專利名稱：雙功能融合蛋白CBD－ProA載體及其制備的免疫磁性微球和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素結(jié)合域—金黃色葡萄球菌蛋白A(CBD-ProA)融合蛋白的克隆表達(dá)；利用CBD-ProA融合蛋白特異性的偶聯(lián)抗體，制備纖維素免疫磁性微球；以及利用該技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的分離純化和靶細(xì)胞的捕獲及鑒定，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磁性微球(Magnetic Microspheres，MMS)，或叫磁性微珠(Magnetic Beads，MB)作為一種新型多功能試劑，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)并廣泛應(yīng)用于磁性材料、生物工程以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。磁性微球是指利用含有磁性金屬或金屬氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)超細(xì)粉末制備的具有磁響應(yīng)性的高分子微球。由于其具有超順磁性，給目標(biāo)生物產(chǎn)品的分離帶來(lái)了革命性的發(fā)展；而且由于其在磁性環(huán)境可以快速富集，因此為實(shí)現(xiàn)免疫學(xué)分析、分離，以及靶向給藥提供了可能。纖維素磁性微球以其成本低廉，材質(zhì)優(yōu)良以及生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用于蛋白純化、臨床檢驗(yàn)和酶固定化等方面。
抗體的固定化是實(shí)現(xiàn)磁性微球生物學(xué)特性的重要手段。早期用于固定化的方法主要采用物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)的方法。前者結(jié)合效率低、非特異性強(qiáng)，且存在抗體泄漏等問(wèn)題?；瘜W(xué)偶聯(lián)法克服了前者的諸多缺點(diǎn)，但化學(xué)試劑的引入增加了工藝的危險(xiǎn)性，給操作人員的身體健康帶來(lái)隱患，同時(shí)抗體的偶聯(lián)借助于化學(xué)官能團(tuán)存在的隨機(jī)性，從而引入一定的空間位阻，降低了其結(jié)合抗原的活性，這無(wú)疑影響了磁性微球在蛋白純化以及檢驗(yàn)檢疫等方面的應(yīng)用。因此需要研究一種操作簡(jiǎn)單、安全可靠、高效穩(wěn)定的配體偶聯(lián)方法，拓展磁性微球在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展空間。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為纖維素磁性微球的抗體固定化開(kāi)辟一條簡(jiǎn)易、安全、可靠的途徑，涉及纖維素結(jié)合域—蛋白A(CBD-ProA)雙功能融合蛋白的克隆和表達(dá)；纖維素磁性微球的生物特異性抗體偶聯(lián)；以及上述免疫磁性微球在蛋白分離純化、微生物的捕獲以及鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明首先提供了一種具有IgG抗體結(jié)合活性和纖維素結(jié)合活性的雙功能融合蛋白CBD-ProA，其堿基序列如序列表1所示。
本發(fā)明同時(shí)提供了一種含有上述序列的表達(dá)載體，也就是可以在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)源于嗜纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)纖維素結(jié)合域的pET系列載體。
本發(fā)明同時(shí)還提供了一種重組菌株，即用上述的表達(dá)載體pCBD-ProA轉(zhuǎn)化的E.ColiBL21菌株。
本發(fā)明采用基因工程技術(shù)將金黃色葡萄球菌(Cowan I 6538)蛋白A(簡(jiǎn)稱ProA)具有和IgG的Fc段結(jié)合活性的基因片段，定向克隆至含有纖維素結(jié)合域(簡(jiǎn)稱CBD)的pET系列載體，構(gòu)建了同時(shí)具有IgG抗體結(jié)合活性和纖維素結(jié)合活性的雙功能融合蛋白CBD-ProA的載體，并轉(zhuǎn)入E.Coli BL21感受態(tài)菌株，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高含量的CBD-ProA融合表達(dá)蛋白。并利用CBD-ProA作為生物橋聯(lián)劑，將IgG抗體固定于纖維素磁性微球表面。以生物特異性偶聯(lián)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理吸附法和化學(xué)鍵合法，得到可用于蛋白分離和病原微生物捕獲鑒定的免疫磁性微球。
