用于β地中海貧血性狀的新型相關(guān)標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及SEQ?ID?NO:1-SEQ?ID?NO:14的分離的核酸分子，其在位置501處表現(xiàn)出單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸分別被指示核苷酸代替。本發(fā)明還涉及所提到的核酸分子，其中一組1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個包含所提到的指示核苷酸的多態(tài)的改變的序列構(gòu)成β地中海貧血，特別是輕度β地中海貧血的標(biāo)記。進(jìn)一步設(shè)想包含SEQ?ID?NO:1；或者SEQ?ID?NO1和2；或者SEQ?ID?NO:1、2和3，或者SEQ?ID?NO:1、2、3和4；或者SEQ?ID?NO:1-5；或者SEQ?ID?NO:1-6；或者SEQ?ID?NO:1-7；或者SEQ?ID?NO:1-14；或者SEQ?ID?NO:8和14；或者SEQ?ID?NO:8和9；或者SEQ?ID?NO:2、4和13的具體組。本發(fā)明還涉及一種檢測或診斷對象的β地中海貧血，優(yōu)選輕度β地中海貧血的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從對象的樣品分離核酸，(b)確定在一個或多個所提到的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，其中指示核苷酸的存在指示β地中海貧血的存在。還設(shè)想用于檢測或診斷β地中海貧血的相應(yīng)的組合物，所提到的核酸分子在檢測或診斷β地中海貧血或者篩查群體中β地中海貧血的存在中的用途，以及相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明的方法、組合物、用途和試劑盒還涉及評價對象和/或?qū)ο蟮暮蟠邪l(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險。
【專利說明】用于β地中海貧血性狀的新型相關(guān)標(biāo)記
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及SEQ ID NOil-SEQ ID NO: 14的分離的核酸分子，其在位置501處表現(xiàn)出單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸分別被指示核苷酸代替。本發(fā)明還涉及所提到的核酸分子，其中一組1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個包含所提到的指示核苷酸的多態(tài)的改變的序列構(gòu)成β地中海貧血，特別是輕度β地中海貧血的標(biāo)記。進(jìn)一步設(shè)想包含SEQ ID NO:1;或者 SEQ ID NOl 和 2 ;或者 SEQ ID NO: 1、2 和 3，或者 SEQ ID N0:l、2、3 和4;或者 SEQ ID NO: 1-5;或者 SEQ ID NO: 1-6;或者 SEQ ID NO: 1-7;或者 SEQ ID NO: 1-14 ；或者SEQ ID NO:8和14;或者SEQ ID Ν0:8和9;或者SEQ ID NO:2、4和13的具體組。本發(fā)明還涉及一種檢測或診斷對象的β地中海貧血，優(yōu)選輕度β地中海貧血的方法，所述方法包括以下步驟:(a)從對象的樣品分離核酸，(b)確定在一個或多個所提到的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，其中指示核苷酸的存在指示β地中海貧血的存在。還設(shè)想了用于檢測或診斷β地中海貧血的相應(yīng)的組合物，所提到的核酸分子在檢測或診斷β地中海貧血或者篩選存在β地中海貧血的群體中的用途，以及相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明的方法、組合物、用途和試劑盒還涉及評價對象和/或?qū)ο蟮暮蟠邪l(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險。
【背景技術(shù)】
[0002]地中海貧血是遺傳性的，即常染色體隱性遺傳的血液病癥。遺傳缺陷(可以是突變或缺失)通常導(dǎo)致血紅蛋白的珠蛋白鏈之一的的合成率減少，或者不合成這些鏈。結(jié)果，形成異常的血紅蛋白分子，這導(dǎo)致貧血，即所有地中海貧血形式的特征性癥狀。在典型的情況下，因此地中海貧血涉及合成的珠蛋白數(shù)量減少的定量問題，通常通過調(diào)控基因或調(diào)控區(qū)中的突變或修飾，而另一主要貧血病癥鐮形細(xì)胞貧血是由mal-功能珠蛋白的合成的定性問題所引起的。根據(jù)受影響的血紅蛋白基因的鏈，地中海貧血分為兩種主要形式，α地中海貧血和β地中海貧血:在α地中海貧血中，α珠蛋白鏈的產(chǎn)生受到影響，而在β地中海貧血中，β珠蛋白鏈的產(chǎn)生受到影響。
[0003]在α地中海貧血的病因中，涉及基因HBAl (編碼血紅蛋白亞基α I ;位于染色體16ρ13.3上)和ΗΒΑ2(編碼血紅蛋白亞基α2 ;位于染色體16ρ13.3上)的至少4個等位基因，以及染色體16ρ的缺失。這導(dǎo)致α-珠蛋白產(chǎn)生的減少，并且伴隨著成人中β_珠蛋白鏈的過量，其形成不穩(wěn)定的β珠蛋白四聚體，也稱為血紅蛋白H，表現(xiàn)出異常的氧解離曲線。與之相反，以2個α和2個β亞基的異四聚體的形式提供正常的血紅蛋白，也稱為血紅蛋白Α。
[0004]在β地中海貧血的病因中，原則上涉及HBB基因(編碼血紅蛋白亞基β ;位于染色體11ρ15.5上)或相關(guān)區(qū)域的突變。到目前為止，在HGMD和其他數(shù)據(jù)庫中已記錄超過470個與HBB基因相關(guān)的突變，其可以導(dǎo)致或有助于β地中海貧血。這些突變包括β珠蛋白基因座內(nèi)的小的點突變或讀框移位，以及所述區(qū)域中的一些較大的缺失。例如，突變可以影響主要β珠蛋白轉(zhuǎn)錄物的正確剪接，并且導(dǎo)致異常的剪接模式。不同類型的突變可以在β-珠蛋白基因之前的啟動子區(qū)中出現(xiàn)。在所有情況下，β鏈的絕對或相對缺少導(dǎo)致α鏈過量，但是，α鏈不形成四聚體，而是結(jié)合至紅細(xì)胞膜，產(chǎn)生膜損傷甚至可以形成有毒聚集。
[0005]疾病的嚴(yán)重程度顯然取決于突變的性質(zhì)。在重型β地中海貧血或庫利氏貧血中，任何β鏈的形成均受到阻止。具體地，如果兩個等位基因均具有地中海貧血突變，則疾病可能發(fā)生。這通常導(dǎo)致嚴(yán)重的小細(xì)胞、低色素性貧血。如果不治療，其會引起貧血、脾腫大和嚴(yán)重的骨骼畸形。其通常在20歲之前發(fā)展到死亡。治療通常由定期輸血、脾切除術(shù)(如果存在脾腫大)和治療輸血引起的鐵超負(fù)荷組成。遺傳情況或?qū)е滤耐蛔兺ǔＣ枋鰹棣?/β°、β°/β°或3 73+，其中“3”描述沒有減少β血紅蛋白的功能的突變的等位基因，“β+”描述包含允許一些β鏈形成發(fā)生的突變的等位基因，而“β°”描述包含完全阻止β鏈的產(chǎn)生的突變的等位基因。
[0006]在中間型β地中海貧血中，發(fā)生一些β鏈的產(chǎn)生。受影響的對象通常可以進(jìn)行正常生活，但是可能需要偶爾輸血，例如在疾病或妊娠時，這取決于他們貧血的嚴(yán)重程度。遺傳情況或?qū)е滤耐蛔兺ǔＣ枋鰹棣?/β +或β+/β°。 [0007]在輕度β地中海貧血(beta thalassemia minor)或輕微β地中海貧血(betathalassemia trait)中,僅一個β珠蛋白等位基因包含突變。據(jù)認(rèn)為這是輕度的小細(xì)胞性貧血。輕度地中海貧血本身并不威脅生命，但是由于輕度至中度貧血的影響，其可以影響生活質(zhì)量。其通常不被積極治療且甚至受到忽視，特別是在不發(fā)達(dá)地區(qū)。傳統(tǒng)檢測通常包括測量平均紅細(xì)胞體積(即紅細(xì)胞的大小)，這可以導(dǎo)致觀察到患者具有比正常略微減少的平均體積。此外，患者通常具有增加的血紅蛋白Α2分?jǐn)?shù)(>3.5%，例如3.8%-7%)和減少的血紅蛋白A分?jǐn)?shù)(〈97.5%)。遺傳情況或者導(dǎo)致輕度地中海貧血或輕微β地中海貧血的突變通常描述為β+/β或β°/β。但是，由于疾病輕度β地中海貧血攜帶者的常染色體隱性遺傳，對公共健康構(gòu)成重大威脅，因為在隨后的幾代人中，隱性性狀的組合可以導(dǎo)致更嚴(yán)重形式的疾病。
[0008]此外，已知其他β地中海貧血變體，例如在泰國最流行的Hb Ε/β°地中海貧血(Sherva et al.，2010，BMC Medical Genetics, 11，51)。在這種變體中，β 珠蛋白基因的密碼子26中的點突變可以誘導(dǎo)可變剪接，這導(dǎo)致β珠蛋白E鏈減少，引起低色素性小紅細(xì)胞癥以及最小至嚴(yán)重貧血。Sherva等人發(fā)現(xiàn)了 50個與這種特定地中海貧血形式相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，其大部分在功能上與β珠蛋白基因簇的調(diào)控區(qū)著絲粒相關(guān)。
[0009]地中海貧血形式聚集在不同地理區(qū)域中。盡管α地中海貧血在西非和美洲盛行，但是在地中海地區(qū)、北非、西亞和南亞的人群中可以發(fā)現(xiàn)β地中海貧血，這表明世界上最高濃度的攜帶者。例如，在印度，據(jù)認(rèn)為β地中海貧血的攜帶率為3-17%。
[0010]據(jù)認(rèn)為世界上有60-80Χ106人為β地中海貧血攜帶者。特別地，由于缺少遺傳咨詢和篩查，在像印度、巴基斯坦和泰國這樣的國家見到β地中海貧血患者的大量增加，并且人們越來越關(guān)注β地中海貧血可能在未來幾十年中成為非常嚴(yán)重的問題，這可能增加全世界血庫供應(yīng)和一般衛(wèi)生系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。
[0011]通常，β地中海貧血攜帶者鑒定的最有價值的測試是定量的血紅蛋白Α2測定，包括醋酸纖維素電泳后的光密度掃描、等電聚焦、毛細(xì)管電泳、手高性能陽離子交換層析(HPLC)。雖然光密度掃描的結(jié)果令人不滿，并且等電聚焦繁瑣和費時，但是優(yōu)越的HPLC方法在沒有必需的設(shè)備的地區(qū)最難以進(jìn)行。
[0012]結(jié)果，需要允許更容易、更直接、更靈敏且更特異性地篩查和檢測β地中海貧血，特別是β地中海貧血攜帶者的方式和方法。
[0013]發(fā)明概沭
[0014]本發(fā)明解決這個需求并且提供允許檢測和鑒定β地中海貧血，特別是β地中海貧血攜帶者的方式和方法 。
[0015]上述目標(biāo)具體通過分離的核酸分子來完成，所述分離的核酸分子選自:
[0016](i)SEQ ID N0:l[rs666247]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0017](ii)SEQ ID N0:2[rsl2707034]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0018](iii)SEQ ID N0:3[rs707497]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0019](iv) SEQ ID NO: 4 [rsl7024172]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0020](V)SEQ ID NO: 5 [rsl6950705]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0021](Vi)SEQ ID N0:6[rsll956461]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0022](vii)SEQ ID NO: 7 [rs609539]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；
