抗病毒轉(zhuǎn)基因蠶的制作方法
【專利摘要】本文提供抗病毒轉(zhuǎn)基因蠶及其生產(chǎn)方法。本文所公開的轉(zhuǎn)基因蠶顯示至少兩種病毒基因的雙鏈RNA的同步組成型表達(dá)。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因蠶通過RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的桿狀病毒的病毒基因的抑制來生產(chǎn)。
【專利說明】抗病毒轉(zhuǎn)基因蠶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用RNA干擾(RNAi)來抑制轉(zhuǎn)基因昆蟲,家蠶(Bombyx mori L.)中的桿狀病毒感染(baculoviral infection)。通過基于PiggyBac轉(zhuǎn)座子的載體,我們獲得了18株組成型生產(chǎn)針對四種必需病毒基因，即立早基因(immediate early)-1 (ie_l)、遲效因子基因(late effector factors) (lefl和3)和p74的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶純合子系。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶(Bombyx mori L)為具有顯著經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要鱗翅目(Iepidopteran)昆蟲，其也被認(rèn)為是用于基因組分析的理想鱗翅目模型體系(Nagaraju J和Goldsmith MR(2002)Silkworm genomics-progress and prospects.Current Science83:415-425 ；NagarajuJ、Klimenko V 和 Couble P (2000)The silkworm Bombyx mori, a model genetic system.1n Encyclopedia of Genetics, ed.Reeves E.(Fitzroy Dearborn，London)，pp.219-239)。除了其用作經(jīng)濟(jì)昆蟲和遺傳工具以外，通過使用基于PiggyBac轉(zhuǎn)座子的載體的成功的種系轉(zhuǎn)基因而增加了香的工業(yè)應(yīng)用(Tamura T，Thibert C，Royer C，Kanda T，AbrahamE，Kamba M，Komoto N，Thomas JLj Mauchamp B,Chavancy Gj Shirk P，F(xiàn)raser Mj PrudhommeJC，Couble P，Toshiki T，Chantal T，Corinne R，Toshio K，Eappen A, Mari K，NatuoK，Jean-Luc T，Bernard M，Gerard C，Paul S，Malcolm Fj Jean-Claude P 和 PierreC(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori Lusing a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。這種鱗翅目昆蟲為印度成千上萬的農(nóng)民提供生計(jì)，但由于病毒-家蠶核型多角體病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus , BmNPV)所引起的嚴(yán)重桿狀病毒疾病而影響了他們的收入。將近50%的作物損失是由桿狀病毒引起的。在桿狀病毒感染周期結(jié)束時(shí)產(chǎn)生的多角體病毒體的穩(wěn)固性質(zhì)幫助病毒感染廣泛傳播，特別是在夏季和炎熱潮濕的季節(jié)。因此，對于穩(wěn)定蠶繭作物和改善絲產(chǎn)量，反過來改善蠶絲業(yè)經(jīng)濟(jì)，當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)抗BmNPV蠶株。
[0003]BmNPV為感染節(jié)肢動物(主要是昆蟲)的無脊椎動物的14個(gè)主要家族之一的桿狀病毒科(Baculoviridae)的成員(van Regenmortel MHj Fauquet CM，BishopDHL, Carstens EB，Estes MKj Lemon SM，Maniloff Jj Mayo MAj McGeoch DJj Pringle CR和Wickner RB (2000)Seventh Report of the International Committee on Taxonomy ofViruses (Academic Press, San Diego, Wien New York.;Murphy FA，F(xiàn)auquet CM, BishopDHL, Ghabrial SAj Jarvis AWj Martelli GPj Mayo MA 和 Summers MD (1995)Sixth Reportof the International Committee on Taxonomy of Virus.(Springer Verlagj Wien, NewYork)。與大多數(shù)桿狀病毒類似，BmNPV為宿主特異性并對家蠶(Bombyx mori)N(BmN)細(xì)胞具高度感染性，但并不在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21)細(xì)胞中復(fù)制(Kondo A 和 Maeda S(1991)Host range expansion by recombination of thebaculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californicanuclear polyhedrosis virus.Journal of Virology65:3625-3632)。當(dāng)蟲蜀(caterpillar)食用沉積在葉子上的為多面包涵體(PIB,也稱作病毒源包含體(occlusion derivedvirus))的耐環(huán)境病毒顆粒時(shí)，所述抗病毒顆粒進(jìn)入堿性中腸環(huán)境，釋放游離的病毒體，游離的病毒體通過受體進(jìn)入中腸細(xì)胞，此時(shí)緊接著發(fā)生桿狀病毒的生命周期。在細(xì)胞內(nèi)部，隨著早期基因如立早基因-l(ie-l)、ie-2由宿主RNA聚合酶II從早期啟動子轉(zhuǎn)錄，病毒基因開始瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄(Huh NE 和 Weaver RF (1990a) Categorizing some early andlate transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosisvirus.Journal of General Virology71:2195-2200) 0 隨后其他遲效因子(Ief)表達(dá)，同時(shí)耐鵝膏覃堿的病毒RNA聚合酶引發(fā)極晚期基因的轉(zhuǎn)錄(Huh NE和Weaver RF (1990b)Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts ofthe Autographa californica nuclear polyhedrosis virus.Journal of GeneralViiOlogy71:195-201)。最后，細(xì)胞溶解及被感染幼蟲的完全溶解使包被在多面被膜中的病毒體釋放至環(huán)境中。與PIB相反，在細(xì)胞內(nèi)部形成的無多面包覆的游離病毒(已知為芽殖病毒(Budded Virus)-BV)引發(fā)個(gè)體內(nèi)感染。幼蟲器官系統(tǒng)為桿狀病毒穿過基膜并傳播感染提供主要通道(Engelhard Ej Kam-Morgan Lj Washburn J和 Volkman L (1994) The insecttracheal system:A conduit for the systemic spread of Autographa californicamultiple nuclear polyhedrosis virus.Proceedings National Academy of SciencesUSA91:3224-3227)。
[0004]通過使用質(zhì)粒DNA復(fù)制顯示出，Ief基因如ie_l、lef-1、lef_2和lef_3對于復(fù)制是必不可少的(Lu A 和 Miller L(1995)The roles of eighteen baculoviruslate expression factor genes in transcription and DNA replication.Journal ofVirology 69:975-982)。桿狀病毒立早_1 (ie_l)基因?yàn)椴《緩?fù)制所需的5種必需基因之一(Lu A和Miller L(1995)The roles of eighteen baculovirus late expression factorgenes in transcription and DNA replication.Journal of Virology69:975-982;KoolM，Ahrens C，Goldbach R，Rohrmann G和Vlak J(1994)Identification of genes involvedin DNA replication of the Autographa californica baculovirus.ProceedingsNational Academy of Sciences USA91:11212-11216)。已提出 IE-1 活化包括 ie_2、39K 和p35 的早期基因的啟動子(Ca`rson Dj Summers M 和 Guarino L(1991)Molecular analysisof a baculovirus regulatory gene.Virology 182:279-286;Guarino LA 和 SummersMD (1986)Functional mapping of a trans-activating gene required for expressionof a baculovirus delayed-early gene.Journal of Virology57:563—571;NissenMS 和 Friesen PD(1989)Molecular analysis of the transcriptional regulatoryregion of an early baculovirus gene.Journal of Virology63:493-503)并直接或間接參與晚期基因的表達(dá)(Passarelli A 和 Miller L(1993) Three baculovirus genesinvolved in late and very late gene expression:1e-1, ie_n，and lef-2.Journalof Virology67:2149-2158) 0對DNA復(fù)制至關(guān)重要的晚期表達(dá)因子之一是lef_l，一種參與晚期和極晚期基因表達(dá)的基因(Kool Mj Ahrens C，Goldbach Rj Rohrmann G和 Vlak J(1994)Identification of genes involved in DNA replication of theAutographa californica baculovirus.Proceedings National Academy of SciencesUSA91:11212-11216) o LEF-1 為對 DNA 復(fù)制起始至關(guān)重要的 DNA 引發(fā)酶(Isobe Rj KojimaK, Matsuyama T，Quan GX，Kanda T，Tamura T，Sahara K，Asano SI 和Bando H(2004)Use ofRNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virologyl49:1931-1940)。然而，RNAi介導(dǎo)的Ief-1單獨(dú)敲除未顯示出桿狀病毒增殖的完全抑制(Isobe Rj Kojima K，Matsuyama Tj Quan GXj Kanda Tj Tamura Tj SaharaK，Asano SI和Bando H(2004)Use of RNAi technology to confer enhanced resistanceto BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virologyl49:1931-1940)。
