專利名稱：一種臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞,在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，可用于治療白血病、先天性代謝疾病、某些實(shí)體腫瘤、糖尿病、心臟病和腦癱等多種疾病，具有非常廣闊的醫(yī)療用途，截止2012年12月，全球已開展了4178項(xiàng)干細(xì)胞臨床實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)入臨床三期的項(xiàng)目多達(dá)602項(xiàng)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是目前在治療方面最為安全有效和應(yīng)用廣泛的成體干細(xì)胞，主要來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、羊膜等。截止2013年4月，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)上市7種干細(xì)胞臨床治療產(chǎn)品，有5種為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源。伴隨著干細(xì)胞治療快速發(fā)展，開發(fā)一種臨床級(jí)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基至關(guān)重要。臨床級(jí)干細(xì)胞培養(yǎng)基首先避免使用動(dòng)物來(lái)源血清。動(dòng)物來(lái)源血清中存在潛在病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，且血清成分復(fù)雜，不容易定性研究每種成分對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的作用，且容易引起過(guò)敏反應(yīng)。目前，市場(chǎng)上非常多的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，缺點(diǎn):1、使用動(dòng)物來(lái)源血清，增加了病原體，異種抗原，批次間不穩(wěn)定性。美國(guó)FDA正考慮禁止使用胎牛血清用于細(xì)胞治療；2、干細(xì)胞容易分化，不能長(zhǎng)期保持干性。3、未經(jīng)過(guò)全套第三方病原體檢測(cè)(14項(xiàng)檢測(cè))，不能提供全套第三方病原體檢測(cè)的報(bào)告，培養(yǎng)的細(xì)胞存在病原體污染風(fēng)險(xiǎn)，沒(méi)有達(dá)到臨床級(jí)別。4、市場(chǎng)上可以購(gòu)買到幾種人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，但均為國(guó)外進(jìn)口，且價(jià)格昂貴，每500ml價(jià)格在3000元以上，但培養(yǎng)效果卻不甚理想，干細(xì)胞增值速度以及培養(yǎng)后干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)均不理想。且僅供研究應(yīng)用，不能用于人的診斷及治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基存在的上述問(wèn)題，提供一種臨床級(jí)人問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有以下組分，各組分終濃度分別為:人血清白蛋白I 2g/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10mg/L、纖粘連蛋白2 8mg/L、層粘連蛋白I 4mg/L、Fe (NO3) 3.9H2050g/L、FeSO4.7H20417g/L、雌二醇 I 3 μ g/L、睪酮 2 5 μ g/L、孕酮I 3μ g/L、地塞米松39.25 117.74 μ g/L、胰島素5 10mg/L、核黃素376.36mg/L、輔酶 A80.96 242.87mg/L、丁二胺 4.41 6.17mg/L、牛橫酸 I 2mg/L、氛基乙醇 0.61
1.85mg/L、丙酮酸 8.81 26.42mg/L、硒酸鈉 3.78 7.56 μ g/L、L-谷氨酰胺 292.3 584.6mg/L、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 2 8 μ g/L、表皮生長(zhǎng)因子(EGF) 4 10 μ g/L、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 4 10 μ g /L、白血病抑制因子(LIF) I 5 μ g/L、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1) I 5 μ g/L、干細(xì)胞因子(SCF) 2 8 μ g/L組成。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12。
所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為0.5
2.5 μ g/L的血小板源性生長(zhǎng)因子AB。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為I 4 μ g/L的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α，和/或終濃度為I 4 μ g/L轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為0.5
2.5 μ g/L的腫瘤壞死因子α。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為0.5
2.5 μ g/L的白細(xì)胞介素2 (IL-2)。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為0.5
2.5 μ g/L的促紅細(xì)胞生成素。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為35.74 71.48ng/L的甲狀旁腺激素。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為0.36
1.09mg/L的氫化可的松。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為88.07 352.26mg/L的維生素C。所述的臨床級(jí)人間·充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為10 30mg/L
的非必需氨基酸。所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基還包括:終濃度為I 2mg/L的大豆胰酶抑制劑。本發(fā)明提供了一種臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM/F12提供了細(xì)胞生長(zhǎng)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，并添加了以下物質(zhì)，來(lái)替代血清的作用:1)、提供結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，如人血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。2)、添加激素:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。胰島素促進(jìn)細(xì)胞利用葡糖糖和氨基酸，胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子對(duì)于大多數(shù)類型細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)有重要作用。甲狀旁腺激素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外液中鈣離子濃度。3)、添加和各種生長(zhǎng)因子:如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等等。4)、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷，如:纖粘連蛋白(fibronectin, FN),是細(xì)胞外基質(zhì)的粘著糖蛋白，能使細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)互相粘連，鉚釘細(xì)胞，同時(shí)又介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移。層粘連蛋白(Laminin，LN)作為基膜的主要結(jié)構(gòu)成分對(duì)基膜的組裝起關(guān)鍵作用，主要功能就是在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞固定在基膜上，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中刺激細(xì)胞粘著、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是重要的促進(jìn)貼壁物質(zhì)。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中鐵含量為一般培養(yǎng)基的兩倍，同時(shí)加入轉(zhuǎn)鐵蛋白能結(jié)合鐵離子，減少其毒性，并及時(shí)被干細(xì)胞利用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了硒酸鈉，是無(wú)血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑。硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，促進(jìn)過(guò)氧化物和超氧化物的水解，在代謝解毒中起重要作用。過(guò)氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過(guò)氧化物和超氧化物的累積，同時(shí)，維生素E和丙酮酸，也是過(guò)氧化物清除劑。維生素C可以抗氧化，保護(hù)細(xì)胞。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了大豆胰酶抑制劑，是抗蛋白酶成分，起到中和作用，目的是目的的使用終止傳代過(guò)程中胰蛋白酶的消化作用(胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代)。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了輔酶A，是乙?；磻?yīng)的輔酶，對(duì)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝起著重要的作用，如:三羧酸循環(huán)、肝糖原積存、乙酰膽堿合成、降低膽固醇量、調(diào)節(jié)血脂含量及合成留體物質(zhì)等。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了丁二胺，丁二胺可以合成精胺，精胺與亞精胺都存在于細(xì)菌和大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞中，是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要物質(zhì)，使DNA分子具有更大的穩(wěn)定性與柔韌性，是細(xì)胞培養(yǎng)液中必要組分之一。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加適合人間充質(zhì)干細(xì)胞快速擴(kuò)增且可以保持干細(xì)胞未分化潛能的細(xì)胞因子組合:其中VEGF通過(guò)受體VEGFR-2特異性細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，遷移，生存和增加通透性；EGF和bFGF是最重要的促有絲分裂原，可促進(jìn)干細(xì)胞增值；TGF-a和TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化；TNF- α可刺激干細(xì)胞分泌VEGF、FGF2和IGF-2等；H)GF-AB是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的分裂、增殖等；LIF可抑制干細(xì)胞分化；IGF-1, SCF、IL-2、EP0等分別具有不同的刺激干細(xì)胞增值和抑制分化功能。本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，不含動(dòng)物血清，所有成分均來(lái)自人(如白蛋白、細(xì)胞因子 等等)，排除了動(dòng)物血清內(nèi)潛在動(dòng)物源性內(nèi)毒素或病毒，安全性高，方便應(yīng)用于臨床。


圖1是采用三種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖；圖2是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞集落(P0-40X)；圖3是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(P3-100X)；圖4是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P0-40X)；圖5是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P3-200X)；圖6是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(P0-40X)；圖7是應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(P3-40X)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)所用器具儀器試劑皆可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1本發(fā)明提供的一種臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，組成成分及濃度如表I，將下列各組分按其各自特性用進(jìn)行溶解，混合，HEPES定容，0.22 μ m過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，4度保存。表I本發(fā)明的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基組成成分及濃度
權(quán)利要求
1.一種臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有以下組分，各組分終濃度分別為:人血清白蛋白I 2g/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10mg/L、纖粘連蛋白 2 8mg/L、層粘連蛋白 I 4mg/L、Fe (NO3) 3.9H2050g/L、FeSO4.7H20417g/L、雌二醇I 3 μ g/L、睪酮2 5 μ g/L、孕酮I 3 μ g/L、地塞米松39.25 117.74 μ g/L、胰島素 5 10mg/L、核黃素 376.36mg/L、輔酶 A80.96 242.87mg/L、丁二胺 4.41 6.17mg/L、牛橫酸I 2mg/L、氛基乙醇0.61 1.85mg/L、丙麗酸8.81 26.42mg/L、砸酸納3.78 7.56 μ g/L、L-谷氨酰胺292.3 584.6mg/L、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2 8 μ g/L、表皮生長(zhǎng)因子4 10 μ g/L、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4 10 μ g/L、白血病抑制因子I 5 μ g/L、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1l 5 μ g/L、干細(xì)胞因子2 8 μ g/L組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為0.5 2.5 μ g/L的血小板源性生長(zhǎng)因子AB。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為I 4 μ g/L的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α，和/或終濃度為I 4 μ g/L轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為0.5 2.5 μ g/L的腫瘤壞死因子α。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為0.5 2.5 μ g/L的白細(xì)胞介素2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為35.74 71.48ng/L的甲狀旁腺激素?！?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為0.36 1.09mg/L的氫化可的松。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為10 30mg/L的非必需氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，其特征在于:還包括終濃度為I 2mg/L的大豆胰酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有以下組分，各組分終濃度為人血清白蛋白1～2g/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5～10mg/L、纖粘連蛋白2～8mg/L、層粘連蛋白1～4mg/L、Fe(NO3)3·9H2O50g/L、FeSO4·7H2O417g/L、雌二醇1～3μg/L、睪酮2～5μg/L、孕酮1～3μg/L、地塞米松39.25～117.74μg/L、胰島素5～10mg/L、核黃素376.36mg/L、輔酶A80.96～242.87mg/L、丁二胺4.41～6.17mg/L、?；撬?～2mg/L、氨基乙醇0.61～1.85mg/L、丙酮酸8.81～26.42mg/L、硒酸鈉3.78～7.56μg/L、L-谷氨酰胺292.3～584.6mg/L、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2～8μg/L、表皮生長(zhǎng)因子4～10μg/L、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4～10μg/L、白血病抑制因子1～5μg/L、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I1～5μg/L、干細(xì)胞因子2～8μg/L組成。本發(fā)明的培養(yǎng)基，不含動(dòng)物血清，排除了動(dòng)物血清內(nèi)潛在動(dòng)物源性內(nèi)毒素或病毒，方便應(yīng)用于臨床。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103243071SQ20131018022
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者孫洪喜, 張高峰, 于麗, 范友金, 陳云燕 申請(qǐng)人:陳云燕