專利名稱：與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國美利奴羊包括以下5個品系:1、軍墾型A品系，含澳血75%，特點是體格較大，產(chǎn)毛量高，系毛肉兼用較理想的細(xì)毛羊(劉守仁.中國美利奴羊(新疆軍墾型)的育成:中國工程院院士劉守仁綿羊育種文集.新疆科學(xué)技術(shù)出版社，2005)。2、軍墾型B品系:合澳血60.25%，波爾華斯13.5%。突出特點是毛長，細(xì)度理想，羊毛品質(zhì)優(yōu)，胸寬且深，四肢較短，善行走，適合放牧(劉守仁.中國美利奴羊(新疆軍墾型)的育成:中國工程院院士劉守仁綿羊育種文集.新疆科學(xué)技術(shù)出版社，2005)。3、多胎品系:采用軍墾型A品系多胎公、母羊本種累代選育和導(dǎo)入湖羊血液，通過嚴(yán)格選擇，大量淘汰手段，用系祖建系的方法，育成了中國美利奴羊(新疆軍墾型)多胎品系(劉守仁.中國美利奴羊(新疆軍墾型)的育成:中國工程院院士劉守仁綿羊育種文集.新疆科學(xué)技術(shù)出版社，2005)。4、超細(xì)品系，中國美利奴超細(xì)品系是采用系祖法建系，該品系細(xì)度明顯優(yōu)于其他品系(楊永林.中國美利奴超細(xì)型細(xì)毛羊的特征特性.畜牧獸醫(yī)技術(shù)，2005，(5): 28-29)。5、肉用多胎品系，中國美利奴(新疆軍墾型)多胎肉用細(xì)毛羊培育是由中國工程院院士劉守仁主持的國家重點科研項目，項目以培育生長發(fā)育快、產(chǎn)肉多、肉用品質(zhì)好、繁殖力強的肉用細(xì)毛羊為目標(biāo)，這對于我國細(xì)毛羊業(yè)的發(fā)展意義深遠(yuǎn)。在多胎肉用細(xì)毛羊的培育過程中，除了重點突出其肉用生產(chǎn)性能外，羊毛品質(zhì)也是項目研究的一項重要內(nèi)容，使多胎肉用細(xì)毛羊不僅肉用性能好而且羊毛品質(zhì)也好，更符合市場的要求，提高了養(yǎng)羊生產(chǎn)的經(jīng)濟效益(何其宏，魏榮安，馬春萍，等.中國美利奴多胎肉用細(xì)毛羊羊毛品質(zhì)分析.中國草食動物，2004,24(5):52-53.)。哈薩克羊產(chǎn)于新疆，是中國三大粗毛羊品種之一，肉脂兼用，具有較高的肉脂生產(chǎn)性能，被毛比較粗糙，不適合作毛紡原料(劉守 仁著.綿羊?qū)W，新疆科技衛(wèi)生出版社，1996，烏魯木齊)。角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(KAPs)作為填充物與羊毛中間絲構(gòu)成骨架交叉連接，是毛主要的組成，約占毛干90%以上。由于在不同的物種和不同的羊毛結(jié)構(gòu)中，特異的表達(dá)不同的KAP蛋白，所以羊毛的主要性狀是與不同的KAP組成有非常緊密的關(guān)系。毛纖維基質(zhì)主要組成部分的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白，根據(jù)氨基酸組成和分子大小通常分為3個主要類群。(I)高甘氨酸-酪氨酸蛋白(KAPs6、7、8)蛋白，甘氨酸和酪氨酸含量為35 60mol% ;(2)高硫蛋白(KAPsl.n、2.n、3.n)，蛋白中富含含硫蛋白(富含半胱氨酸)，半胱氨酸含量低于30mol% ；超高硫蛋白(KAPs4、5)，半胱氨酸含量高于30mol%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一個與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記是SEQ ID N0.l的第211-246位所示的36bp的DNA片段。
本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)出以下技術(shù)方案:本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)的一種技術(shù)方案是鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的方法，包括如下步驟:以待鑒別綿羊的基因組DNA為模板，采用與SEQ ID N0.1的第211位上游特異結(jié)合的單鏈DNA為正向引物、與SEQID N0.1的第246位下游特異結(jié)合的單鏈DNA為反向引物，進行擴增，根據(jù)得到的擴增產(chǎn)物按照下述方法確定所述待鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊:如果所述待鑒別綿羊的擴增產(chǎn)物含有SEQ ID N0.1的第211-246位，所述待鑒別綿羊為羊毛超細(xì)型綿羊或為候選羊毛超細(xì)型綿羊；如果所述待鑒別綿羊的擴增產(chǎn)物不含有SEQ ID N0.1的第211-246位，所述待鑒別綿羊為非羊毛超細(xì)型綿羊或為候選非羊毛超細(xì)型綿羊。其中，所述SEQ ID N0.1的第211位上游不包括所述SEQ ID N0.1第211位，所述SEQ ID N0.1的第246位下游不包括所述SEQ ID N0.1的第246位。上述方法中，所述擴增為PCR擴增。上述方法中，所述正向引物只要與SEQ ID N0.1的第211位上游特異結(jié)合即可，在本發(fā)明的實施例中，所述正向引物的序列是5’-CAAGTGACACCTATACTCTC-3’，是SEQ ID N0.1的第1-21位；所述反向引物只要與SEQ ID N0.1的第246位下游特異結(jié)合即可，在本發(fā)明的實施例中，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA，其序列是 5' -CATATCAGAAGTCTGTAGTG-3'。