[0023](viii)SEQ ID NO:8 [rs7975838]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0024](ix)SEQ ID N0:9[rsl2063296]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0025](x)SEQ ID NO: 10 [rsl6913719]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0026](xi)SEQ ID NO: 11 [rsll497898]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0027](xii)SEQ ID NO: 12 [rsl7168572]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0028](xiii)SEQ ID NO: 13[rsl6933412]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及
[0029](xiv)SEQ ID NO: 14[rsl6864505]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替。
[0030]這些序列構(gòu)成新的與β地中海貧血相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。因此它們允許靈敏、特異性、有效和簡單的對β地中海貧血的檢測和診斷方法，例如通過采用廣為流傳且易于使用的技術(shù)如PCR或核酸雜交，據(jù)認(rèn)為其具有高適用性和利用率，特別是在世界的欠發(fā)達(dá)地區(qū)。在基于高通量基因型分型技術(shù)的用來自北印度人群的樣品的全基因組關(guān)聯(lián)研究中鑒定的新SNP提供了額外的優(yōu)點，其提供對β地中海貧血病理生理學(xué)的更好理解，這可以導(dǎo)致改善的疾病管理，特別是關(guān)于群體遺傳學(xué)方面。特別地，通過主要基于輕度β地中海貧血的表型,這通過HPLC分析證實，SNP對于這種β地中海貧血變體的檢測非常有用，即對于β地中海貧血攜帶者的鑒定非常有用，否則β地中海貧血攜帶者可能在表型上不明顯。相應(yīng)的遺傳篩查或咨詢方法可以非常有助于限制作為常染色體隱性疾病的β地中海貧血結(jié)果。此外，SNP允許使用高度現(xiàn)代化的檢測方法如微陣列分析和基因組測序，其可以在高通量的基礎(chǔ)上完成。最后，由于SNP是在印度人群中鑒定的，它們允許為南亞人群，特別是印度人群專門設(shè)計測定。因此認(rèn)為新的SNP可用于南亞人群，特別是印度人群的人群特異性β地中海貧血檢測。
[0031] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13種或全部的
包含上述指示核苷酸的上述多態(tài)的改變的序列組構(gòu)成了 β地中海貧血的標(biāo)記。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，一組至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13種或全部的包含上述指示核苷酸的上述多態(tài)的改變的序列組構(gòu)成了輕度β地中海貧血的標(biāo)記。
[0032]在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及如上文所提到的分離的核酸或者核酸的集合或組，其中所述組至少包含:
[0033](i)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；或者
[0034](ii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；或者
[0035](iii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；或者
[0036](iv) SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；或者
[0037](V)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者
[0038](Vi)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID N0:6,除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者
[0039](vii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ IDNO: 7，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；或者 [0040](viii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID N0:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ IDNO: 7，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；以及SEQ ID N0:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 10，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO: 11，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 12，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者
[0041](ix) SEQ ID NO: 8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者
[0042](X)SEQ ID NO:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；或者
[0043](Xi)SEQ ID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替。
[0044]在另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測或診斷對象的β地中海貧血的方法，所述方法包括以下步驟:
[0045](a)從對象樣品分離核酸[0046](b)確定在如上文定義的一個或多個多態(tài)位點處存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)；
[0047]其中如上文定義的指示核苷酸的存在指示β地中海貧血的存在。
[0048]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，涉及檢測或診斷對象的輕度β地中海貧血的方法，所述方法包括以下步驟:
[0049](a)從對象樣品分離核酸
[0050](b)確定在如上文定義的一個或多個多態(tài)位點處存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)；
[0051]其中如上文定義的指示核苷酸的存在指示輕度β地中海貧血的存在。
[0052]在另一優(yōu)選實施方案中，所述確定核苷酸序列可以通過等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析、引物延伸測定、iPLEX SNP基因型分型、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)基因型分型、使用分子信標(biāo)、四引物ARMS PCR、游離內(nèi)切核酸酶侵入(Flapendonuclease invader)測定、寡核苷酸連接酶測定、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、定量實時PCR測定、基于SNP微陣列的分析、限制性酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、靶向重新測序分析和/或全基因組測序分析來進(jìn)行。
[0053]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述方法包括確定樣品中的HbA2濃度的額外步驟。 [0054]在另一優(yōu)選實施方案中，所述確定Hb A2濃度可以通過HPLC、微量色譜、等電聚焦或毛細(xì)管電泳來進(jìn)行。
[0055]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的樣品可以是組織、器官、細(xì)胞和/或它們的片段的混合物，或者組織或器官特異性樣品，例如來自陰道組織、舌、胰、肝、脾、卵巢、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織、腫瘤組織的組織活檢樣品，或者體液、血液、血清、唾液或尿。特別優(yōu)選血液。
[0056]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的方法包括確定在SEQ ID N0:8和SEQID NO:9的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，以及檢測SEQ ID NO:8和/或SEQID NO:9的基因組附近的DNAse高敏感性位點，其中如上文定義的指示核苷酸的存在以及所述DNAse高敏感性位點的存在指示β地中海貧血的存在。
[0057]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的方法包括確定在SEQ ID NO:2, SEQID NO: 4和SEQ ID NO: 13的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，以及檢測SEQ IDΝ0:2和/或SEQ ID Ν0:4和/或SEQ ID NO: 13的基因組附近的組蛋白3賴氨酸27三甲基化，其中如上文定義的指示核苷酸的存在以及所述組蛋白3賴氨酸27三甲基化的存在指示β地中海貧血的存在。
[0058]在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測或診斷對象的β地中海貧血的組合物，其包含如上文定義的一個或多個多態(tài)位點的核酸親和配體。
[0059]在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，涉及用于檢測或診斷對象的輕度β地中海貧血的組合物，其包含如上文定義的一個或多個多態(tài)位點的核酸親和配體。
[0060]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的親和配體可以是特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，或者是特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。在本發(fā)明的一特別優(yōu)選的實施方案中，上文提到的親和配體可以是具有與如上文定義的指示核苷酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。
