專利名稱：與小麥白粉病抗性基因PmHNK54連鎖的標(biāo)記引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥抗白粉病基因的標(biāo)記引物，屬分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及與小 麥白粉病抗病基因PrnHNK54緊密連鎖的標(biāo)記引物及其在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥白粉病是由小麥白粉病菌[Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. Tritici, 簡稱為欲 ]所引起的一種氣傳性真菌病害，為世界各主要麥區(qū)的主要病害之一，且發(fā)病范 圍日益擴(kuò)大，危害程度不斷加重，可引起13. 4% 34%的產(chǎn)量損失。選育和使用高效抗病 品種是最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的解決辦法，根據(jù)“基因?qū)颉奔僬f，任何抗病基因都會出現(xiàn)克 服其抗性的毒性小種，反之亦然，二者呈共進(jìn)化的關(guān)系，即一個新的抗病基因在經(jīng)過一段時 間的應(yīng)用后，就會有針對它的毒性小種出現(xiàn)，使其逐漸喪失抗病性，給小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p 失。因此，發(fā)掘新的白粉病抗源已成為目前小麥抗白粉病育種工作一項非常迫切的任務(wù)。到目前為止，國際小麥基因命名委員會共正式命名了來自43個位點的61個白粉 病抗病基因(powdery mildew, Pm) 0%7-作衫)，其中35個抗病基因已找到連鎖或共分離 的分子標(biāo)記。近年來，分子標(biāo)記作圖技術(shù)發(fā)展迅速，眾多的分子標(biāo)記類型中以簡單重復(fù)序列 標(biāo)記(SSR)、擴(kuò)增長度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)以及由限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)轉(zhuǎn)化的 序列標(biāo)簽位點(STS)標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛。新發(fā)掘的白粉病抗病基因所構(gòu)建的遺傳圖譜基本 都是應(yīng)用的這三類標(biāo)記。隨著小麥基因組學(xué)研究的蓬勃發(fā)展，表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫的信息量呈現(xiàn)出 指數(shù)級增長，截止2008年11月小麥EST數(shù)據(jù)庫登錄的EST序列 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/dbEST/index.html)已超過 1，250，932 條，同時 EST-SSR 因具有成本低、特 異性好等優(yōu)點，為新的標(biāo)記開發(fā)提供了豐富的序列資源，已成為SSR標(biāo)記發(fā)展的一個新方 向。小麥近緣種屬如一粒小麥、二粒小麥、粗山羊草等已成為白粉病新抗病基因非常 重要的來源、Pm30-Pm37，Pm41~Pm43)，這些抗病基因多為質(zhì)量抗性，對當(dāng)前流行的生理小 種有較好的抗性。但這類抗源往往與不利的農(nóng)藝性狀相連鎖，作為抗源導(dǎo)入栽培品種時，后 代需要經(jīng)過多代回交打破與不利基因的連鎖，有的甚至經(jīng)過多代回交以后仍無法打破這種 連鎖，這在很大程度上制約了此類抗源在育種中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種與小麥白粉病 抗性基因/^//ΛΤ似緊密連鎖的標(biāo)記 及其應(yīng)用，通過發(fā)掘到的分子標(biāo)記，首次對小麥親本材料鄭9754中的白粉病抗性新基因進(jìn) 行染色體定位，同時構(gòu)建其連鎖圖譜，為該基因在小麥白粉抗病育種中的應(yīng)用提供抗源材 料和理論支持。本發(fā)明的技術(shù)方案
與小麥白粉病抗性基因PmHNK54連鎖的標(biāo)記引物，所述標(biāo)記弓丨物的核苷酸序列為 標(biāo)記引物Xbarc5，
Pl :5，-GCGCCTGGACCGGTTTTCTATTTT-3，，P2 :5’ -GCGTTGGGAATTCCTGAACATTTT -3’， 或者標(biāo)記引物Xgwm312， P3 5' -ATCGCATGATGCACGTAGAG -3，， P4 :5’ -ACATGCATGCCTACCTAATGG -3，。所述標(biāo)記引物在遺傳圖譜上的順序為Xbarc5、PmHNK54、Xgwm312，所述標(biāo)記引物 Xbarc5與基飯PmHNK54的遺傳距離為5. OcM，所述標(biāo)記引物Xgwm312與PmHNK54的遺傳距 離為6. O cMo將標(biāo)記引物用于SSR標(biāo)記篩選時的反應(yīng)程序為 (1) PCR 反應(yīng)
