專利名稱：一類溶栓抗凝雙功能融合蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域，具體地說涉及血栓治療蛋白的融合方法，特別涉及水蛭素與具有纖溶酶原激活作用的蛋白質(zhì)分子通過含凝血因子Xa(FXa)識(shí)別的氨基酸序列作為連接肽的連接方法，特別涉及為使融合蛋白具有靶向性和融合蛋白在體內(nèi)可分裂為兩游離的原蛋白本身的方法，特別是水蛭素與葡激酶(SAK)和水蛭素與組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別的氨基酸序列的肽鏈作為連接肽的連接方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是人類近年面臨的頭號(hào)殺手。葡激酶(Staphylokinase，SAK)是新一代天然的纖溶酶原激活劑，降低其免疫原性對(duì)促進(jìn)其臨床廣泛應(yīng)用具有重要意義。水蛭素(Hirudin，HV)是來自水蛭的天然抗凝小分子蛋白藥物，對(duì)凝血酶具有高的親和性和選擇性抑制作用。
SAK來源于微生物，對(duì)人體具有免疫原性。為提高SAK的選擇性，我們利用水蛭素對(duì)凝血酶的高度親和性，采用融合蛋白的方法提高SAK對(duì)凝血部位的親和力；通過減小臨床SAK的用藥劑量，從而減輕臨床因SAK引起的免疫反應(yīng)。
組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、尿激酶樣纖溶酶原激活劑(u-PA)具有活化纖溶酶原的作用，活化的纖溶酶在溶解血栓部位纖維蛋白的同時(shí)也引起了系統(tǒng)非血栓部位出血反應(yīng)，提高藥物的靶向性、減小藥物的用量是有效的解決方法。
同時(shí)，被纖溶酶溶解的微小血塊隨血液循環(huán)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起新的血栓形成，因而臨床上在實(shí)施溶栓處理的同時(shí)采用水蛭素、肝素等實(shí)施抗凝組合治療。
國(guó)內(nèi)外在水蛭素與SAK、SK的融合方法進(jìn)行了研究，但水蛭素的抗凝血酶的活性均告喪失，僅保留了SAK的活性或部分活性。
在凝血過程中，人體血液中無(wú)活性的凝血因子FX在凝血部位被活化成活性形式的凝血因子FXa；活性FXa是凝血共同途徑的必需因子。凝血因子FXa可特異識(shí)別氨基酸四肽IEGR(-IleGluGlyArg-Xaa)序列、并使蛋白在精氨酸殘基羧基末端發(fā)生水解。FXa識(shí)別序列被常用作蛋白標(biāo)簽或信號(hào)肽與目的蛋白的連接肽，以使實(shí)驗(yàn)分析過程中方便地得到游離的目的蛋白。
本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于將所要融合的兩個(gè)目的蛋白通過含F(xiàn)Xa識(shí)別序列的連接肽相連，融合蛋白具有活化纖溶酶原的活性、具有溶栓功能；融合蛋白在利用水蛭素的靶向性使融合蛋白到達(dá)血栓部位后，通過FXa的蛋白水解酶活性，釋放出兩個(gè)相應(yīng)的游離蛋白，恢復(fù)各自的完全活性和發(fā)揮各自完整功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容第一方面涉及凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR(-IleGluGlyArg-Xaa)序列在溶栓、抗凝兩種活性蛋白融合中的應(yīng)用，其目的在于融合蛋白在進(jìn)入血栓部位后可被系統(tǒng)自身FXa所水解成兩個(gè)游離蛋白。
本發(fā)明的內(nèi)容第二方面涉及含有凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR(-IleGluGlyArg-Xaa)序列連接溶栓、抗凝兩種活性蛋白的融合蛋白在大腸桿菌和酵母中的表達(dá)。
本發(fā)明內(nèi)容第三方面涉及SAK與水蛭素之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR序列的氨基酸連接而成融合蛋白SFH，融合蛋白SFH對(duì)血栓部位比游離SAK具有更好的靶向性和選擇性，融合蛋白具有活化纖溶酶原成纖溶酶，從而具有溶栓功能。