[0061]在另一方面，本發(fā)明涉及如上文定義的核酸分子在檢測或診斷對象的β地中海貧血或者在篩查對象的群體中β地中海貧血的存在中的用途。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述β地中海貧血可以是輕度β地中海貧血。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，所述對象的群體可以是南亞對象的群體。
[0062]在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測或診斷對象的β地中海貧血的試劑盒，其包含特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，或者特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸具有與如上文定義的指示核苷酸互補(bǔ)的序列。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，所述β地中海貧血是輕度β地中海貧血。
[0063]在另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的的方法、組合物、用途和試劑盒涉及評價對象和/或?qū)ο蟮暮蟠邪l(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1示出通過HPLC檢測的病例和對照對象的血紅蛋白Α2 (以％顯示)。 [0065]圖2提供輕度β地中海貧血的全基因組關(guān)聯(lián)研究的總方案。
[0066]圖3示出基于Affymetrix SNP6.0的使用的基因型分型和下游分析的工作流程。
[0067]圖4示出在基因型分型控制臺中獲得的所有樣品的質(zhì)量控制分析的結(jié)果。將閾值設(shè)置為86%。所有48個病例和66個對照均具有86%以上的QC調(diào)用率(call rate)。
[0068]圖5示出針對人細(xì)胞染色體鑒定的SNP的P-值的圖。
[0069]圖6示出單倍型塊捕獲相關(guān)的SNP。
[0070]圖6示出染色體I的單倍型塊，
[0071]圖6B示出染色體2的單倍型塊，
[0072]圖6C示出染色體5的單倍型塊，
[0073]圖6D示出染色體6的單倍型塊，
[0074]圖6E示出染色體7的單倍型塊，
[0075]圖6F示出染色體8的單倍型塊；
[0076]圖6G示出染色體10的單倍型塊，并且
[0077]圖6H示出染色體12的單倍型塊。
【具體實施方式】
[0078]發(fā)明人開發(fā)了允許檢測和鑒定β地中海貧血，特別是輕度β地中海貧血和β地中海貧血攜帶者的方式和方法。
[0079]雖然本發(fā)明會關(guān)于具體實施方案來描述，但是這種描述不應(yīng)理解為具有限制意義。
[0080]在詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實施方案之前，給出對于理解本發(fā)明很重要的定義。
[0081]在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用時，除非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式的“一個(a) ”和“一個(an) ”還包括各自的復(fù)數(shù)。
[0082]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“約”和“大約”表示準(zhǔn)確性的間隔，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解所述準(zhǔn)確性的間隔仍確保考慮的特征的技術(shù)效果。該術(shù)語通常表示所示數(shù)值的±20%，優(yōu)選±15%,更優(yōu)選±10%,并且甚至更優(yōu)選±5%的偏差。
[0083]應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“包含”不是限制性的。為了本發(fā)明的目的，認(rèn)為術(shù)語“由…組成”是術(shù)語“包含”的優(yōu)選實施方案。如果此后組定義為至少包含一定數(shù)量的實施方案，這表示還涵蓋優(yōu)選僅由這些實施方案組成的組。
[0084]此外，在描述和權(quán)利要求書中，術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”或者“(a) ”、“ (b) ”、
“(C) ”、“ (d) ”等用于區(qū)分相似的元素而不是描述順序或時間順序所必需的。應(yīng)當(dāng)理解這樣使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下可互換，并且本文所述的本發(fā)明的實施方案能夠以與本文描述或說明的順序不同的其他順序進(jìn)行。[0085]如果術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”或者“ (a) ”、“ (b) ”、“ (C) ”、“ (d) ”等涉及方法或
用途的步驟，則步驟之間沒有時間或時間間隔延續(xù)性(coherence)，即步驟可以同時進(jìn)行，或者這些步驟之間可以有數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或甚至數(shù)年的時間間隔，除非如上文或下文所示在本申請中其他地方指出。
[0086]應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于本文所述的具體方法、方案、試劑等，因為這些可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的而不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0087]如上文所示，在一方面本發(fā)明涉及分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自:
[0088](i)SEQ ID NO:1 [rs666247]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0089](ii)SEQ ID NO: 2 [rsl2707034]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0090](iii)SEQ ID NO: 3 [rs707497]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0091](iv) SEQ ID NO: 4 [rsl7024172]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0092](V)SEQ ID NO: 5 [rsl6950705]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0093](vi)SEQ ID N0:6[rsll956461]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0094](vii)SEQ ID NO: 7 [rs609539]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；
[0095](viii)SEQ ID NO:8 [rs7975838]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；
[0096](ix) SEQ ID NO: 9 [rsl2063296]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0097](X)SEQ ID NO: 10 [rsl6913719]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；
[0098](xi)SEQ ID NO: 11 [rsll497898]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；[0099](xii)SEQ ID NO: 12 [rsl7168572]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；
[0100](Xiii)SEQ ID N0:13[rsl6933412]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及
[0101](Xiv)SEQ ID NO: 14[rsl6864505]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替。
[0102]如本文所用，術(shù)語“分離的核酸分子”指核酸實體，例如DNA、RNA等，其中所述實體基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白、脂質(zhì)、糖或其他物質(zhì)，如細(xì)胞碎片或生長培養(yǎng)基。一般來說，術(shù)語“分離”不是為了指完全不存在這類物質(zhì)，或者不存在水、緩沖液或鹽，除非它們以實質(zhì)上干擾本發(fā)明的方法的量存在。
[0103]本文提到的術(shù)語“野生型序列”指等位基因的序列，其不表現(xiàn)出本發(fā)明的相關(guān)表型，優(yōu)選地，其不表現(xiàn)出β地中海貧血的相關(guān)表型。該術(shù)語還可以指在人群內(nèi)，優(yōu)選在南亞人群內(nèi)，更優(yōu)選在印度人群內(nèi)最流行的無表型相關(guān)的等位基因的序列。[0104]如本文所用，術(shù)語“指示序列”指等位基因的序列，其表現(xiàn)出與本發(fā)明的表型的關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，其表現(xiàn)出與β地中海貧血的表型的關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的具體實施方案中，指示序列可以不僅僅是上文所示的SEQ ID N0:l-14各自的等位基因序列，而且還是來自如本文定義的野生型序列的獨立的進(jìn)一步的變異。
[0105]如本文所用，術(shù)語“等位基因”或“等位基因序列”指位于特定染色體位置或基因座的基因或特定核苷酸，優(yōu)選DNA序列的特定形式。在本發(fā)明的某些實施方案中，如本文定義的SNP可以在單一對象的人基因組的兩個等位基因之一找到。在其他具體實施方案中，如本文定義的SNP還可以在單一對象的人基因組的兩個等位基因中找到。
[0106]上文提到的SEQ ID NO: 1-14各自包含一段1001個核苷酸，并且表示遇到的多態(tài)位點的野生型序列及其上游和下游的500個核苷酸背景序列。因此，本發(fā)明設(shè)想SEQID NO: 1-14所示的序列，特別是在其位置501處的多態(tài)核苷酸，以及SEQ ID N0:l_14的互補(bǔ)鏈的序列，特別是在所述互補(bǔ)鏈的位置501處的多態(tài)核苷酸。為了分析的目的，鏈身份(identity)可以定義或固定，或者可以隨意選擇，例如取決于諸如結(jié)合元件的可用性、GC-含量等的因素。此外，為準(zhǔn)確起見，SNP可以同時定義在兩條鏈上并相應(yīng)地分析。