所述PCR 反應(yīng)體系為 10 μ 1，含 IOXbuffer 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0. 2μ L,20 uM/μ L 引物 0· 2μ 1，5 U/ul Taq 酶 0. lul，去離子水 8. 1 μ 1,20 ng/μ 1 基因組 DNA 0. 4 μ 1 ；
(2)擴(kuò)增程序為94°C預(yù)變性3min，94°C變性1 min，55°C或60°C復(fù)性1 min，72°C 延伸2 min, 40個循環(huán)；72°C延伸10 min ；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染 色后觀察照相。所述的與小麥白粉病抗性基因Λβ/ΥΛΤ似連鎖的標(biāo)記引物在輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的方法是將小麥抗病親本鄭9754與感病親本中國春(Chinese Spring, CS)雜交、自交，對雙親及其雜交后代進(jìn)行苗期鑒定，用小麥白粉病菌10YY2進(jìn)行遺 傳分析，利用SSR、EST-SSR標(biāo)記對雙親及抗感池進(jìn)行篩選和分析，并結(jié)合中國春缺_四體材 料進(jìn)行染色體定位。試驗結(jié)果顯示小麥親本材料鄭9754對白粉菌高毒力小種10YY2的抗性良好，其 抗病性受一對顯性核基因控制，將該基因暫命名為/^iWU么本發(fā)明篩選了與Z^fflWf似緊 密連鎖的2個微衛(wèi)星標(biāo)記，在遺傳圖譜上的順序為Xbarc5、PmHNK54、Xgwm3120兩個連鎖 的側(cè)翼標(biāo)記于/7^Wf似遺傳距離分別為5. 0 cM、6. 0 cM，姚PmHNK54定位于2AL染色體 上。本發(fā)明的積極有益效果
本發(fā)明提供的普通小麥親本材料鄭9754中的抗白粉病基因/^//ΛΤ似的分子標(biāo)記方 法，具有以下特點
1、本發(fā)明的分子標(biāo)記引物首次定位了小麥親本材料鄭9754中的白粉病抗性新基因 /^//ΛΤ似。標(biāo)記的特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，并且標(biāo)記的篩選方法操作簡單快捷，對檢測設(shè)備和引 物模板質(zhì)量要求不高，具有試驗試劑用量少，速度快，成本低，適合大批次、高通量、自動化 的優(yōu)點。非常適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)分子育種的實現(xiàn)。2、本發(fā)明的輔助育種的功能目標(biāo) 十分明確，可以大量節(jié)約成本。傳統(tǒng)的白粉病抗 病育種首先利用優(yōu)異白粉病抗源和改良親本進(jìn)行雜交，然后對后代群體進(jìn)行白粉病抗病性 接種鑒定，該方法易受環(huán)境氣候影響，選擇準(zhǔn)確性較低。因此傳統(tǒng)抗病育種不但費(fèi)時、費(fèi)工， 而且效率低、成本高。利用本發(fā)明的白粉病抗病基因分子標(biāo)記與白粉病抗性新基因/^//ΛΤ似 緊密連鎖，在苗期就可快速、高通量地鑒定出含有白粉病抗性新基因/^//ΛΤ似的分離群體 和高代品系，在降低育種成本的同時，還大幅度地提高了選擇效率。3、本發(fā)明為抗白粉病基因/^//ΛΤ似的圖位克隆提供了重要的分子遺傳學(xué)信息。兩個標(biāo)記在遺傳圖譜上的順序為\\mrdPmHNK54、Xgwm312。兩個連鎖的側(cè)職紛PmHNK54 遺傳距離分別為5. O cM、6.0 cM，并將/^/ΥΛΤ似定位于2AL染色體上。上述信息可以為白粉 病抗性新基因PmHNK54的圖位克隆試驗奠定基礎(chǔ)。4、本發(fā)明利用的親本材料鄭9754對白粉病具有優(yōu)異的抗性，且自身農(nóng)藝性狀優(yōu) 良，作為新的白粉病抗源導(dǎo)入小麥品種的難度小，無不利連鎖，在育種方面具有較大優(yōu)勢。 利用經(jīng)典遺傳學(xué)、中國春缺體-四體定位和分子標(biāo)記方法對小麥親本材料鄭9754攜帶的 白粉病抗性新基因進(jìn)行遺傳分析，明確其遺傳規(guī)律，對抗病基因進(jìn)行定位，開發(fā)與其緊密連 鎖的分子標(biāo)記，為白粉病抗病育種提供新的抗源，同時也為/^//ΛΤ似在生產(chǎn)中進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種提供技術(shù)支持。5、本發(fā)明的白粉病抗病基因分子標(biāo)記引物應(yīng)用于育種工作中，將大大降低白粉病 流行引起的小麥產(chǎn)量損失，同時減少農(nóng)藥使用量，有利于降低生產(chǎn)成本和提高糧食產(chǎn)量，具 有很大的應(yīng)用潛力和較高的經(jīng)濟(jì)價值。


