體說明)為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供下述栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的TCTP基因cDNA序列的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1、總體RNA的提取普通小麥Brock在溫室生長至3葉期時接菌處理。接菌處理5天后剪取葉片提取RNA，具體為(1)稱取0.1g小麥葉片，剪碎入預(yù)冷過的研缽；(2)加液氮研磨至粉末狀，加入lml的SolutionD和7.2fU巰基乙醇，與粉末研至澄清；(3)(以下各步在冰上操作)倒入5ml離心管中，加入10(^12M的NaAC(PH4.0)顛倒數(shù)次混勻置冰上；(4)加入等體積的水飽和酚，斡旋器上震蕩混勻；(5)加入20(Hil氯仿-異戊醇(49:1),用力震蕩混勻；(6)冰浴30mhi，期間顛倒數(shù)次，以不出現(xiàn)分層為宜；(7)10000rpm4。C離心20min;(8)取上清，加入等體積的酚仿，再抽提一次，10000rpm4'C離心20min;(9)取上清，加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀lh以上；(10)10000rpm4。C離心25min，棄上清；(11)75%乙醇洗2次，除去鹽類和其他雜質(zhì)，離心棄上清，每次10000rpm4'C離心5min;(12)自然干燥10min，視RNA量的多寡加入40~100fil的DEPC處理過的滅菌ddH20。-70°(:保存?zhèn)溆茫?13)用紫外分光光度法檢測RNA樣品的濃度及純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳和1%的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，圖1為小麥總RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為小麥總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳圖。實施例2、反轉(zhuǎn)錄主要參閱AMV系統(tǒng)(寶生物工程有限公司)使用說明書。反應(yīng)體系RNATemplateljig,5xReverseTranscriptionBuffer4pl，dNTPMixture(10mM)2pl,RNaseInhibitor(40U/fil)20U，01igo(dT)18Primer(50fiM)50pmol，AMVReverseTranscriptase(5U/fil)10U，DEPCwater(nuclease-free)補(bǔ)齊到2(Ui1。輕輕攪拌，混勻離心，室溫放置lOmin,42'C保溫lh，在冰水中冷卻2min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后，放入-70'C冰箱凍存?zhèn)溆谩嵤├?、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10xBuffer2.5fil;MgC12(25mM)l單dNTP(10mM)0.5^1，F(xiàn)orwardl(10fiM)2fi1，F(xiàn)orward2(lOfiM)2ftl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2fU，Taq(51]*1)0.5fU，ddH20補(bǔ)齊25jd。PCR參數(shù):94°C預(yù)變性2min，94。C變性lmin，5(TC退火30s，72'C延伸30s,40cycles;72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段的大小，是否清晰明亮，回收純化PCR產(chǎn)物用于克隆測序(圖3)。實施例4、PCR產(chǎn)物克隆采用小量DNA片段快速回收試劑盒(Q柱)進(jìn)行純化后，將目的片段連接到pGEM-TeasyVector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。藍(lán)白斑方法篩選陽性克隆子，PCR法和酶切鑒定方法鑒定后，陽性克隆子送上海生工生物工程公司測序。實施例5、小麥BrockTCTP基因5'末端的快速擴(kuò)增根據(jù)GenBank上查詢到已發(fā)表的一個小麥的TCTP基因序列(gi|21070378)和本克隆的TCTP測序結(jié)果，利用專業(yè)引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計上下游引物5RACEF:5，隱TCCTTTTTCGGGGGAGAAATC-3，(SEQIDNO.8);5RACER:5，-AACTGCTCCTTGAACGACCCA-3，(SEQIDNO.9)。用實施例2獲得的cDNA進(jìn)行PCR，獲得目標(biāo)帶(圖4)，將目的片段進(jìn)行純化、克隆、測序和BLAST比對。實施例6、普通小麥BrockTCTP基因全長cDNA序列獲得及結(jié)構(gòu)分析用DNAClub軟件對獲得的BrockTCTP3'和5，端進(jìn)行拼接，獲得本發(fā)明所克隆的TCTP基因全長，共766bp(圖5，SEQIDNO.l)。該cDNA與己發(fā)表的小麥TCTP基因(gi/21070378)有98%同源性，編碼一個168aa的多肽鏈，該多肽鏈與發(fā)表的小麥TCTP蛋白的氨基酸序列(AF508970)具有99%的同源性；ScanProsite分析表明，該獲得的TCTP推測的氨基酸序列含有2個TCTP特征結(jié)構(gòu)域(TCTP1和TCTP2)以及7個可能的功能單位(圖6，表l)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例7、小麥BrockTCTP基因表達(dá)半定量鑒定主要參閱Maria等(MariaM,2001,3(1):19)的方法。