專利名稱：利用功能核酸形成g-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種水體鉛檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種利用功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法。
背景技術(shù)：
鉛離子作為一種最常見(jiàn)的重金屬污染物，其高毒性和對(duì)環(huán)境、人類造成的危害已引起全球的廣泛關(guān)注。環(huán)境中的鉛離子具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性。進(jìn)入人體的鉛，90%儲(chǔ)存在骨骼，10%隨血液分布到全身各器官和組織，影響腦、腎、神經(jīng)系統(tǒng)和血紅細(xì)胞功能等，特別是嬰幼兒吸收鉛后，將有超過(guò)30%保留在體內(nèi)，影響嬰幼兒的生長(zhǎng)和智力發(fā)育，并損傷其認(rèn)知功能、神經(jīng)行為和學(xué)習(xí)記憶等腦功能，嚴(yán)重者造成癡呆。因此，建立高靈敏度、高選擇性的鉛離子檢測(cè)方法顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的鉛離子檢測(cè)方法有原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法和氣相色譜法，這些方法雖準(zhǔn)確可靠，但在實(shí)際應(yīng)用中需要昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備以及專業(yè)技術(shù)人員，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用及實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的需要。新型的鉛離子檢測(cè)技術(shù)有化學(xué)傳感器技術(shù)和生物傳感器技術(shù)，其中功能核酸類生物傳感器因具有選擇性好、信號(hào)轉(zhuǎn)換容易等特點(diǎn)而漸成焦點(diǎn)。用于檢測(cè)鉛的功能核酸通常包括兩類:一類是核酸酶(DNAzyme)，此類酶檢測(cè)鉛的原理是酶的底物鏈中包含一個(gè)核糖腺嘌呤(rA)，鉛離子可以特異性地從該位置將酶的底物鏈切斷，通過(guò)將底物鏈的斷裂轉(zhuǎn)化成比色、化學(xué)發(fā)光和熒光等信號(hào)達(dá)到檢測(cè)目的；另一類是富含鳥嘌呤(G)的單鏈寡核苷酸，鉛離子可以促進(jìn)此類寡核苷酸形成G-四聯(lián)體(G-quadruplex)結(jié)構(gòu)，結(jié)合G-四聯(lián)體的相關(guān)特性選擇合適的信號(hào)輸出方法，也能達(dá)到檢測(cè)鉛的目的。與核酸酶相比，寡核苷酸具有合成成本低，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，因而日益成為研究熱點(diǎn)。熒光法是一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法，已結(jié)合功能核酸(尤其是單鏈寡核苷酸)被用來(lái)檢測(cè)多種物質(zhì)，關(guān)于鉛離子的檢測(cè)也有報(bào)道，但這些方法或需要引入較多的輔助物，或涉及復(fù)雜的催化反應(yīng)。而利用功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法尚少見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN102703441A，
公開(kāi)日2012-10-03，公開(kāi)了一種發(fā)夾型核酸熒光探針，該發(fā)夾型核酸熒光探針的序列為5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。發(fā)夾型核酸熒光探針在檢測(cè)鉛離子中的用途，使用方法由配制發(fā)夾型核酸探針儲(chǔ)備液、配制發(fā)夾型核酸探針儲(chǔ)備液、配制待測(cè)樣品溶液、測(cè)定樣品步驟組成，通過(guò)檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)鉛離子的檢測(cè)。但該技術(shù)的不足之處在于，其對(duì)鉛離子的檢測(cè)是基于核酸結(jié)構(gòu)從發(fā)夾型到G-四聯(lián)體構(gòu)型的轉(zhuǎn)變，而該核酸的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)是靠序列兩端的5個(gè)互補(bǔ)堿基形成堿基配對(duì)來(lái)維持。在室溫條件下堿基形成配對(duì)難以確保并且需要較長(zhǎng)的等待時(shí)間(15min)，這些會(huì)影響探針的穩(wěn)定性及快捷性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種利用功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法，克服了現(xiàn)有功能核酸檢測(cè)鉛離子需要引入眾多輔助物、涉及復(fù)雜的催化反應(yīng)等缺陷，采用簡(jiǎn)單操作實(shí)現(xiàn)最低檢測(cè)限為0.77ppb、低成本且高效的水體鉛離子檢測(cè)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明通過(guò)使用羧基熒光素(FAM)標(biāo)記功能核酸，構(gòu)建鉛離子檢測(cè)體系，當(dāng)檢測(cè)體系中加入鉛離子后，鉛離子促進(jìn)功能核酸形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，引起整個(gè)體系的熒光信號(hào)在520nm左右發(fā)生顯著變化，且熒光信號(hào)變化與鉛離子濃度呈現(xiàn)正向關(guān)系，然后采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描得到熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)試時(shí)將待測(cè)水樣與超純水，即對(duì)照樣分別和羧基熒光素標(biāo)記功能核酸母液混合后，測(cè)量?jī)蓚€(gè)混合產(chǎn)物在480nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出淬滅率，對(duì)照熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)水樣中的鉛離子濃度。所述的羧基熒光素標(biāo)記功能核酸是指:序列如Seq ID N0.1所示，即:5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’ 的核酸，且 5’ 端經(jīng) FAM 修飾。所述的石英突光用比色皿為:內(nèi)徑為0.5cmX0.5cm,外徑為1.0cmX 1.0cm。