[0107]本文提到的SEQ ID NO:1定義單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs666247的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體6、染色體區(qū)段(cytoband)p22.3、位置20032959-20033959，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出0.21559633的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因L0C729105附近23967和13778的距離。該距離表示SNP兩側(cè)的最大距離。
[0108]本文提到的SEQ ID N0:2定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl2707034的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體7、染色體區(qū)段q32.3、位置132016658-132017658，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出0.233009709的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因PLXNA4附近209067和316289的距離。
[0109]本文提到的SEQ ID N0:3定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs707497的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體2、染色體區(qū)段ql4.3、位置125064809-125065809，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出0.223300971的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因CNTNAP5附近282445和607555的距離。
[0110]本文提到的SEQ ID N0:4定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl7024172的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體2、染色體區(qū)段p22.1、位置39931763-39932763，其中在位置501處，野生型核苷酸A被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸G代替。該SNP表現(xiàn)出0.186363636的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因TMEM178附近39173和1284的距離。
[0111]本文提到的SEQ ID N0:5定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl6950705的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體16、染色體區(qū)段ql2.1、位置52061759-52062759，其中在位置501處，野生型核苷酸C被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸T代替。該SNP表現(xiàn)出0.183962264的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因L0C388276附近1995和46604的距離。
[0112]本文提到的SEQ ID N0:6定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsll956461的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體5、染色體區(qū)段q21.2、位置104378123-104379123，其中在位置501處，野生型核苷酸C被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸T代替。該SNP表現(xiàn)出0.160377358的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因NUDT12和RAB9P1附近分別-1480133和-56552的距離。
[0113]本文提到的SEQ ID N0:7定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs609539的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體5、染色體區(qū)段q21.3、位置106904497-106905497，其中在位置501處，野生型核苷酸G被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸A代替。該SNP表現(xiàn)出0.291262136的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因EFNA5附近188646和101599
的距離。
[0114]本文提到的SEQ ID NO:8定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs7975838的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體12、染色體區(qū)段q24.22、位置116881224-116882224，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出0.327102804的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因MED13L和FLJ42957附近分別-166581和-89503的距離。
[0115]本文提到的SEQ ID N0:9定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl2063296的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體1、染色體區(qū)段q25.1、位置173929399-173930399，其中在位置501處，野生型核苷酸A被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸G代替。該SNP表現(xiàn)出0.132075472的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因RC3H1附近29547和32311
的距離。
[0116]本文提到的SEQ ID NO: 10定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl6913719的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體9、染色體區(qū)段p21.1、位置28819174-28820174，其中在位置501處，野生型核苷酸C被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸T代替。該SNP表現(xiàn)出0.14159292的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因L0C646700和MIRN876附近分別-670440和-43949的距離。
[0117]本文提到的SEQ ID NO: 11定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl 1497898的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體10、染色體區(qū)段q21.3、位置66518352-66519352，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出0.135514019的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因L0C100129267和ANXA2P3附近分別-587977和-66433的距離。
[0118]本文提到的SEQ ID NO: 12定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl7168572的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體7、染色體區(qū)段q21.3、位置97065519-97066519，其中在位置501處，野生型核苷酸A被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸G代替。該SNP表現(xiàn)出0.133027523的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因L0C442712和TACl附近分別-235259和-295356的距離。
[0119]本文提到的SEQ ID NO: 13定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl6933412的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體8、染色體區(qū)段ql3.2、位置68497405-68498405，其中在位置501處，野生型核苷酸T被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸C代替。該SNP表現(xiàn)出.0.169724771的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因CPA6附近163497和160675的距離。
[0120]本文提到的SEQ ID NO: 14定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)rsl6864505的序列，根據(jù)人基因組的NCBI構(gòu)建37.1，其位于染色體2、染色體區(qū)段q36.1、位置224018270-224019270，其中在位置501處，野生型核苷酸C被指示核苷酸代替，優(yōu)選被核苷酸T代替。該SNP表現(xiàn)出0.199029126的最小等位基因頻率。該SNP基因座位于基因KCNE4和SCG2附近分別-98415和-442888的距離。
[0121]在本發(fā)明的具體實施方案中，設(shè)想的核酸分子包含SEQ ID N0:l-14的序列，基本上由SEQ ID NO: 1-14的序列組成，或者由SEQ ID NO: 1_14的序列組成。例如，如本文所定義，所述序列可以包含SEQ ID NO: 1-14的3’和/或5’背景中的相鄰區(qū)域，例如從上文所示的基因組位置開始3’和/或5’方向的一段額外的約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、10000 或更多個核苷酸。
[0122]在本發(fā)明的其他實施方案中，設(shè)想的核酸分子可以包含SEQ ID N0:l_14的片段，基本上由SEQ ID NO: 1-14的片段組成或者由SEQ ID NO: 1_14的片段組成，所述SEQ IDNO: 1-14的片段至少必須包含位于SEQ ID NO: 1-14的位置501處的多態(tài)位點。例如，本發(fā)明涉及約 900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20 或 10 個或更少個核苷酸長度或者之間的任何值的序列，其必須至少包含位于SEQ ID NO: 1-14的位置501處的多態(tài)位點。所述片段可以朝向5’或3’方向或者雙向5’和3’方向延伸所示長度。優(yōu)選長度為100個核苷酸及更少的片段，SNP位于位置50或相應(yīng)的位置左右，即在序列的中心。