[0005]Lef-3基因是DNA復(fù)制必須的由桿狀病毒編碼的另一必需早期類基因(Lu A和 Miller L(1995)The roles of eighteen baculovirus late expression factorgenes in transcription and DNA replication.Journal of Virology69:975-982;KoolM，Ahrens C，Goldbach R，Rohrmann G和Vlak J (1994)Identification of genes involvedin DNA replication of the Autographa californica baculovirus.ProceedingsNational Academy of Sciences USA91:11212-11216;Li Yj A L Passarelli AL 和Miller LK(1993)Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3，abaculovirus gene involved in late and very late gene expression.Journal ofVirology67:5260-5268)。LEF-3為形成同三聚體的單鏈DNA結(jié)合蛋白(Wu Y和CarstensEB (1998)A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates thenuclear localization of the putative helicase P143.Virology247: 32-40)，介導(dǎo)假定的DNA螺旋酶P143 的核定位(Wu Y和 Carstens EB (1998) A baculovirus single-strandedDNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putativehelicase P143.Virology247:32-40, Chen Z 和 Carstens EB (2005)Identificationof domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus lateexpression factor 3 required for nuclear transport of P143.Journal ofVirology79:10915-10922) o
[0006]P74為在ODV形式的病毒體中發(fā)現(xiàn)的包膜蛋白(Kuzio Jj Jaques R和FaulknerP(1989)Identification of p74，a gene essential for virulence of baculovirusocclusion bodies.Virologyl73:759-763) ；Faulkner Pj Kuzio Jj Williams GV 和 WilsonJA(1997)Analysis of P74，a PDV envelope protein of Autographa californicanucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in viv0.Journalof General Virology78:3091_310)，對于病毒毒性是至關(guān)重要的(Kuzio J，Jaques R和 Faulkner P(1989)Identification of p74，a gene essential for virulence ofbaculovirus occlusion bodies.Virologyl73:759-763)，但并不與 DNA 復(fù)制相關(guān)。其在桿狀病毒的生命周期晚期轉(zhuǎn)錄，并被認(rèn)為在口服接種期間輔助病毒體與中腸附著(Haas-Stapleton EJj Washburn JO 和 Volkman LE (2004)P74mediates specific bindingof Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derivedvirus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothisvirescens larvae.Journal of Virology78:6786-6791)。
[0007]RNA干擾(RNAi)是mRNA選擇性破壞導(dǎo)致基因敲除的現(xiàn)象(Fire A，XuS，Montgomery M，Kostas S，Driver S 和 Mello C(1998)Potent and specific geneticinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature391:806-811) oRNAi目前被認(rèn)為是傳統(tǒng)的抗病毒策略(Lindenbach B和Rice C (2002) RNAitargeting an animal virus:news from the front.Molecular Cel19:925-927;DownwardJ (2004) RNA interference.British Medical Journal 328:1245-1248)，其部分細(xì)胞機(jī)(cellular machine)還用于基因調(diào)控機(jī)制(Denli AM 和 Hannon GJ(2003) RNA1:anever-growing puzzle.Trends in Biochemical Sciences 28: 196—201;AgrawalNj Dasaradhi PVj Mohmmed A,Malhotra Pj Bhatnagar RK 和 Mukherjee SK (2003)RNA interference:biology, mechanism, and applications.Microbiology and MolecularBiology Review67:657-685)。RNAi已顯示在包括蠶B.mori的許多節(jié)肢動物物種中起作用(Riu HLj Li W-X 和 Ding S-W(2004)RNA-based immunity in insects.1nSGM symposium63:Microbe - vector interactions in vector-borne diseases,ed.S.H.Gillespie, G.L S.A.0.(Cambridge University Press)pp.63-74)，并確認(rèn)抑制草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中 AcNPV 的增殖(Valdes VJj Sampieri A, SepulvedaJ 和 Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivoviral infections by recombinant baculovirus.Journal of Biological Chemistry278:19317-19324)，而靶向RNAi的單獨(dú)的lef-1和單獨(dú)的ie_l對于有效抑制家蠶中BmNPV生長并不有效(Isobe Rj Kojima K，Matsuyama Tj Quan GXj Kanda T，Tamura Tj SaharaK，Asano SI和Bando H(2004)Use of RNAi technology to confer enhanced resistanceto BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virology 149:1931—1940;KanginakudruSj Royer C，EdupalIi SVjJalabert A，Mauchamp B，Chandrashekaraiahj PrasadSVj Chavancy G，Couble P 和 Nagaraju J (2007) Targeting ie-lgene by RNAi inducesbaculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenicsilkworms, Insect Molecular Biology 16:635-644)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于RNAi介導(dǎo)的抑制昆蟲中的桿狀病毒感染的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述shRNA包括RNA正義鏈，其中所述正義鏈包括選自由SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段；間隔子序列；和與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈。
[0009]本發(fā)明的另一方面涉及重組DNA構(gòu)建體，其包括:
[0010]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸為反義方向并產(chǎn)生dsRNA分子；或
[0011]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈及其互補(bǔ)多核苷酸；或
[0012]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈，其互補(bǔ)多核苷酸，和間隔子多核苷酸序列；或
[0013].如本發(fā)明所公開的編碼shRNA的多核苷酸
[0014]其中所述多核苷酸可操作地連接至啟動子。