本發(fā)明所使用的載體為在大腸桿菌中表達(dá)的帶有CBD標(biāo)簽的pET系列載體(pET34b(+)，pET35b(+))，所偶聯(lián)的IgG抗體可以為來(lái)源于腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液的單克隆抗體，也可以為來(lái)源于抗血清中的多克隆抗體。
本發(fā)明所提供的纖維素免疫磁性微球的具體制備方法是是將纖維素磁性微球直接與權(quán)利要求3所述的重組菌株pCBD-ProA/E.Coli BL21的發(fā)酵菌體裂解液或其離心后的上清液混合，室溫下振蕩反應(yīng)1至2小時(shí)，或4℃過(guò)夜，將融合蛋白CBD-ProA結(jié)合在纖維素磁性微球的表面；將用于特異性捕獲和分離抗原的IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，直接進(jìn)行振蕩或靜置吸附連接，抗體的濃度在0.1至20mg/mL范圍內(nèi)，溫度保持在4至37℃之間，連接時(shí)間控制在0.5至24小時(shí)之內(nèi)，即可制得可供一次性使用的抗體致敏的纖維素免疫磁性微球。
若需要反復(fù)使用免疫磁性微球，則可以采用化學(xué)交聯(lián)的方法將CBD-ProA和IgG固定于纖維素磁性微球表面。交聯(lián)劑可以使用1至100mM二甲基庚二酸酯(DMP)或0.05至1.0％戊二醛(GA)，反應(yīng)時(shí)間控制在0.2至5小時(shí)之內(nèi)。經(jīng)過(guò)量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗凈后即得到抗體交聯(lián)的纖維素免疫磁性微球。
本發(fā)明提供的纖維素免疫磁性微球可用于，混合樣品中目的蛋白的免疫磁性分離，或污染、或病原樣品中微生物的捕獲與鑒定以及細(xì)胞的分離。
目的蛋白的分離純化將偶聯(lián)有抗目的蛋白抗體的纖維素免疫磁性微球，直接置于含有目的蛋白并適當(dāng)稀釋后的緩沖液中，振蕩反應(yīng)后；磁性吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，采用甘氨酸鹽酸緩沖液(pH 1.5至3.5)解離吸附的目的蛋白；再次用磁力固定微球，收集解離液，并立即采用1M高濃度的磷酸鹽緩沖液(pH 6.5至10.0)進(jìn)行中和，得到純化的目的蛋白。該免疫磁性微球經(jīng)PBS洗凈后，可重復(fù)使用。與常規(guī)的分離純化方法相比較，采用該方法可大大的簡(jiǎn)化純化步驟，一步純化目的蛋白的純度可以達(dá)到95％以上。
微生物的捕獲與鑒定將偶聯(lián)有抗目的微生物抗體的免疫磁性微球，直接置于適當(dāng)稀釋后的含有待測(cè)微生物的樣品混懸液中，例如污染的食物、水樣品或者患者排泄物等。室溫振蕩反應(yīng)后，磁性分離上述微球，充分淋洗后即可得到捕獲有微生物細(xì)胞的免疫磁性微球。結(jié)合有微生物細(xì)胞的微球可作為富集的樣品，直接用于進(jìn)一步的微生物的常規(guī)鑒定或分子鑒定。與未經(jīng)微球捕獲富集的直接鑒定方法相比較，采用該方法可以提高靈敏度10-100倍。
其中，本專利中采用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA夾心法確定IgG抗體的偶聯(lián)量，具體方法是測(cè)定偶聯(lián)前后溶液中抗體含量的變化，即為被磁性微球吸附的抗體量。采用10μg/mL羊抗鼠/或兔IgG抗體100μL包被酶標(biāo)板，加入系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)濃度的鼠/或兔IgG抗體(或樣品溶液)100μL，室溫放置2小時(shí)，充分清洗后加入2000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠/或兔IgG抗體100μL，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，充分清洗，加入鄰苯二胺(OPD)底物溶液，反應(yīng)5至10分鐘后，終止反應(yīng)，并于492nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)抗體濃度計(jì)算溶液中抗體含量，并折算抗體的偶聯(lián)量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明利用CBD-ProA生物橋聯(lián)劑將IgG抗體特異性固定于纖維素磁性微球載體上，操作簡(jiǎn)單，方便快速，短時(shí)間內(nèi)即可得到抗體致敏的免疫磁性微球，大大簡(jiǎn)化了固定化步驟。