具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于熒光染料技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備與應(yīng)用。所述熒光染料具有式(1)所示的結(jié)構(gòu)通式。所述制備方法為：將100份木質(zhì)素或木質(zhì)素磺酸鹽溶于水或有機(jī)溶劑和水的混合溶液中，加入堿調(diào)節(jié)PH值為9～14，加入氯代環(huán)氧烷1～20份，在25～50℃的條件下反應(yīng)0.5～24h，反應(yīng)完后添加堿保持pH為9～14，加入羅丹明胺基衍生物1～25份的有機(jī)溶劑溶液，升溫至60～80℃反應(yīng)0.5～24h，反應(yīng)完后磺化，然后經(jīng)透析膜或陰陽離子樹脂提純得到產(chǎn)物。本發(fā)明產(chǎn)物具有AIE活性，可用于體外細(xì)胞染色，對癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。
【專利說明】
具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于熒光染料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基 熒光染料的制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多有機(jī)發(fā)光材料在稀溶液狀態(tài)下具有較強(qiáng)的熒光，但隨著濃度的增大或固態(tài) 下，分子間發(fā)生聚集，導(dǎo)致熒光減弱，甚至完全淬滅，這在很大程度上限制了這些材料的應(yīng) 用范圍。對此，研究人員通過各種方法來限制熒光團(tuán)的聚集，減少熒光淬滅。2001年唐本忠 等發(fā)現(xiàn)四苯乙烯等分子在溶液中不發(fā)光或發(fā)光很微弱，但在溶液或固態(tài)中形成聚集體后發(fā) 光急劇增強(qiáng)，唐等將這種現(xiàn)象稱為"聚集誘導(dǎo)發(fā)光"（AIE)。這些具有AIE特性的有機(jī)發(fā)光材 料在光學(xué)傳感和生物標(biāo)記等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 羅丹明是一種具有淬滅效應(yīng)的熒光分子，為了抑制其淬滅效應(yīng)，我們設(shè)計了具有 pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料，將傳統(tǒng)的聚集熒光淬滅的羅丹明分子轉(zhuǎn)化成具有 AIE活性的分子;木質(zhì)素提供了優(yōu)異的水溶性和良好的生物相容性；同時利用木質(zhì)素自身和 羅丹明的發(fā)光特性，實(shí)現(xiàn)對PH值比率型熒光檢測。
[0004] 該發(fā)明的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在弱酸性即可發(fā)生變色和 產(chǎn)生熒光，可有效對細(xì)胞進(jìn)行體外著色，且具有良好的生物相容性。由于癌細(xì)胞整體pH偏 低，該發(fā)明的具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料通過熒光成像的方式對癌細(xì)胞和 正常細(xì)胞有較好的分辨，并且對正常細(xì)胞抑制作用弱，對癌細(xì)胞有較強(qiáng)殺滅作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光 染料。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染 料的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料，所述熒光染料具有式（1)所示 的結(jié)構(gòu)通式：
[0010]
[0011] 其中：Lignin代表木質(zhì)素分子，X為0、c或者NH，m為2~5的整數(shù)，n2為1~2的整數(shù)， Π 3為0~4的整數(shù)。
[0012] 上述具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，包括以下制備步 驟：以重量份數(shù)計，將100份木質(zhì)素或木質(zhì)素磺酸鹽溶于水或有機(jī)溶劑和水的混合溶液中， 加入堿調(diào)節(jié)PH值為9~14,加入氯代環(huán)氧烷1~20份，在25~50 °C的條件下反應(yīng)0.5~24小 時，反應(yīng)完后添加堿保持pH為9~14,加入羅丹明胺基衍生物1~25份的有機(jī)溶劑溶液，升溫 至60~80°C反應(yīng)0.5~24小時，反應(yīng)完后，對反應(yīng)體系進(jìn)行磺化，然后經(jīng)過1000分子量透析 膜提純或陰陽離子樹脂提純后得到具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。
[0013] 所述的羅丹明胺基衍生物的制備方法如下:將羅丹明和多乙烯亞胺或多醚二胺或 烷基二胺溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60°c~70°C溫度下反應(yīng)0.5h~48h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分 離純化，得到羅丹明胺基衍生物。
[0014] 所述的有機(jī)溶劑包括二甲基亞砜、丙酮、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙醇和甲醇中 的一種或多種。
[0015] 所述的氯代環(huán)氧烷優(yōu)選環(huán)氧氯丙烷或環(huán)氧氯丁烷。
[0016] 所述的堿包括碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種或多種。
[0017] 所述的木質(zhì)素或木質(zhì)素磺酸鹽為堿木質(zhì)素、酶解木質(zhì)素、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺 酸鈣和木質(zhì)素磺酸鎂中的一種或多種。