[0015]本發(fā)明的另一方面還涉及抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因昆蟲的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用如本發(fā)明所公開的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化昆蟲，并選擇對桿狀病毒顯示抗性的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0016]本發(fā)明的另一方面還涉及表達(dá)如本發(fā)明所公開的短發(fā)夾RNA(ShRNA)或如本發(fā)明所公開的重組DNA構(gòu)建體的抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0017]本發(fā)明的另外的方面涉及表達(dá)如本發(fā)明所公開的短發(fā)夾RNA(ShRNA)或如本發(fā)明所公開的重組DNA構(gòu)建體的抗桿狀病毒轉(zhuǎn)基因昆蟲后代。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1 示出將基于 PiggyBac 的 RNAi 載體 pPiggy-正義-3XP3-GFP、pPiggy-反義-3XP3-DsRed2 和 pPiggy-多基因正-反(flip-flop)-3XP3_DsRed2 用于獲得轉(zhuǎn)基因蠶。左側(cè)ITR和右側(cè)ITR表示piggyBac轉(zhuǎn)座元件的左和右末端反向重復(fù)序列。各構(gòu)建體包括四種病毒基因，即 ie-1 (310bp)、Ief-1 (326bp)、lef-3 (316bp)、p74 (310bp)、標(biāo)記基因gfp (800bp)和200bp SV40多聚腺苷酸化位點(diǎn)的片段。
[0019]A)pPiggy-正義-3XP3-GFP構(gòu)建體(9677bp)，由受到遍在表達(dá)的蠶胞質(zhì)肌動蛋白(A3)啟動子支配的轉(zhuǎn)錄為正義鏈的四種病毒靶基因的片段構(gòu)成。編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因受在復(fù)眼和其它神經(jīng)組織中表達(dá)的3XP3啟動子支配，用作標(biāo)記基因來鑒定胚胎階段和蛾階段的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0020]B) pPiggy-反義-3XP3-DsRed2構(gòu)建體(10097bp),由受到遍在表達(dá)的蠶胞質(zhì)肌動蛋白(A3)啟動子支配的轉(zhuǎn)錄為反義鏈的四種病毒靶基因的片段構(gòu)成。編碼紅色熒光蛋白(DsRed2)的基因受在復(fù)眼和其它神經(jīng)組織中表達(dá)的3XP3啟動子支配，用作標(biāo)記基因來鑒定晚期胚胎階段和蛾階 段的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0021]OpPiggy-多基因正-反-3XP3_DsRed2 構(gòu)建體(12422bp)，攜帶被間隔子(323bp)分開的正義和反義方向的各桿狀病毒必需基因的部分，由遍在表達(dá)的蠶胞質(zhì)肌動蛋白(A3)啟動子驅(qū)動。編碼紅色熒光蛋白(DsRed2)的基因受在復(fù)眼和其它神經(jīng)組織中表達(dá)的3XP3啟動子支配，用作標(biāo)記基因來鑒定晚期胚胎階段和蛾階段的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0022]D)pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2構(gòu)建體，攜帶被間隔子(323bp)分開的在無gfp片段的正義和反義方向的各桿狀病毒必需基因(無gfp片段)的部分，由遍在表達(dá)的蠶胞質(zhì)肌動蛋白(A3)啟動子驅(qū)動。編碼紅色熒光蛋白(DsRed2)的基因受在復(fù)眼和其它神經(jīng)組織中表達(dá)的3XP3啟動子支配，用作標(biāo)記基因來鑒定晚期胚胎階段和蛾階段的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0023]E)pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2構(gòu)建體，攜帶被間隔子(323bp)分開的正義和反義方向的三種桿狀病毒必需基因(無P74和gfp片段)中的每一個(gè)的部分，由遍在表達(dá)的蠶胞質(zhì)肌動蛋白(A3)啟動子驅(qū)動。編碼紅色熒光蛋白(DsRed2)的基因受在復(fù)眼和其它神經(jīng)組織中表達(dá)的3XP3啟動子支配，用作標(biāo)記基因來鑒定晚期胚胎階段和蛾階段的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0024]圖2示出蠶轉(zhuǎn)基因體(transgenics)的分子特性。
[0025]A)轉(zhuǎn)座元件展示(TED)法。
[0026]B)使用TED分析表征轉(zhuǎn)基因系中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)。七種Nistari轉(zhuǎn)基因系(170A、170B、164C、164B、154C、154D 和 118A)顯示單拷貝插入。
[0027]C)介導(dǎo)piggyBac左臂的轉(zhuǎn)基因整合的piggyBac所特有的特征序列(signaturesequence) TTAA的存在。piggyBac介導(dǎo)轉(zhuǎn)位所特有的TTAA序列以紅色示出。
[0028]D)在表達(dá)桿狀病毒必需基因的dsRNA的不同轉(zhuǎn)基因系中轉(zhuǎn)基因繪制到染色體位置。
[0029]圖3示出蠶的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因Nistari (NM)系中的BmNPV抗性。用BmNPVPlO-GFP以12000PIB/幼蟲的劑量供給第四幼蟲齡期。基于蛾出現(xiàn)的數(shù)目計(jì)算死亡率。柱(bar)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。TAFib6-表達(dá)非靶標(biāo)dsRNA的轉(zhuǎn)基因系；IE-1FF-帶有單病毒基因靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因Nistari系；MFF-帶有正義和反義方向表達(dá)的四種桿狀病毒必需靶基因的轉(zhuǎn)基因系；正義(ABS)-帶有正義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒靶基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；反義(AS)-帶有反義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒靶基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；和雜交體-正義XAS-通過正義和AS系雜交獲得的轉(zhuǎn)基因系。
[0030]圖4示出BmNPV誘導(dǎo)純系或轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因(CSR2)系的雜交體的死亡率。死亡率在具有轉(zhuǎn)基因的譜系中降低。柱表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。TAFib6—表達(dá)非靶標(biāo)dsRNA的轉(zhuǎn)基因系；IE-1FF(E)-帶有單病毒基因靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因Nistari系；多基因FF(MFF)-帶有正義和反義方向表達(dá)的四種桿狀病毒必需靶基因的轉(zhuǎn)基因系；正義(ABS)-帶有正義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒靶基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；反義(AS)-帶有反義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；和雜交體-正義XAS-通過正義和AS系雜交獲得的轉(zhuǎn)基因系。
[0031]圖5示出多面包涵體(PIB)在不同轉(zhuǎn)基因蠶中的滴度。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障迪啾?，轉(zhuǎn)基因系中的多面包涵體形成數(shù)目低得多。051?2-對照051?2系，匪-對照附8丨&1^系；IE-1FF(E)-帶有單病毒基因靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因Nistari系；正義(ABS)-帶有正義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒靶基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；反義(AS)-帶有反義方向轉(zhuǎn)錄的四種病毒靶基因的片段的Nistari轉(zhuǎn)基因系；雜交體(ABSXAS)-通過正義和反義譜系雜交獲得的轉(zhuǎn)基因系；和多基因FF(MFF)-帶有正義和反義方向表達(dá)的四種桿狀病毒必需靶基因的轉(zhuǎn)基因Nistari 系。
[0032]圖6示出四種桿狀病毒基因ie-l、lef-l、lef_3和p74最初克隆至pCRII TOPO載體(Invitrogen)中。所得質(zhì)粒標(biāo)記為 Topo-1e-l、Topo-lef-l> Topo-lef-3 和 Topo_p74。通過限制性酶切和DNA測序確認(rèn)具有正確插入的這些載體，稍后用于克隆步驟。
[0033]圖1 示出構(gòu)建 pPiggy 正義-3XP3-GFP、pPiggy 反義-3XP3_DsRed2 和 pPiggy 多基因正-反-3XP3-DsRed2中所涉及的各步驟。在本文中提供逐步描述。
[0034]本發(fā)明的目的
[0035]本發(fā)明的首要目的為生產(chǎn)顯示耐病毒感染性改善的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0036]本發(fā)明的一個(gè)目的為精選早期桿狀病毒增殖所必需的適當(dāng)病毒基因。
[0037]本發(fā)明的另一目的為鑒定此類病毒基因的DNA片段。
[0038]本發(fā)明的另一目的為構(gòu)建復(fù)合載體，所述復(fù)合載體攜帶在受到遍在活性啟動子支配的正義和反義方向的所鑒定的必需病毒基因的DNA片段，從而確保轉(zhuǎn)基因在所有組織中的表達(dá)。
[0039]本發(fā)明的另一目的還包括在啟動子的調(diào)控下的適當(dāng)可選擇的標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因在早期或晚期胚胎階段以及成蟲階段表達(dá)，從而使得容易篩選轉(zhuǎn)基因世代(transgenic brood)。
[0040]再者，本發(fā)明的另一目的還為評價(jià)RNAi介導(dǎo)的必需多病毒基因的同時(shí)抑制以及其對轉(zhuǎn)基因蠶中桿狀病毒增殖的影響。