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本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)的另一種技術(shù)方案是鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的方法，包括如下步驟:以待鑒別綿羊的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1的第1_21位所示的單鏈DNA為正向引物，以與SEQID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA為反向引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，按照下述方法確定所述待鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊:如果所述待鑒別綿羊的PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳中顯示為300_500bp之間的兩條帶，所述待鑒別綿羊為羊毛超細(xì)型綿羊或為候選羊毛超細(xì)型綿羊，如果所述待鑒別綿羊的PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳中顯示為300-500bp之間的一條帶，所述待鑒別綿羊為非羊毛超細(xì)型綿羊或為候選非羊毛超細(xì)型綿羊。上述兩種方法中，所述PCR擴增采用的引物退火溫度均可為60°C。在本發(fā)明的實施例中，所述PCR擴增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 30s，60。。退火 30s，72。。延伸 40s, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0在本發(fā)明的一個實施例中，所述待鑒別綿羊為中國美利奴羊和/或哈薩克羊。其中，所述羊毛超細(xì)型綿羊是指周歲全身羊毛纖維平均直徑為17.5μπι以下(包括17.5 μ m)的綿羊，如周歲全身羊毛纖維平均直徑為14μπι-17.5μπι的綿羊。所述非羊毛超細(xì)型綿羊是指周歲全身羊毛纖維平均直徑大于17.5 μ m的綿羊。本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)的再一種技術(shù)方案是用于鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的引物對，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為與SEQ ID N0.1的第211位上游特異結(jié)合的單鏈DNA，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第246位下游特異結(jié)合的單鏈DNA。上述引物對中，所述正向引物的序列是SEQ ID N0.1的第1-21位，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA。本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維平均直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)的再一種技術(shù)方案是鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒含有上述鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的引物對。本發(fā)明根據(jù)上述與綿羊羊毛纖維平均直徑相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)的再一種技術(shù)方案是I)和/或2)用途:I)上述鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的引物對、試劑或試劑盒在鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊中的應(yīng)用。2)上述鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的引物對、試劑或試劑盒在選育羊毛超細(xì)型綿羊中的應(yīng)用。本發(fā)明的與綿羊羊毛纖維平均直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及鑒別羊毛超細(xì)型綿羊的方法和相關(guān)產(chǎn)品不受待鑒別綿羊的年齡、性別等的限制，可用于綿羊特別是中國美利奴羊的早期選育，甚至在綿羊剛出生時就可以篩選，提高羊毛超細(xì)型綿羊育種的選擇效率，加快育種進程。


圖1為PCR引物對FR對綿羊的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。從左至右的泳道依次為IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號:MD109)、EF基因型的中國美利奴羊、EF基因型的中國美利奴羊、EF基因型的中國美利奴羊、EF基因型的中國美利奴羊、EE基因型的中國美利奴羊、EE基因型的中國美利奴羊、EE基因型的哈薩克羊、EE基因型的哈薩克羊。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。哈薩克羊、中國美利奴羊超細(xì)品系、中國美利奴羊A品系(軍墾型A品系)、中國美利奴羊B品系(軍墾型B品系)、中國美利奴羊多胎品系和中國美利奴羊肉用多胎品系樣品可從商業(yè)途徑獲得，也可從新疆農(nóng)墾科學(xué)院種羊場獲得，以重復(fù)本發(fā)明實驗。實施例1、利用SEQ ID N0.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段鑒別或輔助鑒別羊毛超細(xì)型綿羊1、鑒別或輔助鑒別羊毛超細(xì)型綿羊的PCR試劑本實施例的鑒別或輔助鑒別羊毛超細(xì)型綿羊的PCR試劑由PCR引物對FR、10 X Taq緩沖液，dNTP mix, Taq DNA聚合酶和ddH20組成。其中，PCR引物對FR由F和R這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:F:5，-CAAGTGACACCTATACTCTC-3，(SEQ ID N0.1 的第 1-21 位)；R:5’ -CATATCAGAAGTCTGTAGTG-3’(與 SEQ ID N0.1 的第 388-407 位反向互補)。IOXTaq緩沖液，dNTP mix和Taq DNA聚合酶均購自天根生化科技(北京)有限公司(貨號分別為:CD 117與ET109)。