[0018] 所述磺化的方法包括亞硫酸鹽磺化、磺酸內(nèi)酯磺化或接枝磺化。
[0019] 所述的羅丹明胺基衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0020]
[0021] 其中X為0、C或者NH，n3為0~4的整數(shù)。
[0022] 上述反應(yīng)如下式所示： Γηη?^ι
[0024] 上述具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在體外細(xì)胞染色中的應(yīng)用。所述 的木質(zhì)素基熒光染料采用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行體外細(xì)胞染色時，其濃度為〇.〇1~Img/ mL〇
[0025] 上述具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在殺滅癌細(xì)胞試劑的制備具有 潛在應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0027] (1)本發(fā)明設(shè)計了具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料，木質(zhì)素磺酸提供 了優(yōu)異的水溶性，良好的生物相容性；同時利用了木質(zhì)素自身和羅丹明的發(fā)光特性，實(shí)現(xiàn)了 對pH值比率型熒光檢測；
[0028] (2)將傳統(tǒng)的聚集熒光淬滅的羅丹明分子轉(zhuǎn)化成具有AIE活性的分子。本發(fā)明的具 有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在弱酸性即可發(fā)生變色和產(chǎn)生熒光，可有效對細(xì) 胞進(jìn)行體外著色，且具有良好的細(xì)胞通透性。由于癌細(xì)胞整體PH偏低，該發(fā)明的聚合物可以 對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞有較好的分辨。
[0029] (3)本發(fā)明的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在相同條件下，對正常 肝細(xì)胞沒有毒性，對肝癌細(xì)胞的抑制率很強(qiáng)，達(dá)到70%左右，本發(fā)明在殺滅癌細(xì)胞領(lǐng)域也有 一定應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030]圖1為實(shí)施例1所得產(chǎn)物的1H-NMR圖；
[0031]圖2為實(shí)施例1所得產(chǎn)物的FT-IR圖；
[0032]圖3為實(shí)施例2所得產(chǎn)物的1H-NMR圖；
[0033]圖4為實(shí)施例2所得產(chǎn)物在水和乙醇體系的聚集熒光增強(qiáng)圖（激發(fā)波長:500nm);
[0034] 圖5為加入含有實(shí)施例2所得具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的培養(yǎng) 液進(jìn)行染色后，正常肝細(xì)胞(HL-7702，左)和肝癌細(xì)胞(SMMC-7721，右）的染色對比圖；
[0035] 圖6為本發(fā)明所得具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的細(xì)胞毒性測試結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0037] 實(shí)施例1
[0038]將羅丹明Ig和二乙烯三胺4.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60°C溫度下反應(yīng) 8h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物1.3g。取IOg堿木質(zhì)素溶于40mL的水中，加 入2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入0.5g環(huán)氧氯丙烷，在常壓、50 °C加熱條件下反應(yīng)8h;之 后，加入0.5g NaOH保持反應(yīng)體系pH為12，滴加合成的羅丹明胺基衍生物(0.2g)的四氫呋喃 溶液，并在80°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后 向反應(yīng)后的混合液中加入1，4-丁基磺酸內(nèi)酯Ig和NaOH 2g，70 °C加熱反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻 至室溫，然后經(jīng)過1000分子量透析膜提純后，冷凍干燥，得到具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì) 素基熒光染料。
[0039] 實(shí)驗采用儀器Auto systemxL/1-Series/Spectrum 2000紅外光譜儀，用溴化鉀壓 片法對本實(shí)施例所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外表征，結(jié)果如圖1所示。