[0041]本發(fā)明進(jìn)一步的目的為研究將轉(zhuǎn)基因特性轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)基因X非轉(zhuǎn)基因蠶菌株的F1代雜交后代的可行性。
【具體實(shí)施方式】[0042]定義
[0043]如本說明書中所使用的，術(shù)語"反義"是指基因或該基因來源的核苷酸序列，其與本文所定義的靶基因具有大于50%、優(yōu)選大于80%的同源性，并且以相對于靶基因的5’ -3’反方向連接至啟動子。
[0044]如本說明書中所使用的，術(shù)語〃RNAi〃 (RNA干擾)是指通過導(dǎo)入和表達(dá)與全部或部分靶基因相對應(yīng)的并產(chǎn)生雙鏈RNA的序列而使靶基因的表達(dá)抑制，導(dǎo)致靶基因特異性基因沉默(抑制)。通常，此類RNAi序列包括線性排列的部分正義和反義DNA序列，其表達(dá)形成RNA干擾。
[0045]〃多核苷酸〃為包括多個(gè)聚合的核苷酸，如至少約15個(gè)連續(xù)聚合的核苷酸的核酸分子。多核苷酸可為核酸、寡核苷酸、核苷酸或其任意片段。在許多情況下，多核苷酸包括編碼多肽(或蛋白質(zhì))或其結(jié)構(gòu)域或片段的核苷酸序列。此外，多核苷酸可包括啟動子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子區(qū)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、5’或3’非翻譯區(qū)、報(bào)告基因或可選擇標(biāo)記等。多核苷酸可為單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸可選地包括修飾堿基或修飾主體。多核苷酸可為例如基因組DNA或RNA、轉(zhuǎn)錄本(如mRNA)、cDNA、PCR產(chǎn)物、克隆DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可與糖類、脂類、蛋白質(zhì)或其他材料結(jié)合來行使特定的活性，例如轉(zhuǎn)化或形成有用的復(fù)合體如肽核酸(PNA)。多核苷酸可包括正義或反義方向的序列。"寡核苷酸"實(shí)質(zhì)上等于術(shù)語擴(kuò)增物、引物、低聚物、元件、靶標(biāo)和探針，并優(yōu)選為單鏈。
[0046]〃基因〃或〃基因序列〃是指基因的部分或完整的編碼序列、其互補(bǔ)序列(complement)及其5’或3’非翻譯區(qū)?；蜻€為遺傳的功能單位，并且在物理方面為參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA (或在RNA病毒的情況下為RNA)分子的核苷酸的特定片段或序列。后者可進(jìn)行后續(xù)加工如化學(xué)修飾或折疊以獲得功能性蛋白質(zhì)或多肽?；蚩蔀榉蛛x的、部分分離的或在生物體基因組中存在。舉例來說，轉(zhuǎn)錄因子基因編碼轉(zhuǎn)錄因子多肽，轉(zhuǎn)錄因子多肽可為功能性或需要加工以行使轉(zhuǎn)錄起始子的功能。
[0047]可操作地,基因可由順反試驗(yàn)(cis-trans test)限定,順反試驗(yàn)為確定兩個(gè)突變是否發(fā)生于同一基因中并可用于確定遺傳活性單位的界限的遺傳試驗(yàn)?；蛲ǔ０ㄔ诰幋a區(qū)之前的區(qū)域(〃頭〃；上游)和在編碼區(qū)之后的區(qū)域(〃尾〃；下游)。基因還可包括稱作"內(nèi)含子"的插入的非編碼序列，其位于稱作“外顯子”的單個(gè)編碼片段之間。大多數(shù)基因具有相關(guān)聯(lián)的啟動子區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始密碼子的5’調(diào)控序列(某些基因不具有可辨別的啟動子)。基因的功能還可受增強(qiáng)子、操縱子和其他調(diào)控元件的調(diào)節(jié)。
[0048]構(gòu)建體:除非另有說明，否則術(shù)語“構(gòu)建體”是指包括本發(fā)明的一種或多種分離的多核苷酸序列的重組遺傳分子。
[0049]用于在宿主生物體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的遺傳構(gòu)建體包括可操作地連接至開放閱讀框的基因啟動子序列以及可選地開放閱讀框3’下游的基因終止序列。取決于所期望的基因序列的用途，開放閱讀框可定位于正義或反義方向。構(gòu)建體還可包括一種或多種可選擇標(biāo)記基因以及基因表達(dá)的其它調(diào)控元件。
[0050]載體:能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或可與另外的DNA片段可操作地連接來實(shí)現(xiàn)所附片段的復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒(cosmid)、噬菌體、病毒、YAC和BAC都是典型的載體。
[0051]術(shù)語〃載體〃是指用于將多核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的核酸分子。"載體"可包括除上述遺傳構(gòu)建體以外的遺傳物質(zhì)，如允許在一種或多種宿主細(xì)胞中復(fù)制的一種或多種核酸序列，例如本領(lǐng)域已知的復(fù)制起點(diǎn)、可選擇標(biāo)記基因和其他遺傳元件(如，用于將遺傳物質(zhì)整合至宿主細(xì)胞基因組中的序列等)。
[0052]本發(fā)明提供通過同時(shí)靶向超過一種、優(yōu)選兩種、更優(yōu)選三種、最優(yōu)選四種病毒基因的RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因蠶中桿狀病毒增殖的抑制。本發(fā)明還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因蠶的生產(chǎn)方法，其中轉(zhuǎn)基因蠶顯示至少兩種病毒基因、優(yōu)選三種病毒基因、更優(yōu)選四種病毒基因的雙鏈RNA的同時(shí)表達(dá)。另外，本發(fā)明提供將病毒抗性轉(zhuǎn)移至雜交蠶后代的方法。
[0053]本發(fā)明特別提供通過同時(shí)靶向超過一種、優(yōu)選兩種、更優(yōu)選三種、最優(yōu)選四種病毒基因的RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的在轉(zhuǎn)基因蠶中的桿狀病毒增殖的抑制，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組。
[0054]本發(fā)明還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因蠶的生產(chǎn)方法，其中所述轉(zhuǎn)基因蠶顯示同時(shí)表達(dá)至少兩種病毒基因、優(yōu)選三種病毒基因、更優(yōu)選四中病毒基因的雙鏈RNA，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組。
[0055]本發(fā)明進(jìn)一步提供組成型并同時(shí)表達(dá)至少兩種病毒基因、優(yōu)選三種病毒基因、更優(yōu)選四種病毒基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶及其后代，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組。
[0056]另外，本發(fā)明提供將病毒抗性轉(zhuǎn)移至雜交蠶后代的方法。
[0057]本發(fā)明還提供具有SEQ ID NO: 11所述核苷酸序列的立早-1基因(ie_l)、具有SEQID NO: 12中所述的核苷酸序列的遲效因子基因(lef-Ι)、具有SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的lef-3基因和具有SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的p74基因的多核苷酸。
[0058]本發(fā)明進(jìn)一步提供間隔子的多核苷酸，其中所述間隔子的核苷酸為如SEQ IDNO: 15中所述。
[0059]在本研究中，我們選擇ie-1、lef-1、lef_3和p74的多個(gè)必需病毒基因片段來生產(chǎn)雙鏈RNA(dsRNA)并產(chǎn)生復(fù)合載體。我們將復(fù)合載體導(dǎo)入在轉(zhuǎn)基因蠶的所有組織中均表達(dá)dsRNA的構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因蠶。我們以如下方式制備該復(fù)合構(gòu)建體，使所選基因的dsRNA在所有組織中受遍在活性啟動子支配而表達(dá)并使標(biāo)記基因在幼蟲和成蟲的眼細(xì)胞(復(fù)眼)中表達(dá)，從而使得容易篩選轉(zhuǎn)基因個(gè)體。我們還成功地將轉(zhuǎn)基因性質(zhì)轉(zhuǎn)移至F1代雜交后代。
[0060]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因的多核苷酸和反義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1 >lef-3和p74基因的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。 [0061 ] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供包括至少兩種選自由正義和反義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0062]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供包括至少三種選自由正義和反義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0063]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因Ief-1和lef-3的多核苷酸以及反義方向的立早_1基因(ie_l)、遲效因子基因Ief-1和lef-3的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0064]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-Ι)和遲效因子基因Ief-1的多核苷酸以及反義方向的立早-1基因(ie-Ι)和遲效因子基因Ief-1的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0065]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因Ief-1和p74基因的多核苷酸以及反義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因Ief-1和p74基因的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0066]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-1)、lef-3和P74基因的多核苷酸以及反義方向的立早-1基因(ie-1)、lef-3和p74基因的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0067]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包括正義方向的立早-1基因(ie-Ι)和p74基因的多核苷酸以及反義方向 的立早-1基因(ie-Ι)和p74基因的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0068]在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因蠶的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括導(dǎo)入包括至少兩種選自由正義和反義方向的立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組的多核苷酸的重組載體，其中正義和反義方向的多核苷酸被間隔子DNA分開。