同時(shí)，該方法避免了有害化學(xué)試劑的引入，降低工藝操作的危險(xiǎn)性，同時(shí)保證了偶聯(lián)抗體的生物學(xué)活性，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了效率。通過(guò)生物特異性偶聯(lián)方法制備的免疫磁性微球可以應(yīng)用于目的蛋白的分離純化，靶細(xì)胞的捕獲和相應(yīng)的病原微生物的檢驗(yàn)檢疫中。本發(fā)明可望替代傳統(tǒng)的抗體固定化方法，成為一種簡(jiǎn)便、安全、高效的纖維素微球配體偶聯(lián)新技術(shù)。

圖1是纖維素磁性微球的環(huán)境掃描電鏡照片(×1500)。
圖2是CBD-ProA的SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析，其中A圖為SDS-PAGE電泳分析，B圖為免疫印跡分析；各泳道條件分別為M標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1E.Coli BL21菌體蛋白；2E.Coli BL21表達(dá)CBD蛋白裂解液；3和5E.Coli BL21表達(dá)CBD-ProA蛋白裂解液；4和6纖維素磁性微球吸附后的CBD-ProA蛋白裂解液。
圖3是IFNα-2b純化產(chǎn)物的高效液相色譜(A)，SDS-PAGE電泳(B)和免疫印跡(C)分析。
圖4是免疫磁性微球捕獲大腸桿菌的電鏡照片(×1500，×10,000)。
圖5是免疫磁性微球捕獲PCR分析技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌，圖中各泳道條件M核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker；+陽(yáng)性對(duì)照；-陰性對(duì)照；條帶1-5常規(guī)PCR分析；條帶6-10免疫磁性捕獲PCR分析。志賀氏菌濃度，條帶1，620,000CFU/mL；條帶2，72,000CFU/mL；條帶3，8200CFU/mL；條帶4，920CFU/mL；條帶5，102CFU/mL。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、CBD-ProA雙功能融合蛋白的制備1.金黃色葡萄球菌基因組的提取選取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株Cowan I 6538按常規(guī)過(guò)夜培養(yǎng)，離心后TBS緩沖液重懸，采用蛋白酶K和SDS Tris緩沖液充分裂解菌體，經(jīng)飽和酚抽提水相蛋白，以預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀基因組DNA，并將其最后溶于滅菌的雙蒸水中。
2.蛋白A(ProA)的基因PCR擴(kuò)增根據(jù)ProA的基因序列，設(shè)計(jì)含有NcoI和EcoRI酶切位點(diǎn)的上游和下游引物。
P1GCGCCATGGCGCAACACGATGAAGCTCAA；P2CGCGAATTCGGTTTTGGTGCTTGAGCATCG；以提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增ProA基因。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘；94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘，對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列分析，其結(jié)果與GenBank登陸的Cowan I 6538序列(E01690)相一致。
3.基于大腸桿菌BL21菌株的CBD-ProA融合表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建分別采用限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI雙酶切ProA的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，及帶有CBD標(biāo)簽的pET35b(+)載體。采用DNA回收試劑盒回收目的片段，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入E.coliBL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，獲得含有CBD-ProA融合基因的重組質(zhì)粒pCBD-ProA的E.coli BL21原核表達(dá)系統(tǒng)。