[0040] 以DMS0_d6為溶劑，米用儀器核磁共振儀（Bruker DRX_400spectrometer(Bruker Co. Ett I ingen，Germany))對本實(shí)施例產(chǎn)物進(jìn)行1H-NMR測試，結(jié)果如圖2所示。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042]將羅丹明Ig和二乙烯三胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng) l〇h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物1.2g。取IOg堿木質(zhì)素溶于40mL的水中， 加入4g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入1.5g環(huán)氧氯丙烷，在常壓、50 °C加熱條件下反應(yīng)8h; 之后，加入Ig NaOH保持反應(yīng)體系pH為12，滴加合成的羅丹明胺基衍生物（lg)的四氫呋喃溶 液，并在80°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后向 反應(yīng)后的混合液中加入1，4-丁基磺酸內(nèi)酯2g和NaOH 4g，70°C加熱反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至 室溫，經(jīng)陰陽離子樹脂提純，冷凍干燥，得到具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。 本實(shí)施例所得產(chǎn)物的 1H-NMR圖如圖3所示。
[0043] 實(shí)施例3
[0044]將羅丹明Ig和四乙烯五胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng) l〇h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物1.4g。取IOg堿木質(zhì)素溶于40mL的水和乙 醇的混合溶劑中（水：乙醇=1:9)，加入4g Κ0Η，調(diào)節(jié)pH至12,同時滴加入2g環(huán)氧氯丁燒，在 常壓、50°C加熱條件下反應(yīng)8h;之后，加入Ig KOH保持反應(yīng)體系pH為13,滴加合成的羅丹明 胺基衍生物（2g)的四氫呋喃溶液，并在80°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去 未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后向反應(yīng)后的混合液中加入1，3_丙基磺酸內(nèi)酯Ig和KOH 2g，70 °(：加熱反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)過1000分子量透析膜提純，冷凍干燥，得到具有pH 響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。本實(shí)施例所得產(chǎn)物的FT-IR圖和1H-WR(DMS〇-d6)譜 圖與實(shí)施例1基本相同，不一一提供。
[0045] 實(shí)施例4
[0046]將羅丹明Ig和戊二胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng)10h，反 應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物1.4g。取IOg堿木質(zhì)素溶于30mL的水和甲醇的混 合溶劑中（水：甲醇=1:9)，加入2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入1.5g環(huán)氧氯丁烷，在常 壓、50°C加熱條件下反應(yīng)8h;之后，加入2g NaOH保持反應(yīng)體系pH為14，滴加羅丹明胺基衍生 物(〇.6g)的四氫呋喃溶液，并在60°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng) 的羅丹明衍生物，最后向反應(yīng)后的混合液中加入亞硫酸鈉2g和KOH 2g，70加熱反應(yīng)2h，反應(yīng) 結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)過1000分子量透析膜提純，冷凍干燥，得到具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木 質(zhì)素基熒光染料。
[0047] 實(shí)施例5
[0048] 將羅丹明Ig和四乙二醇醚二胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反 應(yīng)l〇h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物1.4g。取IOg木質(zhì)素磺酸鈉溶于50mL的 水中，加入2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入0.5g環(huán)氧氯丙烷，在常壓、40 °C加熱條件下反 應(yīng)8h;之后，加入Ig NaOH保持反應(yīng)體系pH為14，滴加合成的羅丹明胺基衍生物(0.5g)的四 氫呋喃溶液，并在65°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生 物，最后向反應(yīng)后的混合液中加入Ig甲醛和KOH 2g，70 °C加熱反應(yīng)2h后，加入亞硫酸鈉2g， 95°C度繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)陰陽離子樹脂提純，冷凍干燥，得到具有pH響 應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。
[0049] 實(shí)施例6
[0050] 將羅丹明Ig和乙二胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng)10h，反 應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物l.lg。取IOg磺甲基化木質(zhì)素溶于50mL的水和四 氫呋喃的混合溶劑中（水：四氫呋喃=5:5 )，加入2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入1.0 g環(huán) 氧氯丙烷，在常壓、40 °C加熱條件下反應(yīng)8h;之后，加入0.9g NaOH保持反應(yīng)體系pH為12，滴 加合成的羅丹明胺基衍生物（Ig)的四氫呋喃溶液，并在65 °C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙 酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后向反應(yīng)后的混合液中加入3-溴-丙基磺酸鈉 Ig和KOH 2g，70°C加熱反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)過1000分子量透析膜提純，冷凍干 燥，得到具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。