小麥Brock在溫室生長至3葉期時進(jìn)行白粉菌染菌處理接種白粉菌0h、6h、12h和24h，取材后液氮速凍，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物采用5'-CCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，(SEQIDNO.3)半定量PCR引物為SEMIF:S，-CGCTACATCAAGAACCTC-3，(SEQIDNO.10)SEMIR:5，-CCACGCGTCGACTAGTAC-3'(SE(JIDNO.ll)PCR參數(shù)94°C預(yù)變性2min;94°C變性lmin，60°C退火45s，72°C延伸lmin,28cycles;72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7，染菌處理6h的TCTP基因表達(dá)量較對照組中的有所增加，在處理至12h時有顯著增加，在24h表達(dá)量已經(jīng)趨于穩(wěn)定。說明TCTP基因的表達(dá)量隨染菌時間的增長而增加，并最終達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。SEQUENCELISTING<110>天津師范大學(xué)<120>栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列及其獲得方法<160>11<210>1<211>766bp<212>DNA<213>基因序列<220><221>gene<222>(1),.(766)<400>1tcctttttcgggggagaaatctcaagaggcggcaccatgctcgtgtaccaggacaagctt60tccggcgacgagcttctgtcggattcgttcccttacagggagctggagaacggcgtgctc120tgggaagtcgatggccattgggtcgttcaaggagcagttgatgtggacattggagccaat180ccctctgctgagggtggtggtgatgatgagggtgttgatgaccaggccgtgaaggtggtt240gacattgttgacaccttccgtcttcaggagcaacctgcttttgacaagaagcagtttatc300tctcacatgaagcgctacatcaagaacctctctgccaagcttgaaggggatgacctagat360gctttcaagaagaatgttgagtccgccacaaagtatcttcttagcaagctcaaggacctt420cagttctttgttggcgagagcatgcatgatgatggcggcgtggtgttcgcctactacaag480gagggagctgctgatccaactttcctgtactttgcacatgggctgaaagaggtcaagtgc540taatcgcactgtatgctaaaatctatgctgtcttcagtatttttgctcttatctatggtt600gtcagtcgactctccaatgttggtgtcagtaactgtcagatgttgagtgtcttgaaaact660ttctgataattgtgggatttgctttgtaatggtaatcgtgaaattggtgtggttgtgttt720tggttg加tc加g:ig8ttctgccctgttaaa肌肌itaa3aaaaaaa766<210>2<211>168bp<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(l)..(闊<400>2MetLeuValTyrGinAspLysLeuSerGlyAspGluLeuLeuSerAsp151015SerPheProTyrArgGluLeuGluAsnGlyValLeuTrpGluValAsp202530GlyHisTrpValValGinGlyAlaValAspValAsplieGlyAlaAsn354045ProSerAlaGluGlyGlyGlyAspAspGluGlyValAspAspGinAla505560ValLysValValAsplieValAspThrPheArgLeuGinGluGinPro65707580AlaPheAspLysLysGinPhelieSerHisMetLysArgTyrlieLys859095AsnLeuSerAlaLysLeuGluGlyAspAspLeuAspAlaPheLysLys100105110AsnValGluSerAlaThrLysTyrLeuLeuSerLysLeuLysAspLeu115120125GinPhePheValGlyGluSerMetHisAspAspGlyGlyValValPhe130135140AlaTyrTyrLysGluGlyAlaAlaAspProThrPheLeuTyrPheAla145150155160HisGlyLeuLysGluValLysCys165168<210>3<211>35bp<212>DNA<213>人工序列<400>3ccacgcgtcgactagtacttttttttttttttttt35<210>4<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<400>4ggiggigtiggnaaaacaac20<210>5<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<400>5gagagigciagiggnaggcc20<210>6<211>653bp<212>DNA<213>基因序列<400>6cgtgctctgggaagtcgatggccattgggtcgttcaaggagcagttgatgtggacattgg60agccaatccctctgctgagggtggtggtgatgatgagggtgttgatgaccaggccgtgaa120ggtggttgacattgttgacaccttccgtcttcaggagcaacctgcttttgacaagaagca180gtttatctctcacatgaagcgctacatcaagaacctctctgccaagcttgaaggggatga240cctagatgctttcaagaagaatgttgagtccgccacaaagtatcttcttagcaagctcaa300ggaccttcagttctttgttggcgagagcatgcatgatgatggcggcgtggtgttcgccta360ctacaaggagggagctgctgatccaactttcctgtactttgcacatgggctgaaagaggt420caagtgctaatcgcactgtatgctaaaatctatgctgtcttcagtatttttgctcttatc480tatggttgtcagtcgactctccaatgttggtgtcagtaactgtcagatgttgagtgtctt540gaaaactttctgataattgtgggatttgctttgtaatggtaatcgtgaaattggtgtggt600tgtgttttggttgaatcaagagattctgccctgttaaaaaaaaaaaaaaaaaa653<210>7<211>159bp<212>DNA<213>基因序列<400>7tcctttttcgggggagaaatctcaagaggcggcaccatgctcgtgtaccaggacsagctt60tccggcgacgagcttctgtcggattcgttcccttacagggagctggagaacggcgtgctc120tgggaagtcgatggccattgggtcgttcaaggagcagtt159<210>8<211>21bp<212>DNA<213>人工序列<400>8tcctttttcgggggagaaatc21<210>9<211>21bp<212>DNA<213>人工序列<400>9aactgctccttgaacgaccca21<210>10<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>10cgctacatcaagaacctc18<210>11<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>11ccacgcgtcgactagtac18權(quán)利要求1、栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列，其特征在于它與小麥TCTP基因有98％的同源性，cDNA全長766bp；有一個長36bp的5’UTR和長223bp的3’UTR以及長507bp的開放閱讀框；編碼一個168aa的多肽鏈，cDNA序列為TCCTTTTTCGGGGGAGAAATCTCAAGAGGCGGCACCTCGCACTGTATGCTAAAATCTATGCTGTCTTCAGTATTTTTGCTCTTATCTATGGTTGTCAGTCGACTCTCCAATGTTGGTGTCAGTAACTGTCAGATGTTGAGTGTCTTGAAAACTTTCTGATAATTGTGGGATTTGCTTTGTAATGGTAATCGTGAAATTGGTGTGGTTGTGTTTTGGTTGAATCAAGAGATTCTGCCCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA其中上述序列的陰影部分為編碼序列，ATG示起始密碼子，TAA示終止密碼子。2、如權(quán)利要求1所述的栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列，其特征在于，該基因的編碼區(qū)長507bp，編碼168aa多肽鏈的氨基酸序列為MLVY⑨KLSGDELLSDSFPYRELENGVLWEVDGHWVVOGAVDVDIGANPSAEG^DDEGVDDQAVKVVDIVDTFRLQEQPAFDKKQFIS頭KRYIKNLSAKLEGDDLDAFKKNVESATKYLLSKLKDLOFFVGESMHDDGGVVFAYYKEGAADPTFLYFAHGLKEVKC窗2其中TCTP1、TCTP2為多肽鏈氨基酸序列的兩個結(jié)構(gòu)特征區(qū)。3、如權(quán)利要求1或2所述的栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因cDNA序列，其特征在于，它是用同源克隆技術(shù)采用下述方法得到的以抗白粉病普通小麥Brock為材料，提取白粉菌脅迫5天的總體RNA,根據(jù)小麥NBS類抗病基因保守序列設(shè)計的簡并引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得比預(yù)期大、與TCTP基因cDNA有97^同源性的653bpcDNA片段，通過RACE技術(shù)，獲得全長為766bp的完整TCTP基因，與己發(fā)表的小麥TCTP基因有98%的同源性，該基因包括一個507bp的開放閱讀框，36bp的5'非翻譯區(qū)，223bp的3'非翻譯區(qū)編碼一個168aa的多肽鏈，與已發(fā)表的小麥TCTP基因編碼的氨基酸序列有99^的同源性；ScanProsite分析表明，該多肽鏈具有TCTP1和TCTP2兩個特征結(jié)構(gòu)區(qū)和7個可能的功能位點；表達(dá)半定量PCR分析表明，Brock中的TCTP基因受白粉菌誘導(dǎo)，并隨染菌時間增長，表達(dá)量增加。全文摘要本發(fā)明公開了栽培小麥Brock中一個受白粉菌誘導(dǎo)應(yīng)答的基因序列和推測的氨基酸序列。它與小麥TCTP基因有98％的同源性，cDNA全長766bp；有一個長36bp的5’UTR和長223bp的3’UTR以及長507bp的開放閱讀框；編碼一個168aa的多肽鏈，與已發(fā)表的小麥TCTP基因編碼的氨基酸序列有99％的同源性。ScanProsite分析表明，該多肽鏈具有2個特征結(jié)構(gòu)區(qū)(TCTP1和TCTP2)和7個可能的功能位點。表達(dá)半定量PCR分析表明，Brock中的TCTP基因受白粉菌誘導(dǎo)，并隨染菌時間增長，表達(dá)量增加。這是迄今為止在小麥白粉菌誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)的又一個新的應(yīng)答基因。該發(fā)明為小麥抗白粉病分子機(jī)理研究提供了可靠的依據(jù)，同時拓展了TCTP基因在植物中的新功能。文檔編號C07K14/415GK101126091SQ200710058140公開日2008年2月20日申請日期2007年7月16日優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日發(fā)明者彭永康,剛李,王振英申請人:天津師范大學(xué)