4.CBD-ProA融合蛋白的表達(dá)和鑒定將重組菌株接種于5mL含有卡那霉素50μg/mL的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6時(shí)，采用終濃度為1mmol/L的IPTG于30℃誘導(dǎo)24小時(shí)。離心收集的菌體，采用PBS緩沖液重懸，超聲波破碎處理5分鐘，使菌體充分裂解，裂解產(chǎn)物分別進(jìn)行CBD和ProA活性的鑒定。
5.CBD-ProA融合蛋白的鑒定
將采用中國(guó)專利ZL03144274.9號(hào)所述方法制備的纖維素磁性微球(參見(jiàn)圖1)與上述菌體裂解產(chǎn)物作用，將作用前后的溶液進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析。并進(jìn)一步用半干式轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western-blot鑒定，采用2000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔IgG作為示蹤抗體，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為顯色底物。結(jié)果如圖2所示，SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析顯示構(gòu)建的重組菌株pCBD-ProA/E.ColiBL21表達(dá)一個(gè)57kDa的目的蛋白，并具有ProA的抗體結(jié)合活性(條帶3，條帶5)；在與纖維素磁性微球作用后，其目的蛋白的條帶明顯減弱(條帶4，條帶6)，表明其具有良好的纖維素結(jié)合活性。
實(shí)施例2、免疫磁性微球的制備1纖維素免疫磁性微球的制備是按照中國(guó)專利ZL03144274.9的方法所制備的纖維素磁性微球，取1mL纖維素磁性微球，室溫下直接與50mL重組pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的發(fā)酵菌體裂解液振蕩反應(yīng)2小時(shí)(同實(shí)施例1)，用PBS緩沖液反復(fù)淋洗8次。再取1mL抗血清，以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)10倍稀釋。將上述結(jié)合有CBD-ProA的纖維素磁性微球，室溫下置于上述10mL的稀釋液中，振蕩吸附2小時(shí)。經(jīng)PBS淋洗8次后，即得到可供一次性使用的抗體致敏的纖維素免疫磁性微球。
實(shí)施例3、免疫磁性微球的制備2實(shí)施例2中混合振蕩反應(yīng)1小時(shí)，吸附連接2小時(shí)。其余條件同例2。
為了使免疫磁性微球能反復(fù)利用，加入同微球等體積的10mM二甲基庚二酸酯(DMP)交聯(lián)劑，室溫反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)，采用化學(xué)交聯(lián)的方法將CBD-ProA和IgG固定于纖維素磁性微球表面。再經(jīng)等體積的1M甘氨酸(Gly)中和，用PBS緩沖液充分洗凈后即得到抗體交聯(lián)的纖維素免疫磁性微球。
實(shí)施例4、免疫磁性微球的制備3實(shí)施例3中的交聯(lián)劑可以使用0.1％戊二醛(GA)，反應(yīng)時(shí)間0.5小時(shí)。再經(jīng)過(guò)量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗凈后也可以得到抗體交聯(lián)的纖維素免疫磁性微球。
實(shí)施例5、免疫磁性微球的制備4實(shí)施例3中的交聯(lián)劑可以使用25mM二甲基庚二酸酯(DMP)，反應(yīng)0.5小時(shí)。再經(jīng)過(guò)量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗凈后即得到抗體交聯(lián)的纖維素免疫磁性微球。