[0051 ] 實(shí)施例7
[0052]將羅丹明Ig和乙二胺2.5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng)10h，反 應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物l.lg。取IOg木質(zhì)素磺酸鈣溶于50mL的水和乙醇 的混合溶劑中（水：乙醇= 3:7)，加入2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至14,同時滴加入I .Og環(huán)氧氯丙烷，在 常壓、45 °C加熱條件下反應(yīng)8h;之后，加入保持NaOH反應(yīng)體系pH為13，滴加合成的羅丹明胺 基衍生物(〇.7g)的四氫呋喃溶液，并在80°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去 未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后向反應(yīng)后的混合液中加入5-溴-戊基磺酸鈉 Ig和KOH 2g，70°C 加熱反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)陰陽離子樹脂提純，冷凍干燥，得到具有pH響應(yīng)的羅 丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。
[0053] 實(shí)施例8
[0054]將羅丹明2g和二乙烯三胺5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng)10h， 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物2.7g。取IOg堿木質(zhì)素溶于30mL的水中，加入 2g NaOH，調(diào)節(jié)pH至12，同時滴加入0.5g環(huán)氧氯丙烷，在常壓、50 °C加熱條件下反應(yīng)8h;之后， 加入保持NaOH反應(yīng)體系pH為12，滴加合成的羅丹明胺基衍生物(0.2g)的四氫呋喃溶液，并 在60°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生物，最后向反應(yīng) 后的混合液中加入0.3g 1，4-丁磺酸內(nèi)酯，和NaOH 0.5g，65°C加熱反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至 室溫，經(jīng)陰陽離子樹脂提純，冷凍干燥，得到具有PH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。 [0055] 實(shí)施例9
[0056]將羅丹明2g和二乙烯三胺5mL溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C溫度下反應(yīng)10h， 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到羅丹明胺基衍生物2.7g。取IOg木質(zhì)素磺酸鈉溶于50mL的水中， 加入2.3g NaOH，調(diào)節(jié)pH至13，同時滴加入1.5g環(huán)氧氯丙烷，在常壓、50 °C加熱條件下反應(yīng) 8h;之后，加入Ig NaOH保持反應(yīng)體系pH為14，滴加合成的羅丹明胺基衍生物（2.5g)的四氫 呋喃溶液，并在65°C加熱條件下反應(yīng)8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反應(yīng)的羅丹明衍生物， 最后向反應(yīng)后的混合液中加入Ig甲醛和KOH 2g，70°C加熱反應(yīng)2h后，加入亞硫酸鈉2g，95°C 度繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，經(jīng)陰陽離子樹脂提純，冷凍干燥，得到具有pH響應(yīng)的 羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料。
[0057]本發(fā)明所得具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的性能測試：
[0058] (1)聚集熒光增強(qiáng)性質(zhì)：
[0059] 將實(shí)施例2所得木質(zhì)素基熒光染料溶解在蒸餾水中，加入不同比例在不良溶劑乙 醇，溶液的熒光強(qiáng)度隨乙醇濃度的變化如圖4所示。隨著非良溶劑乙醇含量的增加，分子間 發(fā)生聚集，在乙醇體積達(dá)到70%之前，表現(xiàn)為聚集熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。
[0060] (2)體外細(xì)胞染色測試
[00611 取復(fù)蘇好的正常肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞SMMC-7721(商業(yè)購買），加入含有實(shí)施 例2所得具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的培養(yǎng)液(熒光染料的濃度為0.25mg/ mL)，放入CO2培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件5%CO2、飽和濕度、37°C)培養(yǎng)8小時，消化細(xì)胞后吹打散細(xì)胞， 計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5個/ml，分到96孔板，每孔IOOul，即每孔細(xì)胞為I X IO4個。需待 細(xì)胞貼壁后，再收集各時間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行檢測。
[0062]做細(xì)胞成像實(shí)驗時，用PBS洗去培養(yǎng)液的細(xì)胞4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3次， 每次5分鐘（可以放4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?.2%Triton X-100處理5分鐘，PBS洗3次，每次5分 鐘，DAPI室溫濕盒避光孵育5分鐘，PBS洗一次，5分鐘，水洗兩次，每次5分鐘，熒光抗淬滅劑 封片，鏡檢，拍照。結(jié)果如圖5所示?？梢钥吹剑谡８渭?xì)胞中，由于細(xì)胞pH值偏弱堿性，幾 乎沒有紅色熒光產(chǎn)生。但在肝癌細(xì)胞中，由于細(xì)胞pH值為弱酸性，有紅色熒光產(chǎn)生。
[0063] (3)細(xì)胞毒性測試：
[0064] 加入celITiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑（Promega，Cat ·No ·G3582)，比例為 1/10。即IOOul含有實(shí)施例2所得熒光染料的培養(yǎng)液加入IOul檢測液。在孵育4小時后，酶標(biāo) 儀讀板，MTT檢測讀取0D490數(shù)據(jù)，并與空白組(未添加熒光染料)對照，結(jié)果如圖6所示。與空 白組對照，實(shí)施例2對正常肝細(xì)胞沒有毒性，但對肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。
[0065]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料，其特征在于所述熒光染料具有式 (1)所示的結(jié)構(gòu)通式：其中：Lignin代表木質(zhì)素分子，X為0、C或者NH，m為2~5的整數(shù)，112為1~2的整數(shù)，μ為0 ~4的整數(shù)。2. 權(quán)利要求1所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其特征 在于包括以下制備步驟:以重量份數(shù)計，將100份木質(zhì)素或木質(zhì)素磺酸鹽溶于水或有機(jī)溶劑 和水的混合溶液中，加入堿調(diào)節(jié)PH值為9~14，加入氯代環(huán)氧烷1~20份，在25~50°C的條件 下反應(yīng)0.5~24小時，反應(yīng)完后添加堿保持pH為9~14,加入羅丹明胺基衍生物1~25份的有 機(jī)溶劑溶液，升溫至60~80°C反應(yīng)0.5~24小時，反應(yīng)完后，對反應(yīng)體系進(jìn)行磺化，然后經(jīng)過 1〇〇〇分子量透析膜提純或陰陽離子樹脂提純后得到具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒 光染料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其 特征在于所述的羅丹明胺基衍生物的制備方法如下:將羅丹明和多乙烯亞胺或多醚二胺或 烷基二胺溶于無水甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60°C~70°C溫度下反應(yīng)0.5h~48h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分 離純化，得到羅丹明胺基衍生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其 特征在于:所述的有機(jī)溶劑包括二甲基亞砜、丙酮、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙醇和甲醇中 的一種或多種;所述的堿包括碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種或多種。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其 特征在于所述的氯代環(huán)氧烷是指環(huán)氧氯丙烷或環(huán)氧氯丁烷。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其 特征在于所述的木質(zhì)素或木質(zhì)素磺酸鹽為堿木質(zhì)素、酶解木質(zhì)素、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺 酸鈣和木質(zhì)素磺酸鎂中的一種或多種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法，其 特征在于:所述磺化的方法包括亞硫酸鹽磺化、磺酸內(nèi)酯磺化或接枝磺化。8. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料的制備方法， 其特征在于:所述的羅丹明烷基二胺衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式：式中X為0、C或者NH，n3為0~4的整數(shù)。9. 權(quán)利要求1所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在體外細(xì)胞染色中的 應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1所述的具有pH響應(yīng)的羅丹明接枝木質(zhì)素基熒光染料在制備殺滅癌細(xì)胞 試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK105860583SQ201610232246
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】邱學(xué)青, 李 遠(yuǎn), 薛雨源
【申請人】華南理工大學(xué)