圖1連鎖標(biāo)記Xgwm312對2A同源群缺體-四體及2A缺失系的擴(kuò)增結(jié)果。圖中，箭頭所示為多態(tài)性目的條帶。M: Marker, 1鄭9754，2:中國春，3:抗病 DNA 池，4:感病 DNA 池，5:缺體 2A 四體 2B (N2AT2B)，6 缺體 2A 四體 2D (N2AT2D), 7 缺 體 2B 四體 2A (N2BT2A)，8缺體 2B 四體 2D (N2BT2D)，9缺體 2D 四體 2A (N2DT2A), 10: 缺體 2D 四體 2B (N2DT2B), 11:缺失系(2AL-1)。圖2抗白粉基因作辦似的微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖遺傳圖譜，顯示分子標(biāo)記與 PmHNK54。圖2中左邊為位點名稱，右邊為遺傳距離，單位是cM。圖3抗白粉基因/^fflWif似的微衛(wèi)星標(biāo)記物理圖譜，證明了Λη/ΥΛΤ似基因在染色體 2AL上的存在區(qū)域。圖中a表示遺傳圖譜；b表示物理圖譜。圖4 PmLK906和Pm4連鎖的分子標(biāo)記對抗病親本材料鄭9754與中國春及其雜 交后代組成的抗、感池檢測結(jié)果，用以檢驗/7^Wf似與浙和Zi^在分子水平上的差 異，表明/^ffl/W^M不同于/iBZ烈和作毛是一個位于染色體2AL上的新基因。圖中，M: Marker, 1鄭 9754，2 中國春，3 抗病 DNA 池，4:感病 DNA 池。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，其中出現(xiàn)的百分比濃度如無特別說明，均指質(zhì)量百 分比濃度。實施例1 與小麥白粉病抗性基因PmHNK54連鎖的標(biāo)記弓丨物及其應(yīng)用 材料與方法
(一)供試驗的小麥材料親本材料鄭9754與中國春(CS)的正交和反交F1代、F2 代、F2:3、代群體，以及中國春及其缺體-四體系(nullisomic-tetrasomic lines, NT) N2A-T2B, N2A-T2D, N2B-T2A, N2B-T2D, N2D-T2A 和 N2D-T2B,染色體 2A 的 2 個缺失系 2AS-5 (FL=O. 78)，2AL-1 (FL=O. 85)，抗病對照材料Aramda iPm4b) ,Kavkaz、周 22
、鄭麥 883 (/^力)、齒牙糙(/^匆)、蘭考 906 (PmLK906)。(二)分析方法①苗期白粉病抗病性分析抗病性鑒定采用人工接種方法，當(dāng) 供試小麥幼苗長至三葉期時，用抖粉法接種后置于隔離的接種間內(nèi)(溫度15-20°C /晝、 10-15°C /夜，光照14-16 h/h · d-1，光強(qiáng)10000 lx，相對濕度:80%)潛育發(fā)病，待感病對照中國春充分發(fā)病后(7-10d)，按盛寶欽6級分類法劃分抗病分級即0，0;，1，2，3，4，其中 0-0 ；為免疫，1為高抗，2為中抗，3為中感，4為高感。對F2、F213后代用卡方檢驗進(jìn)行分離 比適合度測驗，確定品種所含的抗病基因數(shù)目及互作方式。②DNA提取和抗感池構(gòu)建小麥基因組DNA的提取采用CTAB法。在F2群體中分 別隨機(jī)選取10株抗病植株和10株感病株提取DNA，各自取等量混合建立抗病池和感病池。③SSR引物的分析SSR引物根據(jù)SSR協(xié)作組的610對SSR和EST-SSR弓丨物 (http://wheat, pw. usda. gov/ggpages/SSR/)報道的引物合成。PCR 反應(yīng)在 Bio-RAD Thermocycler 上進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μ 1，含 IOXbuffer (Mg2+) 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0· 2 μ L，20 uM/ μ L 引物 0. 2μ1，5 U/ul Taq 酶 0. lul，去離子水 8.1 μ 1,20 ng/μ 1 基因組 DNA 0.4 μ I。擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3 min，94°C變性 1 min，50°C、55°C、60°C復(fù)性 lmin，72°C延 伸2min，40個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚 丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)硝酸銀染色后觀察照相。④遺傳距離估算、連鎖分析以及白粉病抗病基因的染色體定位
用Mapmarker 3. Ob軟件計算標(biāo)記與抗白粉病基因間的遺傳距離(L0D彡3. 0)。用 Mapdraw軟件繪制該基因的遺傳連鎖圖譜。根據(jù)SSR擴(kuò)增結(jié)果，找到在雙親、抗病池和感 病池間具有多態(tài)性的引物，通過F2:3群體對多態(tài)性引物進(jìn)行驗證，利用該引物的定位信息 對抗病基因進(jìn)行定位，并利用一套中國春的缺體四體(第二同源群)對定位結(jié)果進(jìn)一步的驗 證。然后，結(jié)合小麥微衛(wèi)星引物的物理圖譜，對該抗病基因的精細(xì)定位進(jìn)行進(jìn)一步的分析。結(jié)果與分析