[0069]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供組成型并同時(shí)表達(dá)至少兩種病毒基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶及其后代，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因Ief-U lef-3和p74基因組成的組。
[0070]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供組成型并同時(shí)表達(dá)至少三種病毒基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶及其后代，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因Ief-U lef-3和p74基因組成的組。
[0071]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供組成型并同時(shí)表達(dá)四種病毒基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶及其后代，其中所述病毒基因選自由立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因組成的組。
[0072]本發(fā)明中所公開的轉(zhuǎn)基因蠶顯示高水平的RNA干擾介導(dǎo)的對桿狀病毒感染的抗性。
[0073]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中shRNA包括RNA正義鏈、間隔子序列和與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈，其中所述正義鏈包括兩種以上的選自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組成的組的核苷酸序列的片段。[0074]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述shRNA包括RNA正義鏈、間隔子序列和與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈，其中所述正義鏈包括兩種以上的選自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 14組成的組的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0075]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中shRNA包括RNA正義鏈、間隔子序列和與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈，其中所述正義鏈包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。 [0076]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述正義鏈包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ IDNO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段，間隔子序列以及與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈。
[0077]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述正義鏈包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ IDNO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，間隔子序列以及與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈。
[0078]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述正義鏈包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQID N0:13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，間隔子序列以及與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈。
[0079]本發(fā)明的另一實(shí)施方案另外還提供用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中的桿狀病毒感染的抑制的短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述正義鏈包括SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，間隔子序列以及與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈。
[0080]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供包括SEQ ID NO: 15中所述的間隔子序列的本發(fā)明的 shRNA。
[0081]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種重組DNA構(gòu)建體,其包括
[0082]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸為反義方向并產(chǎn)生dsRNA分子；或
[0083]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈及其互補(bǔ)多核苷酸；或
[0084]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈，其互補(bǔ)多核苷酸和間隔子多核苷酸序列；或
[0085].如本發(fā)明所公開的編碼shRNA的多核苷酸，
[0086]其中所述多核苷酸可操作地連接至啟動子。
[0087]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供如本發(fā)明所公開的重組DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子為組成型啟動子如蠶胞質(zhì)肌動蛋白(Bmactin)啟動子或組織特異性啟動子如Pax(3XP3)啟動子。
[0088]如本發(fā)明所公開的重組DNA構(gòu)建體包括兩種啟動子,一種啟動子包括遍在表達(dá)的編碼香胞質(zhì)肌動蛋白蛋白(Bmactin)的基因的組成型啟動子，和另一種為編碼Pax蛋白(3XP3)的基因的組織特異性啟動子。
[0089]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為大腸桿菌菌株一次性INVllO (Invitrogen),其為化學(xué)活性(chemically competent)菌株。
[0090]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還提供重組DNA構(gòu)建體，其包括編碼本發(fā)明的shRNA的多核苷酸，其中編碼shRNA的多核苷酸包括
[0091]a.包括選自由 SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18 和 SEQ IDN0:19 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的正義鏈，
[0092]b.間隔子序列，和
[0093]c.與所述正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。
[0094]如本發(fā)明所公開的重組DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包括報(bào)告基因。
[0095]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供包括編碼短發(fā)夾RNA(ShRNA)的多核苷酸的重組載體，其中shRNA包括RNA正義鏈，間隔子序列，和與該正義RNA鏈互補(bǔ)的反義RNA鏈，其中所述正義鏈包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸。
[0096]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供包括重組構(gòu)建體的重組載體，其中所述重組構(gòu)建體包括
[0097]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中多核苷酸為反義方向并產(chǎn)生dsRNA分子；或
[0098]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈及其互補(bǔ)多核苷酸；或
[0099]?包括選自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈，其互補(bǔ)多核苷酸，和間隔子多核苷酸序列；或
[0100].如本發(fā)明所公開的編碼shRNA的多核苷酸，
[0101]其中所述多核苷酸可操作地連接至啟動子。
[0102]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供包括編碼如本發(fā)明所公開的短發(fā)夾RNA(ShRNA)的多核苷酸或本發(fā)明的重組構(gòu)建體或本發(fā)明的重組載體的宿主細(xì)胞。
[0103]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞如蠶。