本發(fā)明內(nèi)容第四方面涉及SAK與水蛭素之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR序列的肽連接而成融合蛋白SFH，融合蛋白SFH進(jìn)入血栓部位后，F(xiàn)Xa水解融合蛋白成SAK部分和游離水蛭素，SAK部分具有活化纖溶酶原活性，釋放出來的水蛭素具有抗凝血酶活性。
本發(fā)明內(nèi)容第五方面涉及tPA與水蛭素之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR序列的氨基酸連接而成融合蛋白PAFH，融合蛋白PAFH對(duì)血栓部位比游離tPA具有更好的靶向性和選擇性。
本發(fā)明內(nèi)容第六方面涉及tPA與水蛭素之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別氨基酸四肽IEGR序列的氨基酸連接而成融合蛋白PAFH，融合蛋白PAFH進(jìn)入血栓部位后，F(xiàn)Xa水解融合蛋白成tPA部分和游離水蛭素，tPA部分具有活化纖溶酶原活性，釋放出來的水蛭素具有抗凝血酶活性。
具體實(shí)施例方式
(一)在SAK基因兩端分別加上EeoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建不帶終止密碼子的葡激酶SAK基因到載體pBV220，得pBVSAK；用PCR方法在水蛭素基因前加上BamH I酶切位點(diǎn)和FXa識(shí)別氨基酸序列的編碼堿基，BamH I酶切位點(diǎn)和FXa識(shí)別氨基酸序列的編碼堿基的加入方法采用引物合成方法合成到水蛭素基因上游5’端之前，水蛭素下游引物合成帶有Pst I酶切位點(diǎn)；用BamH I和Pst I雙酶切帶FXa識(shí)別序列的的水蛭素基因，同時(shí)BamH I和Pst I雙酶切上述pBVSAK載體，將酶切回收水蛭素基因片段連接到pBVSAK載體，得pBVSFH質(zhì)粒。也可以是拼接重疊PCR方法連接上述兩個(gè)基因片段。將pBVSFH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，溫度誘導(dǎo)表達(dá)。融合目的蛋白含SAK氨基酸序列、FXa識(shí)別序列、水蛭素氨基酸序列三個(gè)功能區(qū)。
具體實(shí)施例方式
(二)在tPA基因上下游分別加上Xho I和Avr II酶切位點(diǎn)，構(gòu)建不帶終止密碼子的tPA基因到pPIC9載體；用PCR方法在水蛭素基因上游加上Avr II酶切位點(diǎn)和FXa識(shí)別氨基酸序列的編碼堿基，Avr II酶切位點(diǎn)和FXa識(shí)別氨基酸序列的編碼堿基的加入方法采用引物合成方法合成到水蛭素基因上游5’端之前，水蛭素下游引物合成帶有Not I酶切位點(diǎn)；用Avr II和Not I雙酶切帶FXa識(shí)別序列的的水蛭素基因并連接到上述構(gòu)建的帶tPA基因的pPIC9載體的tPA下游，構(gòu)成融合基因PAFH，得質(zhì)粒pPAFH。用BamH I和Sal I雙酶切pPAFH和pPIC9K質(zhì)粒，將PAFH基因構(gòu)建到pPIC9K，得pPAFH-K基因。線性化pPAFH-K質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化并重組到酵母基因組，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。融合目的蛋白含tPA氨基酸序列、FXa識(shí)別序列、水蛭素氨基酸序列三個(gè)功能區(qū)。
權(quán)利要求
1.通過含凝血因子FXa識(shí)別氨基酸序列的連接肽連接纖溶酶原激活劑和抗凝血酶蛋白兩類活性蛋白的融合蛋白，蛋白融合具有靶向性，還具有溶栓抗凝雙功能活性；在凝血過程中，人體血液中無(wú)活性的凝血因子FX在凝血部位被活化成活性形式的凝血因子FXa，因此，融合蛋白在進(jìn)入血栓部位后，可被血栓部位的活性凝血因子Xa(FXa)水解成兩個(gè)游離蛋白。
2.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白，是指葡激酶(SAK)通過含有FXa識(shí)別序列的肽與水蛭素連接構(gòu)成的融合蛋白。