實(shí)施例6、利用纖維素免疫磁性微球分離純化干擾素α-2b干擾素α-2b(IFN α-2b)分離純化用的纖維素免疫磁性微球，是按照中國(guó)專利ZL03144274.9的制備方法進(jìn)行。取1mL纖維素磁性微球，室溫下直接與50mL重組pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的發(fā)酵菌體裂解液振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用PBS緩沖液反復(fù)淋洗8次。再取5mL鼠抗IFN α-2b單抗腹水，以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)10倍稀釋。將上述結(jié)合有CBD-ProA的纖維素磁性微球，室溫下置于50mL上述的稀釋液中，振蕩吸附2小時(shí)。經(jīng)PBS充分洗凈后，將微球重懸于10mL NaHCO3-NaCO3緩沖液中(pH8.5)，加入50mM的二甲基庚二酸酯(DMP)1mL，室溫反應(yīng)2小時(shí)，將CBD-ProA和捕獲的IgG抗體交聯(lián)固定于纖維素磁性微球的表面。最后加入1M甘氨酸(Gly)0.5mL終止反應(yīng)，并充分洗凈后即得到可用于干擾素分離純化用的免疫磁性微球。采用ELISA夾心法確定其抗體偶聯(lián)量為10.2mg/mL。
取1mL免疫磁性微球，置于磁性分離裝置(選自中國(guó)專利ZL03144274.9)的玻璃容器中；取IFN α-2b發(fā)酵菌體裂解液5mL，12000rpm離心20分鐘，取2.5mL上清液于50mLPBS緩沖液中(稀釋20倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃振蕩反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)后采用磁性裝置分離固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，然后用PBS清洗4次。再加入2mL 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，解離被免疫磁性微球吸附的IFN α-2b。收集解離液，立即采用少量1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中和，得純化IFN α-2b。免疫磁性微球經(jīng)PBS清洗后，于4℃保存，備再次使用。經(jīng)高效液相色譜(HPSEC)(圖3A)，SDS-PAGE(圖3B)和Western-blot(圖3C)分析，純度為95.5％，并顯示了良好的重現(xiàn)性。
實(shí)施例7、污水中大腸桿菌的免疫磁性捕獲與鑒定大腸桿菌捕獲用的免疫磁性微球的制備方法是按照中國(guó)專利ZL03144274.9的制備方法進(jìn)行。取1mL纖維素磁性微球，室溫下直接與50ml重組pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的發(fā)酵菌體裂解液振蕩反應(yīng)2小時(shí)(同實(shí)施例1)，用PBS緩沖液反復(fù)淋洗。再將結(jié)合有CBD-ProA的纖維素磁性微球室溫下，置于10mL以20mM NaHCO3-NaCO3緩沖液(pH8.5)10倍稀釋后的兔抗大腸桿菌多抗血清中，振蕩吸附2小時(shí)。經(jīng)PBS充分洗凈后，即得到用于大腸桿菌捕獲用免疫磁性微球。采用ELISA夾心法確定其抗體偶聯(lián)量為5.6mg/mL。
取上述制備的免疫磁性微球100μL，直接加入到50mL污水樣品中，室溫?cái)嚢?0分鐘。將其置于磁珠收集器上(中國(guó)專利ZL03144274.9)收集磁性微球，并直接接種于LST肉湯管中。將接種的LST管放置35℃培養(yǎng)，檢查和記錄在24±2h時(shí)倒管內(nèi)產(chǎn)氣的試管，未產(chǎn)氣的試管繼續(xù)培養(yǎng)24h，在48±2h時(shí)檢查和記錄產(chǎn)氣情況，對(duì)所有產(chǎn)氣的試管進(jìn)行確證試驗(yàn)。與直接取1mL污水樣品接種LST管的傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，免疫磁性捕獲鑒定方法可以直接從污水中直接富集目的大腸桿菌(圖4)，再通過(guò)進(jìn)一步的常規(guī)方法鑒定，且其靈敏度可以提高10倍以上。
實(shí)施例8志賀氏菌的免疫磁性捕獲PCR鑒定志賀氏菌捕獲用免疫磁性微球是按照中國(guó)專利ZL03144274.9的制備方法進(jìn)行。取1mL纖維素磁性微球，室溫下直接與50ml重組pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的發(fā)酵菌體裂解液振蕩反應(yīng)2小時(shí)(同實(shí)施例1)，用PBS緩沖液反復(fù)淋洗。再將結(jié)合有CBD-ProA的纖維素磁性微球室溫下，置于10mL以0.02M NaHCO3-NaCO3緩沖液(pH8.5)10倍稀釋的兔抗志賀氏菌多抗血清中，振蕩吸附2小時(shí)。經(jīng)PBS充分洗凈后，重懸于10mLNaHCO3-NaCO3緩沖液中(pH8.5)，加入0.5％的戊二醛(GA)1mL，室溫反應(yīng)30分鐘，經(jīng)PBS充分洗凈后，加入1M甘氨酸溶液0.5mL終止反應(yīng)，將CBD-ProA和捕獲的IgG抗體固定于纖維素磁性微球的表面，即得到用于志賀氏菌特異性捕獲的免疫磁性微球。采用ELISA夾心法確定其抗體偶聯(lián)量為6.2mg/mL。