[0123]在本發(fā)明的其他實施方案中，還涵蓋包括如上文定義的一個或多個SNP的單倍型，即具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO: 1、具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO:2、具有 SNPrs707497 的 SEQ ID NO: 3，具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO: 4、具有 rsl6950705 的 SEQID N0:5、具有 SNP rsll956461 的 SEQ ID N0:6、具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7、具有SNP rs7975838 的 SEQ ID NO:8、具有SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9、具有SNPrsl6913719的 SEQ ID NO: 10、具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11、具有 SNP rsl7168572 的 SEQ IDNO: 12、具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 或者具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14。如本文所用，術(shù)語“單倍型”指在來自單一對象的單一染色體上的基因座中的一個或多個相連的多態(tài)位點發(fā)現(xiàn)的核苷酸的5’至3’序列。優(yōu)選地，本發(fā)明涵蓋如實施例2定義或如圖6A-H所示的單倍型，或者表6中提到的單倍型。特別優(yōu)選從表6衍生的表現(xiàn)出< 10-10的P-值的單倍型。
[0124]更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及以下單倍型:
[0125](i)對于染色體 1:rsll573269(SEQ ID NO:9)、rs4654885、rs441380、rsl0493137、rs6657279、rs6683003、rsl2082126、rsl529594、rsl2087676、rsll209819、rs576056、rsll808445、rs698944、rs291565、rsl7120268、rs41343145、rsl7018484、rsl6857061、rsl2131192、rsl2063296、rsl0913087、rs3009323、rs805911、rs6701222、rsl389970、rs6693224> rs6667309 ；
[0126](ii)對于染色體 2:rsl607574, rsl946779、rsl7270394, rsl74234、rsl0930139、rsl6861444、rsl6830979、rsl6830984、rsl6831766、rs6746486、rsl3396027、rsl0210016、rsl6864505(SEQ ID NO:14)、rs6543517 ; [0127](iii)對于染色體 6:rsl7133225、rs6901918、rs666247(SEQ ID NO:1),rs6916596> rsl6892958 ；
[0128](iv)對于染色體 7:rs2091148、rs2906388、rsl7138360、rs7793209、rs6974813、rs579699、rsl7168572(SEQ ID NO: 12);以及
[0129](V)對于染色體 8:rsll989414、rs9298449、rs783608U rs6988356、rs6994555、rsl6933412(SEQ ID NO:13)、rsll995613、rsll989908。
[0130]因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從上文鑒定的rs_命名，例如從合適的數(shù)據(jù)庫條目和相關(guān)的信息系統(tǒng)如單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)(其援引加入本文)衍生確切位置、核苷酸序列和指示序列。
[0131]在本發(fā)明的其他實施方案中，涉及一個或多個，例如一組上文提到的多態(tài)的改變的序列，其包含上文提到的指示核苷酸，構(gòu)成β地中海貧血的標(biāo)記。如本文所用，術(shù)語“β地中海貧血的標(biāo)記”指所提到的SNP與疾病β地中海貧血之間的關(guān)聯(lián),所述SNP在至少一個等位基因中，或者在特定實施方案中，在單一對象的兩個等位基因中，在如上文定義的序列位置包含上文鑒定的指示核苷酸。因此，可以認(rèn)為包含或表現(xiàn)出如上文定義的一個或多個SNP的對象受到β地中海貧血的影響，特別是在SEQ ID NO: 1-14的背景中定義的具有相應(yīng)地鑒定的指示核苷酸的SNP。如本文所用，術(shù)語“β地中海貧血”指一種或多種遺傳修飾，通常為常染色體隱性突變，其導(dǎo)致對象中β血紅蛋白量的缺失或減少。該疾病可以以中間型地中海貧血或者優(yōu)選輕度地中海貧血的形式，或者在例外情況下以重型地中海貧血的形式存在，例如，表現(xiàn)出可能的遺傳情況@7@、@7@、@7@°、@7@°、@+/^ +之一，其中“β”描述沒有減少β血紅蛋白功能的突變的等位基因，“β+”描述包含允許一些β血紅蛋白鏈形成發(fā)生的突變的等位基因，而“β°”描述包含完全阻止β血紅蛋白鏈產(chǎn)生的突變的等位基因。
[0132]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，涉及一個或多個，例如一組上文提到的多態(tài)的改變的序列，其包含上文提到的指示核苷酸，構(gòu)成輕度β地中海貧血的標(biāo)記。如本文所用，術(shù)語“輕度β地中海貧血”指可能的β+/β或β°/β的遺傳情況。這種病癥的特征在于輕度至中度貧血，其通常不威脅生命。該病癥可以進(jìn)一步表現(xiàn)出這樣的表型，血紅蛋白Α2分?jǐn)?shù)增加(>3.5%，例如3.8%-7%)和血紅蛋白A分?jǐn)?shù)減少(〈97.5%)。因為患有輕度β地中海貧血的對象是β地中海貧血的常染色體隱性性狀的攜帶者，所以一個或多個，例如一組包含上述指示核苷酸的上述多態(tài)的改變的序列還優(yōu)選構(gòu)成β地中海貧血攜帶者的標(biāo)記或標(biāo)識。因此，如本文所用，術(shù)語“β地中海貧血”還包括上文提到的β地中海貧血攜帶者情況，其可以是明顯的，或者在其他實施方案中，可能是不明顯的。
[0133] 在其他優(yōu)選實施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13個或全部包含上述指示核苷酸的上述多態(tài)的改變的序列可以構(gòu)成標(biāo)記。優(yōu)選地，單一 SNP可以用作如上文定義的β地中海貧血的標(biāo)記,優(yōu)選用于上文提到的輕度β地中海貧血或β地中海貧血攜帶者。還優(yōu)選任何可能的2個本發(fā)明的SNP的組合，例如具有SNP rs666247的SEQ ID NO:1和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO:2、具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO:3 和具有 SNPrsl7024172 的 SEQ ID NO: 4、具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO: 5 和具有 SNP rsll956461的 SEQ ID NO:6、具有 SNP rs609539 的 SEQ ID NO: 7 和具有 SNP rs7975838 的 SEQ IDNO: 8、具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO: 9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ ID NO: 10、具有SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12、或者具有 SNPrsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他2個SNP的排列或分組。
[0134]還優(yōu)選任何可能的3個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID N0:2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID N0:3、具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6、具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID N0:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID N0:9、具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12、或者具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有SNP rs666247的SEQ ID NO:1等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他3個SNP的排列或分組。
[0135]還優(yōu)選任何可能的4個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4;具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 ;具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12，或者具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他4個SNP的排列或分組。
[0136]還優(yōu)選任何可能的5個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5、具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQID NO: 10 ;或者具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ IDNO: 12 和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14和具有SNP rs666247的SEQ ID NO:1等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他5個SNP的排列或分組。