所述的熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描得到480nm處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出淬滅率，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照體系溶液的熒光淬滅率作為縱坐標(biāo)，混合液中鉛離子的濃度作為橫坐標(biāo)得到的回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述的掃描進(jìn)一步優(yōu)選為采用石英熒光用比色皿盛放檢測(cè)體系，激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm條件下掃描。所述的檢測(cè)體系通過(guò)以下步驟制備得到:I)在2mL刻度離心管中，加入2.5 μ L濃度為5 μ M的羧基熒光素標(biāo)記功能核酸母液，補(bǔ)加去離子水至450 μ L，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下備用。2)取16支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液的離心管，分別加入50 μ L不同濃度鉛離子標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的鉛離子含量維持在0.5 -200ppb，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下孵育5min ；3)另取I支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液離心管，力口入50 μ L超純水，按步驟2)方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液；4)分別取500μ L步驟2)和步驟3)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光用比色皿中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，獲得鉛離子和空白對(duì)照液的熒光光譜信號(hào)分別為F和Ftl,計(jì)算熒光淬滅率Q= [Ftl-F]/Ftl，并以不同濃度鉛(Cpb)與對(duì)應(yīng)的熒光淬滅率Q作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述的掃描的具體條件為:激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm條件下掃描，獲得其熒光信號(hào)光譜。本發(fā)明的原理是:當(dāng)檢測(cè)體系中只有功能核酸時(shí)，體系在520nm左右的熒光信號(hào)很強(qiáng)，當(dāng)檢測(cè)體系中加入鉛離子時(shí)，功能核酸會(huì)與鉛離子作用，形成G-四聯(lián)體，引起整個(gè)體系的熒光信號(hào)在520nm處發(fā)生顯著變化，且熒光信號(hào)變化與鉛濃度呈現(xiàn)正向關(guān)系，所以通過(guò)分析熒光信號(hào)變化，就可以實(shí)現(xiàn)水體中鉛離子檢測(cè)。
技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對(duì)鉛的檢測(cè)不再依賴核酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，去掉了核酸序列兩端的互補(bǔ)堿基，縮短了序列長(zhǎng)度，這在一定程度上會(huì)增強(qiáng)檢測(cè)的穩(wěn)定性并減少核酸合成成本。同時(shí)在本發(fā)明中，鉛離子與核酸接觸，可快速引起熒光淬滅效果，反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)5min，保證了檢測(cè)的快捷性。并且本發(fā)明提供的檢測(cè)方法不需要大型儀器設(shè)備，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，操作簡(jiǎn)單，可用于檢測(cè)飲用水中的鉛離子含量是否超標(biāo)。


圖1為功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子示意圖。圖2為不同濃度鉛離子加入功能核酸形成的檢測(cè)體系后的熒光信號(hào)。圖3為熒光淬滅率與不同濃度鉛離子的關(guān)系。圖4為不同金屬離子加入功能核酸形成的檢測(cè)體系后的熒光淬滅率。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例包括以下步驟:I)制備由功能核酸形成的檢測(cè)體系:在2mL刻度離心管中，分別加入2.5 μ L濃度為5 μ M功能核酸(序列為5’ -GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)母液，補(bǔ)加去離子水至450 μ L，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下備用。2)制備已知鉛離子濃度的檢測(cè)體系:取16支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液的離心管，`分別加入50 μ L不同濃度鉛離子標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的鉛含量維持在0.5 - 200ppb，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下孵育5min，留作以下測(cè)定用。3)另取I支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液離心管，力口入50 μ L超純水，按步驟2)方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液。4)分別取500 μ L步驟2)和步驟3)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光用比色皿(內(nèi)徑為0.5cmX0.5cm,外徑為1.0cmX 1.0cm)中，用突光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)。具體的掃描條件為:激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm條件下掃描，獲得其熒光信號(hào)光譜。鉛離子和空白對(duì)照液的熒光光譜信號(hào)分別為F和Ftl，計(jì)算熒光淬滅率Q= [Ftl-F]/F。。5)以不同濃度鉛(Cpb)與對(duì)應(yīng)的熒光淬滅率Q作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Q=2.23CPb+16.05。6)制備樣品檢測(cè)體系:取50 μ L待測(cè)水樣，加入到按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液離心管中，充分混勻后再將離心管置于25。C條件下孵育5min，按步驟4)方法測(cè)定其Q。7)根據(jù)樣品測(cè)得的Q，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中鉛離子含量。8)驗(yàn)證:用本發(fā)明方法測(cè)定3份含鉛離子濃度分別為15ppb、50ppb和IOOppb的多離子混合液各一份，得到的回收率為95.3%-110.8%，證明了本方法的可靠性。