2、鑒別或輔助鑒別羊毛超細(xì)型綿羊取237只中國美利奴羊樣本，其中，中國美利奴羊超細(xì)品系50只，中國美利奴羊A品系50只，中國美利奴羊B品系49只，中國美利奴羊多胎品系40只，中國美利奴羊肉用多胎品系樣品48只。108只哈薩克羊。每只綿羊采用頸靜脈采血，A⑶抗凝，-20°C凍存。每只綿羊均采用如下PCR體系和如下PCR條件，分別以每只綿羊因組DNA為模板，利用步驟I的鑒別或輔助鑒別羊毛超細(xì)型綿羊的PCR試劑進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如表I所示:表1、20 μ L的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的方法，包括如下步驟:以待鑒別綿羊的基因組DNA為模板，采用與SEQ ID N0.1的第211位上游特異結(jié)合的單鏈DNA為正向引物、與SEQ ID N0.1的第246位下游特異結(jié)合的單鏈DNA為反向引物，進行擴增，根據(jù)得到的擴增產(chǎn)物按照下述方法確定所述待鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊: 如果所述待鑒別綿羊的擴增產(chǎn)物含有SEQ ID N0.1的第211-246位，所述待鑒別綿羊為羊毛超細(xì)型綿羊或為候選羊毛超細(xì)型綿羊；如果所述待鑒別綿羊的擴增產(chǎn)物不含有SEQID N0.1的第211-246位，所述待鑒別綿羊為非羊毛超細(xì)型綿羊或為候選非羊毛超細(xì)型綿羊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述擴增為PCR擴增，和/或 所述正向引物的序列是SEQ ID N0.1的第1-21位，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA。
3.鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的方法，包括如下步驟:以待鑒別綿羊的基因組DNA為模板 ，以SEQ ID N0.1的第1_21位所示的單鏈DNA為正向引物，以與SEQID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA為反向引物進行PCR擴增，2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，按照下述方法確定所述待鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊: 如果所述待鑒別綿羊的PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳中顯示為300-500bp之間的兩條帶，所述待鑒別綿羊為羊毛超細(xì)型綿羊或為候選羊毛超細(xì)型綿羊，如果所述待鑒別綿羊的PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳中顯示為300-500bp之間的一條帶，所述待鑒別綿羊為非羊毛超細(xì)型綿羊或為候選非羊毛超細(xì)型綿羊。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增采用的引物退火溫度為 60。。。
5.用于鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的引物對，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為與SEQ ID N0.1的第211位上游特異結(jié)合的單鏈DNA，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第246位下游特異結(jié)合的單鏈DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對，其特征在于:所述正向引物的序列是SEQID N0.1的第1-21位，所述反向引物為與SEQ ID N0.1的第388-407位反向互補的單鏈DNA。
7.含有權(quán)利要求5或6所述引物對的鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊的試劑或試劑盒。
8.權(quán)利要求5或6所述引物對、權(quán)利要求7所述的試劑盒的用途，所述用途為I)和/或2): 1)在鑒別或輔助鑒別綿羊是否為羊毛超細(xì)型綿羊中的應(yīng)用。
2)在選育羊毛超細(xì)型綿羊中的應(yīng)用。
9.SEQ ID N0.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段。
10.SEQ ID N0.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段作為綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記是SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段。本發(fā)明的與綿羊羊毛纖維直徑相關(guān)的分子標(biāo)記及鑒別羊毛超細(xì)型綿羊的方法和相關(guān)產(chǎn)品不受待鑒別綿羊的年齡、性別等的限制，可用于綿羊特別是中國美利奴羊的早期選育，甚至在綿羊剛出生時就可以篩選，提高羊毛超細(xì)型綿羊育種的選擇效率，加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK103243167SQ20131018040
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月15日
發(fā)明者甘尚權(quán), 沈敏, 王新華, 劉守仁, 楊建波, 梁耀偉, 高磊, 楊井泉, 張偉 申請人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院