[0137]還優(yōu)選任何可能的6個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6;具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838 的SEQ ID N0:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID N0:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12 ；或者具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNPrs707497 的 SEQ ID N0:3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 等。還設(shè)想所提到的 SNP的所有其他6個SNP的排列或分組。 [0138]還優(yōu)選任何可能的7個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO:5 和具有 SNPrsll956461 的SEQ ID N0:6和具有SNP rs609539 的SEQ ID N0:7;或者具有SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsll497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他7個SNP的排列或分組。
[0139]還優(yōu)選任何可能的8個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsl 1956461 的 SEQ ID NO: 6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID NO: 7 和具有 SNP rs7975838 的SEQ ID N0:8;或者具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID N0:9和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID N0:2 等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他8個SNP的排列或分組。
[0140]還優(yōu)選任何可能的9個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsl 1956461 的 SEQ ID NO: 6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID NO: 7 和具有 SNP rs7975838 的SEQ ID N0:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID N0:9;或者具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsll497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rs 12707034 的 SEQ ID NO: 2和具有 SNP rs707497的SEQ ID N0:3和具有SNP rsl7024172的SEQ ID N0:4等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他9個SNP的排列或分組。[0141]還優(yōu)選任何可能的10個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQID NO: 10 ;或者具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ IDNO: 12 和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14和具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNPrs707497 的 SEQ ID N0:3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705的SEQ ID N0:5和具有SNP rsll956461的SEQ ID N0:6等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他10個SNP的排列或分組。
[0142]還優(yōu)選任何可能的11個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQID NO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11、或者具有 SNP rsl7168572 的 SEQ IDNO: 12 和具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14和具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNPrs707497 的 SEQ ID N0:3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705的 SEQ ID N0:5 和具有 SNP rsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ IDNO: 7和具有SNP rs7975838的SEQ ID NO:8等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他11個SNP的排列或分組。
[0143]還優(yōu)選任何可能的12個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNPrs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12 ；或者具有 SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有 SNP rs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNPrs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 和具有 SNP rsl6950705的 SEQ ID N0:5 和具有 SNP rsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ IDNO:7 和具有 SNP rs7975838 的 SEQ ID NO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有SNP rsl6913719的SEQ ID NO: 10等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他12個SNP的排列或分組。
[0144]還優(yōu)選任何可能的13個本發(fā)明的SNP的組合或組，例如具有SNP rs666247的SEQID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO: 2 和具有 SNP rs707497 的 SEQ ID NO: 3 和具有 SNP rsl7024172 的 SEQ ID NO:4 和具有 SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO:5 和具有 SNPrsll956461 的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838的 SEQ ID NO: 8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO: 9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ IDNO: 10 和具有 SNP rsl 1497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12 和SEQ ID NO: 13;或者 SNP rsl6933412 和具有 SNP rsl6864505 的 SEQ ID NO: 14 和具有 SNPrs666247 的 SEQ ID NO:1 和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO:2 和具有 SNP rs707497 的SEQ ID NO:3和具有SNP rsl7024172 的 SEQ ID N0:4和具有SNP rsl6950705 的 SEQ ID NO: 5和具有 SNP rsl 1956461 的 SEQ ID NO:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID NO:7 和具有 SNPrs7975838 的 SEQ ID NO: 8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO: 9 和具有 SNP rsl6913719的 SEQ ID NO: 10 和具有 SNP rsll497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQID NO: 12等。還設(shè)想所提到的SNP的所有其他13個SNP的排列或分組。[0145]還優(yōu)選所有14個本發(fā)明的SNP的組合或組，即具有SNP rs666247的SEQ ID NO:1和具有 SNP rsl2707034 的 SEQ ID NO:2 和具有 SNPrs707497 的 SEQ ID N0:3 和具有 SNPrsl7024172 的SEQ ID N0:4和具有SNP rsl6950705 的 SEQ ID N0:5和具有SNP rsll956461的 SEQ ID N0:6 和具有 SNP rs609539 的 SEQ ID N0:7 和具有 SNP rs7975838 的 SEQ IDNO:8 和具有 SNP rsl2063296 的 SEQ ID NO:9 和具有 SNP rsl6913719 的 SEQ ID NO: 10 和具有 SNP rsll497898 的 SEQ ID NO: 11 和具有 SNP rsl7168572 的 SEQ ID NO: 12 和具有SNP rsl6933412 的 SEQ ID NO: 13 和具有 SNPrsl6864505 的 SEQ ID NO: 14。
[0146]在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸或者核酸的集合或組，和/或相應(yīng)的SNP作為β地中海貧血的標(biāo)記，其中所述組或集合至少包含:
[0147](i)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；和/或
[0148](ii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；和/或
[0149](iii) SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；和/或
[0150](iv) SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；和/或
[0151](V)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；和/或
[0152](Vi)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID N0:6,除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；和/或
[0153](vii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ IDNO: 7，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；和/或