[0104]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因昆蟲的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化昆蟲，和篩選對桿狀病毒顯示抗性的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0105]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因蠶的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化蠶，和篩選對桿狀病毒顯示抗性的轉(zhuǎn)基因蠶。
[0106]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因家蠶的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化家蠶，和篩選對桿狀病毒顯示抗性的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0107]本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因家蠶的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化家蠶，和篩選對桿狀病毒顯示抗性的轉(zhuǎn)基因昆蟲，其中所述蠶為家蠶Nistari菌株。
[0108]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的短發(fā)夾RNA(ShRNA)的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0109]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因昆蟲。
[0110]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的短發(fā)夾RNA(ShRNA)的桿狀病毒抗性
轉(zhuǎn)基因香。
[0111]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)
基因香。
[0112]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的短發(fā)夾RNA(ShRNA)的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因昆蟲后代。
[0113]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因昆蟲后代。
[0114]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的短發(fā)夾RNA(ShRNA)的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因蠶后代。
[0115]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供表達(dá)本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的桿狀病毒抗性轉(zhuǎn)基因蠶后代。
`[0116]本發(fā)明具體提供通過RNAi和轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)具有高水平桿狀病毒抗性的家養(yǎng)蠶株(strain)(家蠶)。通過構(gòu)建基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的載體,我們獲得了組成型產(chǎn)生抗四種桿狀病毒基因即立早-1基因(ie-Ι)、遲效因子基因lef-1、lef-3和p74基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因蠶的幾種同源系。當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾葧r(shí)，由轉(zhuǎn)基因蠶中的低死亡率表明，這些同源種顯示抑制家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染。病毒增殖的減少還通過蛋白質(zhì)印跡分析和其他常規(guī)方法確認(rèn)。該抗病毒性可成功地轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)基因蠶種與非轉(zhuǎn)基因家蠶種的F1代雜交后代。這些結(jié)果表明，我們已通過將同時(shí)靶向多種桿狀病毒必需基因與蠶轉(zhuǎn)基因結(jié)合而成功構(gòu)建了具有高水平抗性的家蠶株。
[0117]已使用RNAi機(jī)理比較鱗翅目中桿狀病毒感染的抑制結(jié)果。初步報(bào)告表明，通過瞬時(shí)RNAi介導(dǎo)靶向IE-1，使Sf9細(xì)胞系和草地貪夜蛾中的AcNPV增殖成功地接近完全抑制(Kanginakudru S，Royer C，Edupalli SV, Jalabert A, MauchampB, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P和Nagaraju J (2007)Targetingie-lgene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell linesand in the transgenic silkworms.1nsect Molecular Biology 16:635-644)。Isobe等人(Li Yj A L Passarelli AL 和 Miller LK(1993)Identification, sequence, andtranscriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and verylate gene expression.Journal of Virology67:5260-5268)報(bào)道了類似的觀察，通過革巴向Ief-1基因在轉(zhuǎn)基因蠶家蠶中觀察到適度病毒抑制但并未完全保護(hù)。這些對比性結(jié)果可歸因于靶基因的差異，因?yàn)橐阎谢?區(qū)域可決定RNAi介導(dǎo)的基因抑制的成功。鑒于獲得可遺傳的RNAi介導(dǎo)的桿狀病毒抑制，我們開始研究通過靶向桿狀病毒必需基因ie-1、Ief-U lef-3和p74來觀察轉(zhuǎn)基因蠶中桿狀病毒的抑制效力。
[0118]為了獲得轉(zhuǎn)基因蠶，我們構(gòu)建了攜帶選擇標(biāo)記3XP3-GFP和3XP3_DsRed、用于表達(dá)四種病毒基因的正義、反義和多基因正-反的雙鏈RNA的DNA(圖1)。由于3XP3-GFP選擇標(biāo)記基因在胚胎中表達(dá)，因此使得容易篩選早期發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)基因蠶。另外，由3XP3-GFP表達(dá)的GFP局限于特定組織。我們利用3XP3-GFP構(gòu)建體的這一性質(zhì)促進(jìn)兩種轉(zhuǎn)基因體的簡便篩選以及桿狀病毒感染進(jìn)程。通過共注射產(chǎn)生dsRNA的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒至Nistari種新產(chǎn)的卵，我們獲得了幾種轉(zhuǎn)基因蠶系。通過控制繁殖，我們獲得了 18個(gè)純合子轉(zhuǎn)基因系，我們使用作為表達(dá)BmNPV的重組GFP的BmNPV-PlOGFP來測試它們的抗病毒活性。我們通過給藥病毒并計(jì)算死亡率來測試經(jīng)口感染。
[0119]我們的結(jié)果表明，不論感染途徑如何，轉(zhuǎn)基因蠶比非轉(zhuǎn)基因蠶系更具有抗性。蛋白質(zhì)印跡分析和顯微觀察確認(rèn)，轉(zhuǎn)基因體中的病毒增殖低于非轉(zhuǎn)基因體。
[0120]總之，我們在這里示出了 RNAi介導(dǎo)的抗桿狀病毒在鱗翅目中是可行的，特別側(cè)重于家蠶B.mori,可通過piggyBac介導(dǎo)的種系轉(zhuǎn)基因而成功生產(chǎn)具有用于RNAi介導(dǎo)的病毒感染抑制的轉(zhuǎn)基因的家蠶的轉(zhuǎn)基因種?？捎腥さ乜闯觯渲锌砂邢虿煌瑮U狀病毒必需基因的多基因靶向的效果。需要開發(fā)使用較好的通用啟動子，特別是被桿狀病毒活化的啟動子作為雙鏈靶RNA的驅(qū)動者。我們建議按照該方向進(jìn)一步研究可教導(dǎo)我們使用RNAi作為用于桿狀病毒感染抑制的工具。
[0121]在以下實(shí)施例的輔助下詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。[0122]實(shí)施例
[0123]應(yīng)理解的是，此處所述的下列實(shí)施例僅為說明性目的，依照其的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是有所教導(dǎo)的，并且包括在本申請的精神和權(quán)限以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0124]實(shí)施例1
[0125]載體
[0126]pPIG3XP3GFP-FF
[0127]載體PPIGA3GFP-FF在作為幾乎通用的啟動子的蠶胞質(zhì)肌動蛋白啟動子支配下表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。受該啟動子驅(qū)動的gfp遍在表達(dá)，因此盡管未整合，但包含載體的GO期胚胎或細(xì)胞發(fā)熒光，使得難以篩選轉(zhuǎn)基因體。為了克服該問題，我們早期已研發(fā)了基于 3XP3 的載體(Kanginakudru S，Royer C，Edupalli SV, Jalabert A, MauchampB,Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P 和 Nagaraju J (2007)Targetingie~l gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell linesand in the transgenic silkworms.1nsect Molecular Biology 16:635-644)用于轉(zhuǎn)基因，該載體攜帶有用于整合的PiggyBac元件的反向重復(fù)序列和受合成眼特異性啟動子(3XP3)支配的GFP基因作為可選擇的標(biāo)記。該合成啟動子在體內(nèi)由Pax蛋白識別，并組織特異性地表達(dá)下游基因。通過將PPIGA3GFP-FF的A3GFP盒替換為Thomas等人(ThomasJL,Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B和Chavancy G(2002)3xP3_EGFP marker facilitatesscreening for transgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stageonwards.1nsect Biochemistry Molecular Biology32:247-253)的 3XP3GFP 盒來構(gòu)建質(zhì)粒pPIG3XP3GFP-FF。為此，PCR擴(kuò)增3XP3-GFP片段并克隆至TA載體中，將其在NgoMIV和SfiI位點(diǎn)之間限制性酶切并移到pPIGA3GFP-FF。再次通過選擇性限制性酶切和測序來確認(rèn)構(gòu)建體 pPIG3XP3GFP-FF。