取細(xì)菌性痢疾患者的糞便排泄物，加入LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出粉，10％NaCl，pH 7.4)中37℃培養(yǎng)16小時(shí)。取20μL免疫磁性微球加入培養(yǎng)基中，室溫振蕩反應(yīng)15～30分鐘，采用磁性分離裝置(中國(guó)專利ZL03144274.9)收集磁性微球，并用PBS反復(fù)淋洗6次。加入100μL無(wú)菌水，于100℃熱處理15分鐘，離心去沉淀，以上清液為模板，直接采用種屬特異性引物S1(CTGGATGGTATGGTGAGG)和S2(GGAGGCCAACAATTATTCC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其反應(yīng)條件為94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1％瓊脂糖電泳分析，根據(jù)凝膠上相應(yīng)分子量處出現(xiàn)擴(kuò)增帶與陽(yáng)性模板對(duì)照判定結(jié)果。(圖5)采用生物特異性偶聯(lián)方法制備的免疫磁性微球借助抗體的高活性結(jié)合，其最低檢測(cè)限可以達(dá)到20CFU/mL。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，免疫磁性捕獲-PCR技術(shù)可以直接從糞便排泄物和嘔吐物中直接富集目的致病菌，通過(guò)熱裂解進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且其靈敏度可以提高100倍。
序列表1<110>南開(kāi)大學(xué)<120>雙功能融合蛋白CBD-ProA載體及其制備的免疫磁性微球和應(yīng)用<160>1<210>1<211>1566<212>DNA<213>嗜纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>misc_feature<222>(1，469，625，1498)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>CDS<222>(279)...(389)<400>1atgtcagttg aattttacaa ctctaacaaa tcagcacaaa caaactcaat tacaccaata 60atcaaaatta ctaacacatc tgacagtgat ttaaatttaa atgacgtaaa agttagatat 120tattacacaa gtgatggtac acaaggacaa actttctggt gtgaccatgc tggtgcatta 180ttaggaaata gctatgttga taacactagc aaagtgacag caaacttcgt taaagaaaca 240gcaagcccaa catcaaccta tgatacatat gttgaatttg gatttgcaag cggagcagct 300actcttaaaa aaggacaatt tataactatt caaggaagaa taacaaaatc agactggtca 360aactacactc aaacaaatga ctattcattt gatgcaagta gttcaacacc agttgtaaat 420ccaaaagtta caggatatat aggtggagct aaagttcttg gtacagcacc aggttccgcg 480ggtctggtgc cacgcggtag tactgcaatt ggtatgaaag aaaccgctgc tgctaaattc 540gaacgccagc acatggacag cccagatctg ggtaccggtg gtggctccgg tattgagggt 600cgctctaact ctcctctggc catggcgcaa cacgatgaag ctcaacaaaa tgctttttat 660caagtgttaa atatgcctaa cttaaacgct gatcaacgta atggttttat ccaaagcctt 720aaagatgatc caagccaaag tgctaacgtt ttaggtgaag ctcaaaaact taatgactct 780caagctccaa aagctgatgc gcaacaaaat aagttcaaca aagatcaaca aagcgccttc 840tatgaaatct tgaacatgcc taacttaaac gaagagcaac gcaatggttt cattcaaagt 900cttaaagacg atccaagcca aagcactaac gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa 960tctcaagcac cgaaagctga caacaatttc aacaaacaac aacaaaatgc tttctatgaa 1020atcttgaaca tgcctaactt gaacgaagaa caacgcaatg gtttcatcca aagcttaaaa 1080gatgacccaa gtcaaagtgc taacctttta gcagaagcta aaaagttaaa tgaatctcaa 1140