[0154](viii)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代 替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID N0:5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID N0:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ IDNO: 7，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；以及SEQ ID N0:8,除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 10，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO: 11，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 12，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；和/或
[0155](ix) SEQ ID NO: 8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；和/或
[0156](X)SEQ ID NO:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；和/或
[0157](Xi)SEQ ID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；和/或上文定義的SNP的組或組合中的任一個。特別優(yōu)選(i)、(ii)、(viii)、(ix)、(x)和(xi)的集合。
[0158]在本發(fā)明的具體實施方案中，任何上文提到的SNP的組或集合或組合還可以與額外的標(biāo)記組合，例如本文所定義的相同染色體上的單倍型或單倍型類群(haplogroup)的SNP，例如在實施例2或表6中，或者在圖6中，或者在上文提到的包括在單倍型中的SNP的組。SNP的組或集合或組合還可以與獨立的標(biāo)記組合，例如表型標(biāo)記如血液相關(guān)標(biāo)記，例如對象的血容量、血紅蛋白A2的分?jǐn)?shù)、血紅蛋白A的分?jǐn)?shù)、基因組序列信息或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的β地中海貧血的其他合適的標(biāo)記。 [0159]在本發(fā)明的其他具體實施方案中，上文定義的組，特別是集合(i)至(Xi)可以表現(xiàn)出在單一對象的一個或兩個等位基因處的指示核苷酸。
[0160]在另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測或診斷對象的β地中海貧血的方法，所述方法包括以下步驟:
[0161](C)從對象樣品分離核酸
[0162](d)確定在如上文定義的一個或多個多態(tài)位點處存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)；
[0163]其中如上文定義的指示核苷酸的存在指示β地中海貧血的存在。
[0164]如本文所用，術(shù)語“檢測β地中海貧血”表示可以確定在人中存在β地中海貧血。該術(shù)語還包括檢測或鑒定β地中海貧血攜帶者狀態(tài)，這可以是表型上不明顯的，或者與諸如輕度貧血等的癥狀相關(guān)。
[0165]如本文所用，術(shù)語“診斷β地中海貧血”表示可以在人中鑒定β地中海貧血。該術(shù)語特別指鑒定這樣的情況，其中對象實際上患有疾病癥狀或者表現(xiàn)出疾病的表型，即例如患有貧血。
[0166]如本文所用，術(shù)語“確定在多態(tài)位點的核苷酸序列”指任何合適的方法或技術(shù)，其檢測位于包含SEQ ID NO: 1-14的任一個或者任何集合或組的位置501的核苷酸的性質(zhì)。這種確定方法可以主要是測序技術(shù)或者基于互補(bǔ)核酸結(jié)合的技術(shù)。
[0167]如本文所用，術(shù)語“確定在多態(tài)位點存在的分子結(jié)構(gòu)”指檢測位于包含SEQ IDNO: 1-14的任一個或者任何集合或組的位置501的核苷酸的性質(zhì)的可選方法，例如通過核酸的結(jié)構(gòu)或三維特性等。
[0168]在確定位于包含SEQ ID NO: 1-14的任一個或者任何集合或組的位置501的核苷酸的性質(zhì)時，可能遇到不同情況，最典型的情況是:
[0169](a)分析的SEQ ID NO: 1_14中任一個的位置501表現(xiàn)出如上文定義的野生型核苷酸，在這種情況下，可以排除β地中海貧血的存在。因此，任何可能的進(jìn)一步的癥狀可以歸因于不同的疾病或病癥，例如不同的貧血。
[0170](b)分析的SEQ ID NO: 1_14中的一些的位置501，例如在上文定義的組之一中，表現(xiàn)出野生型核苷酸，而一個或一個以上，或者可能全部SEQ ID NO: 1-14在所述位置表現(xiàn)出指示核苷酸，在這種情況下，可以給出β地中海貧血的存在。
[0171](C)分析的SEQ ID NO: 1_14中的一些的位置501，例如在上文定義的組之一中，在一個或一個以上，或者可能在全部SEQ ID NO: 1-14中在所述位置表現(xiàn)出指示核苷酸，而在其他組成員中，存在野生型核苷酸或者與野生型或指示核苷酸均不同的核苷酸；在這種情況下，也可以給出β地中海貧血的存在。
[0172](d)分析的SEQ ID NO: 1_14中的任一個的位置501表現(xiàn)出不是如上文定義的指示核苷酸的核苷酸；這個核苷酸可以是與野生型核苷酸不相同的不同核苷酸，但是還與如本文定義的指示核苷酸不相同；在這種情況下，不可以排除β地中海貧血的存在。因此可以考慮任何可能的進(jìn)一步的癥狀。而且額外的檢測步驟、進(jìn)一步的遺傳分析等可能是必需的，以便確定對象的健康狀況，即以便證實對象的確患有β地中海貧血。
[0173](e)分析的SEQ ID NO: 1_14中的一些的位置501表現(xiàn)出不是如上文定義的指示核苷酸的核苷酸；這個核苷酸可以是與野生型核苷酸不相同的不同核苷酸，但是還與如本文定義的指示核苷酸不相同，而在其他組成員中存在野生型核苷酸；在這種情況下，還是不可以排除β地中海貧血的存在。因此可以考慮任何可能的進(jìn)一步的癥狀。而且額外的檢測步驟、進(jìn)一步的遺傳分析等可能是必需的，以便確定對象的健康狀況，即以便證實對象的確患有β地中海貧血。
[0174]根據(jù)上述情況(a)-(e)可以確定β地中海貧血的存在。在具體實施方案中，測試可以重復(fù)例如1、2、3、4或5次或更多次。此外，在不清楚或不確定的結(jié)果時，例如基于僅一個目前描述的SNP的使用，可以分析擴(kuò)大組的SNP，例如待分析的SNP的集合可以增加1、2、
3、4、5、6、7、10 個等。
[0175]在另一特別優(yōu)選的實施方案中，上述方法是檢測或診斷對象的輕度β地中海貧血的方法。因此，如上文定義的情況(a)-(e)的檢測可以與對象中輕度地中海貧血的存在，或者不存在這種疾病和/或可能存在不同的相似的病癥如不同的貧血相關(guān)。
[0176]如本文所用，“對象的樣品”可以是來源于對象身體的任何合適的部分(part)或部分(portion)的任何樣品。在一實施方案中，樣品可以來源于純組織或器官或細(xì)胞類型，或者來源于非常特異性的位置，例如僅包含一種類型的組織、細(xì)胞或器官。在其他實施方案中，樣品可以來源于組織、器官、細(xì)胞的混合物，或者來源于它們的片段。例如，樣品可以獲得自器官或組織如胃腸道、陰道、胃、心臟、舌、胰、肝、肺、腎、皮膚、脾、卵巢、肌肉、關(guān)節(jié)、腦、前列腺、淋巴系統(tǒng)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的器官或組織。在本發(fā)明的其他實施方案中，樣品可以來源于體液，例如來源于血液、血清、唾液、尿、糞便、精液(ejaculate)、淋巴液等。在本發(fā)明的一特別優(yōu)選的實施方案中，上文提到的樣品是組織、器官、細(xì)胞和/或它們的片段的混合物，或者組織或器官特異性樣品，例如來自陰道組織、舌、胰、肝、脾、卵巢、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織、腫瘤組織的組織活檢樣品，或者體液、血液、血清、唾液或尿。優(yōu)選使用血液樣品。
[0177]特別優(yōu)選采用血液樣品，其包含含有DNA的細(xì)胞，例如非成熟的紅細(xì)胞、紅細(xì)胞前體細(xì)胞、白細(xì)胞等。還設(shè)想使用骨髓細(xì)胞、紅細(xì)胞生成細(xì)胞等。在本發(fā)明的上下文中使用的樣品應(yīng)當(dāng)優(yōu)選以臨床可接受的方式采集，更優(yōu)選以保留核酸或蛋白的方式采集。 [0178]在具體實施方案中，血液樣品可以用于不同類型的分析，例如基于DNA的SNP分析以及血液組分、血紅蛋白鏈濃度等的分析。[0179]在本發(fā)明的其他實施方案中，樣品可以包含一種或一種以上細(xì)胞，例如一組組織學(xué)或形態(tài)學(xué)上相同或相似的細(xì)胞，或者組織學(xué)或形態(tài)學(xué)上不同的細(xì)胞的混合物。優(yōu)選使用組織學(xué)上相同或相似的細(xì)胞，例如源于身體的一個有限區(qū)域。
[0180]在一具體實施方案中，樣品可以在不同時間點獲得自相同對象，獲得自相同對象的不同器官或組織，或者在不同時間點獲得自相同對象的不同器官或組織。例如，可以采用特定組織的樣品或者相同組織或器官的鄰近區(qū)域的一個或多個樣品。
[0181]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述確定核苷酸序列可以通過等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析、引物延伸測定、iPLEX SNP基因型分型、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)基因型分型、使用分子信標(biāo)、四引物ARMS PCR、游離內(nèi)切核酸酶侵入測定、寡核苷酸連接酶測定、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、定量實時PCR測定、基于SNP微陣列的分析、限制性酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、靶向重新測序分析和/或全基因組測序分析來進(jìn)行。
[0182]如本文所用，術(shù)語“等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析”指在斑點印跡測定中，或者可選地，在DNA印跡測定中采用一小段合成DNA，其通常與多態(tài)靶位點的序列互補(bǔ)。等位基因特異性寡核苷酸可以是長度為15-21個堿基的寡核苷酸，例如跨越SEQID NO: 1-14或其互補(bǔ)序列的位置501周圍的15-21個核苷酸。ASO長度可以變化，可以選自兩條核酸鏈的任一個，并且其在斑點印跡或DNA印跡中的結(jié)合特異性可以通過合適的緩沖液、雜交或洗滌條件來改變，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。ASO可以用任何合適的標(biāo)記來標(biāo)記，例如用放射性、酶促或熒光標(biāo)簽。 [0183]如本文所用，術(shù)語“引物延伸測定”指一種兩步法，首先包括將探針雜交至緊接多態(tài)核苷酸上游的堿基，然后進(jìn)行半測序反應(yīng)，其中DNA聚合酶通過添加與多態(tài)核苷酸互補(bǔ)的堿基來延伸雜交的引物。隨后可以檢測摻入的堿基，并且因此可以確定SNP等位基因。引物延伸法可以用于其他測定形式，例如包括MALD1-T0F質(zhì)譜分析法和ELISA樣方法的檢測技術(shù)。