[0128]正義、反義和多基因正-反載體
[0129]為了獲得具有病毒抗性的轉(zhuǎn)基因蠶株，我們開始靶向多種必需病毒基因的工作。使用PiggyBac載體主體構(gòu)建載體。這些構(gòu)建體為pPiggy正義-3XP3-GFP、PPiggy反義-3XP3-DsRed2和pPiggy多基因正-反-3XP3_DsRed2。所用載體的圖示示于圖1。通過使用攜帶特異性限制性酶切位點(diǎn)的引物來擴(kuò)增分別編碼家蠶核型多角體病毒的立早I基因、晚期表達(dá)因子1、3和包膜蛋白的ie-1、lef-1、lef-3和p74基因和 pPIGA3GFP 的 gfp 基因的區(qū)域來構(gòu)建載體(Tamura T, Thibert C，Royer C，KandaT, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P,FraserM, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki Τ, Chantal Τ, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc Τ, Bernard Μ, Gerard C，Paul S，Malcolm F, Jean-Claude P和PierreC(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。將擴(kuò)增子克隆至 pCR IITopo載體(Invitrogen)的T-突出端(圖6)。所得質(zhì)粒標(biāo)記為Topo-gfp、Topo-1e-l、Topo-lef-UTopo-lef-3和Topo-p74。通過限制性酶切和DNA測序來確認(rèn)這些具有正確插入的載體。這些基因產(chǎn)生病毒特異性蛋白，并且不與已知的人或昆蟲基因享有任何同源性。ie-1、lef-1、lef-3和ρ74的靶區(qū)域，對于ie-Ι基因?yàn)镾EQ ID NO: 11中所述的141-450核苷酸位的核苷酸序列；對于Ief-1基因?yàn)镾EQ ID NO: 12中所述的80-405核苷酸位的核苷酸序列；對于lef-3基因?yàn)镾EQ ID NO: 13中所述的391-706核苷酸位的核苷酸序列；和對于P74基因?yàn)镾EQ ID NO: 14中所述的1243-1552核苷酸位的核苷酸序列。
[0130]使用SEQ ID NO: 1-10 中所述的引物來 PCR 擴(kuò)增 BmNPV 的 ie_l、lef-1、lef-3 和p74 以及 gfp 的 DNA0
[0131]典型的PCR反應(yīng)由50μ I終體積組成，具有各自為25皮摩爾的正向和反向引物。在每個(gè)反應(yīng)為 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3，包含 50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01% 明膠和0.01%曲拉通X-100)、ImM dNTP和5U Taq DNA聚合酶(NEB, US)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在熱循環(huán)機(jī)(PE9700, Applied Biosystems)中使用下列條件進(jìn)行熱循環(huán):95°C初始變性5min ;95°C 30s ；50°C 30s和72°C 2min，35個(gè)循環(huán)，和72°C最終延伸IOmin0在2.0%瓊脂糖凝膠中定量PCR產(chǎn)物，使用Qiagen PCR純化柱根據(jù)制造商手冊純化。將純化產(chǎn)物克隆至如上所述的Topo載體。
[0132]pTopo克隆一次性轉(zhuǎn)化至INVl 10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(Invitrogen)(由于其包含dam和dcm缺陷，允許dam-和dcm-敏感的限制性酶的限制性酶切。dam和dcm缺陷使得產(chǎn)生在這些位點(diǎn)未甲基化的DNA)。在包含40 μ I X-Gal (40mg/ml)和40 μ I異丙基β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，IOOmM)的LB瓊脂板上進(jìn)行藍(lán)/白篩選。挑取白色菌落用于通過酶切的插入分析。挑選給出期望大小的正確插入的菌落。
[0133]對于DNA測序,在包含8 μ I現(xiàn)成的反應(yīng)混合物(Ready reaction mix) (BigDye終止劑，BDTv3.0, Applied Biosystems, Foster City, CA)和 5 皮摩爾 M13 測序引物的測序反應(yīng)中使用250ng質(zhì)粒。所用循環(huán)條件如下:96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25個(gè)循環(huán)。將樣品乙醇沉淀，用70%乙醇洗漆并懸浮于H1-Di?甲酰胺(Applied Biosystems)中。在ABIPrism3100基因分析儀(Applied Biosystems)中進(jìn)行測序并確認(rèn)各基因片段的完整性。[0134]在下述一系列克隆步驟(圖7)中獲得構(gòu)建體pPiggy正義-3XP3-GFP、pPiggy反義-3XP3-DsRed2 和 pPiggy 多基因正-反-3XP3_DsRed2:
[0135]1.使用 Sal1-NheI 位點(diǎn)將 lef_3 的 316bp 的片段(SEQ ID NO: 18)克隆至PA3DS-FSG載體主體(7624bp)中，以產(chǎn)生單基因構(gòu)建體ρΑ3 Λ S-1ef3 (6057bp)。通過XmnI (lef-3的內(nèi)部位點(diǎn))限制性酶切和Xmnl/Scal雙酶切來核實(shí)轉(zhuǎn)化株。根據(jù)DNA strider圖譜，XmnI酶切線性化為1-基因構(gòu)建體的6.05kb片段，利用ScaI (主體中的位點(diǎn))的雙酶切釋放323bp的產(chǎn)物或插入大小以及5.73kb的片段。
[0136]2.使用 BspE1-SalI 位點(diǎn)將 ie-Ι 的 310bp 的片段(SEQ ID NO: 16)克隆至口八3八5-16€3載體中，產(chǎn)生雙基因構(gòu)建體口么3八5-丨6116€356(592%口)。使用Xmnl/Hpal限制性體系在順序酶切下核實(shí)轉(zhuǎn)化株。2-基因構(gòu)建體的Xmn I線性化產(chǎn)生5929bp的片段，XmnI/Hpa I順序酶切產(chǎn)生期望的三條帶，339bp、1071bp和4519bp的片段。
[0137]3.使用Pvu1-BamHI位點(diǎn)將gfp的800bp的片段克隆至ρΑ3 Δ S_iellef3載體主體，產(chǎn)生三基因構(gòu)建體ρΑ3 Δ S-gfpiellef3 (6665bp)。在PvuI/EcoRI限制性分析下核實(shí)轉(zhuǎn)化株，產(chǎn)生834bp的插入物和5834bp的主體。
[0138]4.使用 BspEI/BamHI 將 Ief-1 克隆的 326bp 的片段(SEQ ID NO: 17)加入ρΑ3 Δ S-gfpiellef3 載體主體，產(chǎn)生四基因產(chǎn)物 ρΑ3 Λ S-gfplef liellef3 (6650bp)。通過HpaI和NdeI限制性酶切以分別產(chǎn)生188bp、1410bp、5040bp期望長度的3個(gè)片段以及1361bp和5289bp期望長度的2個(gè)片段來確認(rèn)轉(zhuǎn)化株。
[0139]5.使用 Age1-XbaI 位點(diǎn)將 p74 的 310bp 的片段(SEQ ID NO: 19)克隆于ρΑ3 Λ S-gfplefl iellef3載體主體中，以產(chǎn)生五基因構(gòu)建體ρΑ3 Δ S-gfpleliellef3p74 (6160bp) ?通過Sail限制性酶切確認(rèn)轉(zhuǎn)化株。其產(chǎn)生520bp插入物和5640bp主體。
[0140]用內(nèi)部Nhe1-XbaI位點(diǎn)酶切五基因正義取向的構(gòu)建體pA3AS-gfplefliellef3p74，產(chǎn)生正義和反義取向的五基因的片段池。篩選反義取向質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。這通過HindIII/XmnI酶切確認(rèn)，其中反義菌落產(chǎn)生1.3kb的片段，而正義取向的菌落產(chǎn)生2.2kb的片段。
[0141]正義構(gòu)建體-使用BglI1-NheI和BglI1-XbaI位點(diǎn)將A3:gfp融合的啟動子以及四種基因和 Poly A 尾克隆至 pPiggyP25il2-(3XP3-GFP)TQ 中，產(chǎn)生 pPiggy-正義-3XP3-GFP載體(圖1A)。
[0142]反義構(gòu)建體-將如上所述獲得的反義片段克隆至pPiggyP25il2-(3XP3-DsRed2)TQ,產(chǎn)生 pPiggy-反義-3XP3.DsRed2 載體(圖 1B)。
[0143]6.多基因正-反構(gòu)建體-使用BglI1-AgeI位點(diǎn)將上述A3:gfp融合啟動子與四種基因一起克隆至pP25(sp*)DsRed載體主體中，產(chǎn)生含間隔子區(qū)域(SEQ ID N0:15)的正義片段，中間載體形式pP25(sp*)DsRed-A3AS正義-間隔子。
[0144]7.使用Sse83371-AflII位點(diǎn)將五種基因的反義片段克隆至中間形式的正義-間隔子載體主體，產(chǎn)生正-反形式的多基因構(gòu)建體，PP25 (sp*) DsRed-A3 Λ S正義-間隔子-反義-Poly A 區(qū)。
[0145]8.用BglII和SfiI位點(diǎn)酶切中間穿梭載體pP25 (sp*)正義-間隔子-反義載體，產(chǎn)生正-反形式的插入物。使用Bglll/Sfil位點(diǎn)將該插入物克隆至 PiggyP25IL2-(3XP3-DsRed2)TQ，產(chǎn)生 pPiggyA3gfplefliellef3p74.間隔子.p741ef3ielleflgfp.3XP3_DsRed2 載體，其中 DsRed2 為選擇標(biāo)記基因(圖 1C)。
[0146]因此，可根據(jù)載體的要求和功能構(gòu)建包括編碼本發(fā)明shRNA的多核苷酸的重組載體，其中編碼shRNA的多核苷酸包括兩種或更多種以不同順序排列的核苷酸片段。
[0147]實(shí)施例2
[0148]豕香的種系轉(zhuǎn)基因
[0149]基本上根據(jù)Tamura等人的方法進(jìn)行種系轉(zhuǎn)基因(Tamura T, Thibert C，RoyerC，Kanda T, Abraham E，Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, ShirkP, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P,Toshiki Τ,Chantal Τ,Corinne R, Toshio K, EappenA, Mari K, Natuo K, Jean-Luc Τ, Bernard Μ, Gerard C，Paul S，Malcolm F，Jean-Claude P和 Pierre C(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using apiggyBac transposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。