3.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白，是指組織型纖溶酶原活化劑(tPA)通過含有FXa識(shí)別序列的肽與水蛭素連接構(gòu)成的融合蛋白。
4.權(quán)利要求2中所說的SAK通過含有FXa識(shí)別序列的肽與水蛭素連接構(gòu)成的融合蛋白，是指SAK在含有FXa識(shí)別序列的連接肽的N末端、水蛭素在含有FXa識(shí)別序列肽的C末端構(gòu)成的融合蛋白；也指水蛭素在含有FXa識(shí)別序列的連接肽的N末端、SAK在含有FXa識(shí)別序列肽的C末端構(gòu)成的融合蛋白。
5.權(quán)利要求3中所說的tPA通過含有FXa識(shí)別序列的肽與水蛭素連接構(gòu)成的融合蛋白，是指tPA在含有FXa識(shí)別序列的連接肽的N末端、水蛭素在含有FXa識(shí)別序列肽的C末端構(gòu)成的融合蛋白；也指水蛭素在含有FXa識(shí)別序列的連接肽的N末端、tPA在含有FXa識(shí)別序列肽的C末端構(gòu)成的融合蛋白。
6.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白的靶向性，其特征在于利用融合蛋白中水蛭素部分與凝血酶的強(qiáng)親和力，促進(jìn)融合蛋白與凝血部位的結(jié)合。
7.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白的溶栓抗凝雙功能活性，溶栓活性是指融合蛋白具有的活化纖溶酶原為纖溶酶、纖溶酶降解纖維蛋白，從而表現(xiàn)為溶栓活性；抗凝活性是指融合蛋白具有的抗凝血酶活性。
8.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白的溶栓抗凝雙功能活性，是指融合蛋白可以同時(shí)具有的活化纖溶酶原為纖溶酶、纖溶酶降解纖維蛋白，從而表現(xiàn)為溶栓活性，還具有抗凝血酶活性。
9.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白的溶栓抗凝雙功能活性，是指融合蛋白在進(jìn)入血栓部位后可被血液循環(huán)系統(tǒng)血栓部位活化的的FXa所水解成兩個(gè)游離蛋白，兩個(gè)游離蛋白分別具有活化纖溶酶原而溶栓活性和抗凝活性。
10.權(quán)利要求9中所說的融合蛋白，其特征在于融合蛋白在體外和體內(nèi)未裂解之前可以是有活性的融合蛋白，也可以是無(wú)活性的融合蛋自。
11.權(quán)利要求1中所說的融合蛋白，是指在大腸桿菌中、在畢赤酵母中、在釀酒酵母和在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的具有權(quán)利要求1所說特征的融合蛋白。
12.權(quán)利要求1所說的含凝血因子FXa識(shí)別氨基酸序列的連接肽，其特征在于連接肽中包含有凝血因子FXa特異識(shí)別的四個(gè)氨基酸IEGR(-IleGluGlyArg-)序列的肽，連接肽可以是比四個(gè)氨基酸IEGR序列更長(zhǎng)的包含有凝血因子FXa特異識(shí)別的四個(gè)氨基酸IEGR序列的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療血栓的重組融合蛋白的融合方法和所得到的融合蛋白，具體而言是抗凝血酶活性蛋白水蛭素與具有纖溶酶原激活作用的蛋白質(zhì)分子通過凝血因子Xa(FXa)識(shí)別的氨基酸序列作為連接肽的連接方法和所得到的融合蛋白，特別涉及水蛭素與葡激酶(SAK)、組織型纖溶酶原激活劑(t－PA)之間通過含有凝血因子FXa識(shí)別的氨基酸序列的連接肽的融合方法和所得到的融合蛋白；本發(fā)明還涉及采用上述融合方法所得到的融合蛋白的藥學(xué)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1480466SQ0212908
公開日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者石炳興, 吳祖澤, 于愛平, 董春娜 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī), 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 北京魯銀利華醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司