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1.一種具有IgG抗體結(jié)合活性和纖維素結(jié)合活性的雙功能融合蛋白CBD-ProA，其堿基序列如序列表1所示。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的序列，是可以在大腸桿菌中表達(dá)的pET系列載體，并含有來(lái)源于嗜纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)的纖維素結(jié)合域。
3.一種重組菌株，其特征在于是用權(quán)利要求2的表達(dá)載體pCBD-ProA轉(zhuǎn)化的E.ColiBL21菌株。
4.一種用于抗原捕獲和分離的纖維素免疫磁性微球，其特征在于是以含有權(quán)利要求1所述的序列的融合蛋白CBD-ProA為生物橋聯(lián)劑，在纖維素磁性微球表面特異性偶聯(lián)抗體制成的纖維素免疫磁性微球。
5.一種權(quán)利要求4所述的纖維素免疫磁性微球的制備方法，其特征是將纖維素磁性微球直接與權(quán)利要求3所述的重組菌株pCBD-ProA/E.Coli BL21的發(fā)酵菌體裂解液或其離心后的上清液混合，室溫下振蕩反應(yīng)1至2小時(shí)，或4℃過(guò)夜，將融合蛋白CBD-ProA結(jié)合在纖維素磁性微球的表面；將用于特異性捕獲和分離抗原的IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，直接進(jìn)行振蕩或靜置吸附連接，抗體的濃度在0.1至20mg/mL范圍內(nèi)，溫度保持在4至37℃之間，連接時(shí)間控制在0.5至24小時(shí)之內(nèi)，即可制得纖維素免疫磁性微球。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是通過(guò)交聯(lián)劑將上述CBD-ProA和IgG固定在微球表面，經(jīng)過(guò)量的甘氨酸中和，充分洗凈后即得到抗體交聯(lián)的纖維素免疫磁性微球；交聯(lián)劑使用1至100mM二甲基庚二酸酯(DMP)或0.05至1.0％戊二醛(GA)，反應(yīng)時(shí)間控制在0.5至5小時(shí)之內(nèi)。
7.一種權(quán)利要求4所述的纖維素免疫磁性微球，在混合樣品中目的蛋白的免疫磁性分離，或污染、或病原樣品中微生物的捕獲與鑒定以及細(xì)胞的分離中的應(yīng)用。
全文摘要
一種雙功能融合蛋白CBD－ProA載體及其制備的免疫磁性微球和應(yīng)用。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)將金黃色葡萄球菌的蛋白A基因定向克隆至含有纖維素結(jié)合域標(biāo)簽的pET系列載體，構(gòu)建了同時(shí)具有IgG抗體結(jié)合活性和纖維素結(jié)合活性的雙功能融合蛋白CBD－ProA的載體，并轉(zhuǎn)入E.Coli BL21感受態(tài)菌株，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高含量的CBD－ProA融合表達(dá)蛋白。并利用CBD－ProA作為生物橋聯(lián)劑，將IgG抗體固定于纖維素磁性微球表面。以生物特異性偶聯(lián)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理吸附法和化學(xué)鍵合法，即可高效率的結(jié)合抗體，得到可用于蛋白分離和病原微生物捕獲鑒定的免疫磁性微球。本發(fā)明提供的纖維素免疫磁性微球可用于，混合樣品中目的蛋白的免疫磁性分離，或污染、或病原樣品中微生物的捕獲與鑒定以及細(xì)胞的分離。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101054594SQ20071005704
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者白鋼, 曹宇, 朱元元 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)