[0150]對約1000個(gè)蠶卵顯微注射I μ g/ μ I的pPiggy-正義-3XP3-GFP,和等摩爾比的輔助質(zhì)粒。同樣，其它構(gòu)建體即，pPiggy-反義-3XP3-DsRed2和pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2也與輔助質(zhì)粒一起注射至單獨(dú)的卵，以產(chǎn)生不同系的轉(zhuǎn)基因體。溫育所得卵，并通過眼中熒光的表達(dá)來分析各構(gòu)建體的整合。通過控制繁殖獲得了 18個(gè)純合子轉(zhuǎn)基因蠶系。通過使用pPiggy-正義-3XP3-GFP、pPiggy-反義-3XP3_DsRed2和pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2獲得的轉(zhuǎn)基因系分別稱為正義(S)系、反義(AS)系和多基因正-反(MFF)系。所得轉(zhuǎn)基因系包括3個(gè)正義、2個(gè)反義、5個(gè)正義X反義雜交體和8個(gè)MFF。
[0151]實(shí)施例3
[0152]轉(zhuǎn)基因體的分子特性
[0153]以如下所述表征含有產(chǎn)生四種桿狀病毒必需基因的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因的MFF轉(zhuǎn)基因系的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)、它們的拷貝數(shù)和它們在蠶基因組中的物理位置。
[0154]3.1轉(zhuǎn)座元件展示(TED)法
[0155]根據(jù)van der Linden 和 Plasterk2004 (Van der Linden AM 和 PlasterkRH (2004)Shotgun cloning of transposon insertions in the genome ofCaenorhabditis elegans.Computational and Functional Genomics5:225-229)的改進(jìn)方案，將轉(zhuǎn)座元件展示(TED)法用于識別插入位點(diǎn)和插入物的拷貝數(shù)(圖2A)。簡言之，根據(jù) Nagaraja 和 Nagarajul995 (Nagaraja GM 和 Nagaraju J (1995)Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitraryprimers.Electrophoresisl6:1633 - 1638)提取來自轉(zhuǎn)基因系的基因組DNA并用Sau3A酶切。所得酶切的DNA連接至攜帶Sau3A突出端的載體盒(01 igo503和504)。使用設(shè)計(jì)于piggyBac轉(zhuǎn)基因內(nèi)部鄰近左側(cè)反向重復(fù)序列(LIR)的轉(zhuǎn)座子特異性 LIR 外引物(SEQ ID NO:20-5，-CTCACGCGGTCGTTATAGTT)和 LIR 內(nèi)引物(SEQ IDN0:21-5’-GGCGACTGAGATGTCCTAAA)以及 van der Linden 和 Plasterk 的連接子特異性 505和337NEW引物進(jìn)行兩輪PCR。使用MBI taq酶，使用LIR外引物和505引物進(jìn)行第一輪PCR，使用LIR內(nèi)引物和337NEW引物進(jìn)行第二輪PCR。第二輪PCR后擴(kuò)增子的期望大小為大于120bp，包括120bp的轉(zhuǎn)基因部分和未知長度的基因組DNA。將來自第二次擴(kuò)增步驟的PCR產(chǎn)物用于測序。第二次PCR反應(yīng)后單一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成顯示在轉(zhuǎn)基因系中存在轉(zhuǎn)基因的單拷貝插入(圖2B)。將TED用于靶向piggyBac轉(zhuǎn)座子的左臂。
[0156]3.2轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因系的不同染色體上的定位
[0157]為了確認(rèn)插入位置，將PCR產(chǎn)物測序，并對整個(gè)家蠶基因組序列進(jìn)行BLAST搜索。在所有轉(zhuǎn)基因系中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的基因組整合受PiggyBac的介導(dǎo)，由如圖2C所示的PiggyBac介導(dǎo)的整合的特有序列TTAA特征的存在所證實(shí)。對蠶的序列的組裝物理圖譜(http://sRp.dna.affrc.r0.jp/KAIKO/)搜索這些序列，并確定各轉(zhuǎn)基因系的染色體上轉(zhuǎn)基因的染色體定位和相對位置(表1&圖2D)。
[0158]表1:轉(zhuǎn)基因的插入位置
[0159]
【權(quán)利要求】
1.一種短發(fā)夾RNA(ShRNA)，其用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲中桿狀病毒感染的抑制，其中所述shRNA包括 a.RNA正義鏈，其中所述正義鏈包括選自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段， b.間隔子序列，和 c.反義RNA鏈，其與所述RNA正義鏈互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述片段包括至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述正義RNA鏈包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述正義RNA鏈包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述正義RNA鏈包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述正義RNA鏈包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述正義RNA鏈包括SEQID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其中所述間隔子序列為如SEQID NO: 15所述。
9.一種重組DNA構(gòu)建體，其包括 a.具有SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸為反義方向且產(chǎn)生dsRNA分子；或 b.包括選自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDN0:14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈及其互補(bǔ)多核苷酸；或 c.包括選自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDN0:14 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的片段的多核苷酸的正義鏈，其互補(bǔ)多核苷酸和間隔子多核苷酸序列；或 d.編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA的多核苷酸， 其中所述多核苷酸可操作地連接至啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子為組成型啟動子或組織特異性啟動子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子為蠶胞質(zhì)肌動蛋白(Bmactin)啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述組織特異性啟動子為Pax (3XP3)啟動子。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述編碼shRNA的多核苷酸包括 a.包括選自由SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18 和 SEQ IDN0:19 組成的組的兩種或更多種核苷酸序列的正義鏈， b.間隔子序列，和 c.與所述正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體，其進(jìn)一步包括報(bào)告基因。
15.一種重組載體，其包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的短發(fā)夾RNA(shRNA)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組構(gòu)建體。
16.一種宿主細(xì)胞，其包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的短發(fā)夾RNA(shRNA)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其中所述昆蟲為蠶。
19.一種抗桿狀病毒的轉(zhuǎn)基因昆蟲的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括用根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化昆蟲，和篩選顯示對桿狀病毒的抗性的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述昆蟲為蠶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，所述蠶為家蠶。
22.—種抗桿狀病毒轉(zhuǎn)基因昆蟲，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1所述的短發(fā)夾RNA(shRNA)或根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體。
23.一種抗桿狀病毒轉(zhuǎn)基因昆蟲后代，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1所述的短發(fā)夾RNA(shRNA)或根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗桿狀病毒轉(zhuǎn)基因昆蟲或根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗桿狀病毒轉(zhuǎn)基因昆蟲后代，其中所述昆蟲為蠶。
【文檔編號】C12N15/79GK103687949SQ201280016995
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月4日
【發(fā)明者】N·加瓦哥瓦達(dá), S·凱恩吉娜庫德魯 申請人:N·加瓦哥瓦達(dá)