9)本方法測(cè)定水體鉛離子的濃度范圍為0.5 - 200ppb，最低檢測(cè)限為0.77ppb。
權(quán)利要求
1.一種利用功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法，其特征在于，通過(guò)使用羧基熒光素標(biāo)記功能核酸，構(gòu)建鉛離子檢測(cè)體系，當(dāng)檢測(cè)體系中加入鉛離子后，鉛離子促進(jìn)功能核酸形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，然后采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描得到熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)試時(shí)將待測(cè)水樣與超純水，即對(duì)照樣分別和羧基熒光素標(biāo)記功能核酸母液混合后，對(duì)兩個(gè)混合產(chǎn)物在480nm波長(zhǎng)處的熒光淬滅率對(duì)照熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)水樣中的鉛離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描得到480nm處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出熒光淬滅率，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照體系溶液的熒光淬滅率作為縱坐標(biāo)，混合液中的鉛離子濃度作為橫坐標(biāo)得到的回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的掃描采用石英熒光用比色皿盛放檢測(cè)體系，激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm條件下掃描。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的檢測(cè)體系通過(guò)以下步驟制備得到: 1)在2mL刻度離心管中，加入2.5 μ L濃度為5 μ M的羧基熒光素標(biāo)記功能核酸母液，補(bǔ)加去離子水至450 μ L，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下備用； 2)取16支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液的離心管，分別加入50 μ L不同濃度鉛離子標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的鉛離子含量維持在0.5 -200ppb，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下孵育5min ； 3)另取I支包含按步驟I)方法制備的由功能核酸形成檢測(cè)體系混合液離心管，加入50 μ L超純水，按步驟2)方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液； 4)分別取500yL步驟2)和步驟3)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光用比色皿中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，獲得鉛離子和空白對(duì)照液的熒光光譜信號(hào)分別為F和Ftl,計(jì)算熒光淬滅率Q= [Ftl-F]/Ftl，并以不同濃度鉛Cpb與對(duì)應(yīng)的熒光淬滅率Q作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的功能核酸的序列如SeqID N0.1所示，SP: 5，-GGGTGGGTGGGTGGGT-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的掃描的具體條件為:激發(fā)光狹縫為IOnm,發(fā)射光狹縫為IOnm,激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm條件下掃描,獲得其突光信號(hào)光譜。
7.根據(jù)權(quán)利 要求1或2或4所述的方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Q=2.23CPb+16.05，其中:Q為熒光淬滅率，Cpb為鉛濃度。
全文摘要
一種水質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的利用功能核酸形成G-四聯(lián)體淬滅熒光檢測(cè)鉛離子的方法，通過(guò)使用羧基熒光素標(biāo)記功能核酸，構(gòu)建鉛離子檢測(cè)體系，當(dāng)檢測(cè)體系中加入鉛離子后，鉛離子促進(jìn)功能核酸形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，引起整個(gè)體系的熒光信號(hào)在520nm左右發(fā)生顯著變化，且熒光信號(hào)變化與鉛離子濃度呈現(xiàn)正向關(guān)系，然后采用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描得到熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)試時(shí)將待測(cè)水樣與超純水，即對(duì)照樣分別和功能核酸母液混合后，對(duì)兩個(gè)混合產(chǎn)物在480nm波長(zhǎng)處的熒光淬滅率對(duì)照熒光淬滅率標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)水樣中的鉛離子濃度。本發(fā)明克服了現(xiàn)有功能核酸檢測(cè)鉛離子需要引入眾多輔助物、涉及復(fù)雜的催化反應(yīng)等缺陷，采用簡(jiǎn)單操作實(shí)現(xiàn)最低檢測(cè)限為0.77ppb、低成本且高效的水體鉛離子檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103245652SQ201310180780
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者周培, 詹深山, 吳遠(yuǎn)根, 邢海波, 賀蘭, 詹學(xué)佳, 劉樂(lè), 羅艷芳 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)