(一)抗性鑒定和遺傳分析
用河南省的7個高致病力小麥白粉病菌生理小種對供試材料接菌，苗期接種結(jié)果表 明，親本材料 鄭9754對其中的6個小種表現(xiàn)為高抗或中抗，與蘭考906 (PmLK906)抗病表 現(xiàn)差異十分明顯感病品種中國春、Armada {Pm4b)和Kavkaz 0%勸對以上7個小種均表 現(xiàn)為高感，侵染型為3-4型；齒牙糙(Pm24~)對08B1和10YY2表現(xiàn)為感??；周22 (PmHNK)、鄭 麥883 (Pm21)則對以上小種表現(xiàn)出很好的抗性。試驗結(jié)果表明抗病基因/is^W似與Pm4、 PmLK906對7個菌系抗性水平表現(xiàn)差異十分明顯，親本材料鄭9754的抗性表現(xiàn)優(yōu)異。(見 表1)
表1小麥親本材料鄭9754單孢小種抗病鑒定結(jié)果(0-2 抗??；3-4 感病)
權(quán)利要求
與小麥白粉病抗性基因PmHNK54連鎖的標(biāo)記引物，其特征在于，所述標(biāo)記引物的核苷酸序列為 標(biāo)記引物Xbarc5， P15’ GCGCCTGGACCGGTTTTCTATTTT 3’，P25’ GCGTTGGGAATTCCTGAACATTTT 3’，或者標(biāo)記引物Xgwm312， P35’ ATCGCATGATGCACGTAGAG 3’， P45’ ACATGCATGCCTACCTAATGG 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記引物，其特征在于，所述標(biāo)記引物在遺傳圖譜上的順序 為Xhar&、ΡπιΗΝΚ54、Xgwm312，所述標(biāo)記弓丨物Xbarc5與基因PmHNK54的遺傳距離為5. OcM， 所述標(biāo)記引物Xgwm312與PmHNK54的遺傳距離為6. O cM。
3.—種權(quán)利要求1所述的與小麥白粉病抗性基因PmHNK54似連鎖的標(biāo)記引物的用法，其 特征在于，將所述標(biāo)記引物用于SSR標(biāo)記篩選時的反應(yīng)程序為(1) PCR 反應(yīng)PCR 反應(yīng)體系為 10 μ 1，含 IOXbuffer 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0. 2 μ L, 20 uM/μ L 引物 0. 2μ1，5 U/ul Taq 酶 0. Iul，去離子水 8.1 μ 1,20 ng/μ 1 基因組DNA 0. 4 μ 1 ；(2)擴(kuò)增程序為94°C預(yù)變性3min，94°C變性1 min，55°C或60°C復(fù)性1 min，72°C 延伸2 min, 40個循環(huán)；72°C延伸10 min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染 色后觀察照相。
4.權(quán)利要求1或2所述的與小麥白粉病抗性基因PmHNK54似連鎖的標(biāo)記引物在輔助育種 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及與小麥白粉病抗病基因PmHNK54緊密連鎖的標(biāo)記引物及其在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。標(biāo)記引物在遺傳圖譜上的順序為Xbarc5、PmHNK54、Xgwm312，Xbarc5、Xgwm312與PmHNK54的遺傳距離分別為5.0cM、6.0cM。SSR標(biāo)記篩選時PCR反應(yīng)體系10μl，含10×buffer1μl，10mM/μldNTP0.2μL、20uM/μL引物0.2μl、5U/ulTaq酶0.1ul、去離子水8.1μl、20ng/μl基因組DNA0.4μl；擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，55℃或60℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)；72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。本發(fā)明首次定位了小麥親本材料鄭9754中的白粉病抗性新基因PmHNK54，標(biāo)記特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，適合大批次、高通量、自動化的優(yōu)點，節(jié)約成本，提高選擇效率。
文檔編號C12N15/11GK101988064SQ20101057227
公開日2011年3月23日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者張建周, 張磊, 李春鑫, 王會偉, 胡琳, 董海濱, 許為鋼 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院