[0184]如本文所用，術(shù)語“iPLEX SNP基因型分型”指一種包括使用MassARRAY質(zhì)譜儀和延伸探針的方法，其以這樣的方式設(shè)計，40個不同的SNP測定可以在PCR混合物中擴(kuò)增和分析。延伸反應(yīng)優(yōu)選使用ddNTP，并且SNP等位基因的檢測通常依賴于延伸產(chǎn)物的實際質(zhì)量。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0185]術(shù)語“動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)基因型分型”指這樣的技術(shù)，其利用錯配堿基對的不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的DNA解鏈溫度的差異。優(yōu)選地，在第一步中，可以通過PCR反應(yīng)例如用生物素化的引物將基因組片段擴(kuò)增并連接至珠。在第二步中，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至鏈霉抗生物素蛋白柱并洗滌，例如優(yōu)選用NaOH洗滌，以便去除未生物素化的鏈。隨后，可以在結(jié)合至雙鏈DNA時發(fā)熒光的分子的存在下加入等位基因特異性的寡核苷酸。隨后可以在溫度升高時測量強(qiáng)度，直至可以確定Tm。SNP通常會導(dǎo)致比預(yù)期低的Tm。在一優(yōu)選實施方案中，該方法可以在自動化的基礎(chǔ)上進(jìn)行。
[0186]如本文所用，術(shù)語“使用分子信標(biāo)”指通過使用特別設(shè)計的包含在每一端的互補(bǔ)區(qū)和位于其間的探針序列的單鏈寡核苷酸探針來檢測多態(tài)性。這種設(shè)計通常允許探針采取發(fā)夾結(jié)構(gòu)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。探針可以優(yōu)選在一端包含熒光團(tuán)且在另一端包含熒光猝滅劑，并且在某些實施方案中工程化，從而僅探針序列與測定中使用的基因組DNA互補(bǔ)。如果分子信標(biāo)的探針序列遇到其靶DNA，其會退火、雜交和發(fā)熒光。但是，如果探針序列遇到具有非互補(bǔ)核苷酸的修飾的靶序列時，分子信標(biāo)可以優(yōu)選保持其自然發(fā)夾狀態(tài)并且不可以觀察到熒光，從而允許區(qū)分野生型情況及其修飾。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可以使用一種以上這樣的分子信標(biāo)，例如一種野生型序列的分子信標(biāo)，以及另一種包括指示核苷酸的序列的分子信標(biāo)。從而至少可以確定野生型核苷酸和指示核苷酸的存在。
[0187]如本文所用，術(shù)語“四引物ARMS PCR”指包括兩對引物以在一個PCR反應(yīng)中擴(kuò)增兩個等位基因的方法。通常這樣設(shè)計引物，從而兩對引物對在多態(tài)位點或SNP位置重疊，但是各自優(yōu)選僅匹配一種可能的SNP。結(jié)果，如果給定等位基因存在于PCR反應(yīng)中，則引物可以特異性配對至該等位基因，并且隨后可以產(chǎn)生產(chǎn)物，但是不可以特異性配對至具有不同SNP的等位基因。在其他實施方案中，兩對引物對還這樣設(shè)計，從而它們的PCR產(chǎn)物具有顯著不同的長度，例如允許通過凝膠可以容易地區(qū)分的條帶。
[0188]如本文所用，術(shù)語“游離內(nèi)切核酸酶侵入測定”指使用片段內(nèi)切核酸酶裂解酶，其與兩個特異性寡核苷酸探針組合，所述兩個特異性寡核苷酸與靶DNA —起可以形成所述裂解酶識別的三分結(jié)構(gòu)。第一個探針，即侵入寡核苷酸優(yōu)選與靶DNA的3’端互補(bǔ)。侵入寡核苷酸的最后一個堿基可以是與靶DNA中的SNP核苷酸重疊的非匹配堿基。第二個探針可以是等位基因特異性的探針，其與靶DNA的5’端互補(bǔ)，但是還可以延伸通過SNP核苷酸3’ 一偵U。等位基因特異性的探針可以包含與SNP核苷酸互補(bǔ)的堿基。如果靶DNA包含期望的等位基因，則侵入探針和等位基因特異性的探針可以結(jié)合至靶DNA，形成三分結(jié)構(gòu)。隨后裂解酶可以切割并釋放等位基因特異性的探針的3’端。在優(yōu)選的實施方案中，侵入測定可以與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)系統(tǒng)結(jié)合以檢測切割事件。
[0189]如本文所用，術(shù)語“定量實時PCR測定”指優(yōu)選用Taqman酶或相似活性，同時用PCR反應(yīng)進(jìn)行的測定，其中結(jié)果可以在PCR反應(yīng)進(jìn)行時實時讀取。該測定通常需要會擴(kuò)增包括多態(tài)位點的區(qū)域的正向和反向PCR引物，優(yōu)選結(jié)合在SEQ ID NO: 1-14中任一個的位置501的5’或3’區(qū)域中的引物。在具體實施方案中，等位基因區(qū)分還可以利用FRET聯(lián)合雜交至SNP多態(tài)位點的一個或兩個等位基因特異性探針來完成。所述探針可以具有連接至它們的5’端的熒光團(tuán)和連接至它們的3’端的猝滅劑分子。當(dāng)探針完整時，猝滅劑可以保持靠近熒光團(tuán)，消除熒光團(tuán)的信號。在PCR擴(kuò)增步驟期間，如果等位基因特異性的探針優(yōu)選與SNP等位基因互補(bǔ)，則其可以結(jié)合至靶DNA鏈，然后在Taq聚合酶從PCR引物延伸DNA時通過Taq聚合酶的5’ -核酸酶活性降解。如果等位基因特異性的探針不完全互補(bǔ)，則其可以具有較低的解鏈溫度且不高效結(jié)合。
[0190]如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸連接酶測定”指DNA連接酶催化的酶促反應(yīng)，其可以用來通過在SNP多態(tài)位點上直接雜交兩個探針來搜尋SNP，其中如果探針與靶DNA相同，則連接可以發(fā)生。通常，設(shè)計兩個探針:等位基因特異性的探針，其雜交至靶DNA，從而其3’堿基直接位于SNP核苷酸上；以及第二探針，其雜交SNP多態(tài)位點上游(在互補(bǔ)鏈中下游)的模板，為連接反應(yīng)提供5’端。隨后可以通過凝膠電泳、MALD1-T0F質(zhì)譜分析法或者通過毛細(xì)管電泳來檢測連接或未連接的產(chǎn)物。
[0191]如文本所用，術(shù)語“PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析”指這樣的方法，其能夠鑒定DNA單鏈中的序列變異，所述DNA長度通常為150-250個核苷酸。該方法是基于單鏈DNA(ssDNA)折疊為三級結(jié)構(gòu)這一事實。構(gòu)象通常是序列依賴性的，并且大多數(shù)單堿基對突變會改變結(jié)構(gòu)的形狀。當(dāng)應(yīng)用于凝膠時，三級形狀可以決定ssDNA的遷移率，這提供區(qū)分多態(tài)等位基因的機(jī)制。在優(yōu)選的實施方案中，該方法首先包括靶DNA的PCR擴(kuò)增?？梢岳眉訜岷图兹㈦p鏈PCR產(chǎn)物變性以產(chǎn)生ssDNA?？梢詫sDNA應(yīng)用于非變性電泳凝膠并允許其折疊為三級結(jié)構(gòu)。
[0192]如本文所用，術(shù)語“基于SNP微陣列的分析”指采用高密度寡核苷酸SNP陣列，其包含例如100、1000或超過10000個排列在芯片上的探針，允許同時識別許多SNP。靶DNA可以雜交至該陣列，優(yōu)選通過使用一些冗余探針以識別每個SNP。在具體實施方案中，可以設(shè)計探針以具有在幾個不同位置中的SNP位點以及包含對SNP等位基因的錯配。在其他實施方案中，靶DNA對這些冗余探針中的每一個的雜交的差異量還可以允許確定純合和雜合等位基因，例如檢測SEQ ID NO: 1-14的等位基因的一個或兩個是否表現(xiàn)出指示序列。本發(fā)明還設(shè)想的SNP微陣列的實例是Affymetrix Human SNP5.0GeneChip 。
[0193]如本文所用，術(shù)語“限制性酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分析”指對基因組樣品進(jìn)行消化并確定片段長度，例如通過凝膠測定，允許確定酶是否在預(yù)期的限制性位點切割。RFLP分析可以優(yōu)選在SEQ ID NO: 1-14中任一個的位置501周圍的PCR擴(kuò)增片段的基礎(chǔ)上進(jìn)行。相應(yīng)的引物結(jié)合位點和長度可以根據(jù)合適的限制性位點的可用性來確定。
[0194]如本文所用，術(shù)語“靶向重新測序分析”指捕獲和測序所關(guān)注的區(qū)域，其中捕獲可以在溶液中或者在陣列上，并且測序可以通過任何第一代、第二代或第三代測序平臺來進(jìn)行。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)和特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0195]如本文所用，術(shù)語“全基因組測序分析”指基于高通量測序技術(shù)，例如新一代測序技術(shù)如焦磷酸測序(pyrosequencing),確定對象的整個基因組的序列，優(yōu)選多態(tài)位點的兩個等位基因的序列。在某些實施方案中，該技術(shù)還可以用于部分基因組的測序，例如所關(guān)注的小區(qū)域的測序。在優(yōu)選的實施方案中，這種技術(shù)還可以用于確定染色體區(qū)域中或特定染色體上的單倍型或單倍型類群。
[0196]在本發(fā)明的其他實施方案中，檢測或診斷β地中海貧血的方法可以包括一個或多個額外的步驟，所述步驟涉及確定血液結(jié)構(gòu)、血容量、血液組分、血液組分或因子的存在或濃度，確定血液參數(shù)，確定血液化合物濃度，確定血紅蛋白濃度或行為等。這些步驟可以包括從對象采集樣品，或者分析以前取自對象的樣品。上述步驟具體還可以包括與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與健康狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)或值進(jìn)行比較。
[0197]特別優(yōu)選確定樣品中的Hb Α2濃度。對于確定Hb Α2濃度，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法或手段。
[0198]優(yōu)選地，確定Hb Α2濃度可以通過HPLC、微量色譜、等電聚焦或毛細(xì)管電泳，或者它們的混合物，或者未知的任何其他合適的方法來進(jìn)行。此外，用一種手段獲得的結(jié)果可以優(yōu)選用另一種方法來證實。特別優(yōu)選使用catio-交換HPLC，其允許定量和定性的血紅蛋白分析，導(dǎo)致Hb A2濃度的高效測量。
[0199]在確定Hb A2濃度時，如果獲得約2%_3.2%的Hb A2值，則可以認(rèn)為對象處于健康狀態(tài)。優(yōu)選地，這個濃度可以指示對象沒有β地中海貧血，并且對象不是β地中海貧血攜帶者。
[0200]在確定Hb Α2濃度時，如果獲得超過約3.2%，例如約3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%或3.8%-約7%的Hb Α2值，則可以認(rèn)為對象患有β地中海貧血。此外，這個濃度可以指示對象為β地中海貧血攜帶者。
[0201]在具體實施方案中，例如，如果遇到多態(tài)性不在野生型或指示SNP的集合內(nèi)，Hb Α2值可以用來修改通過SNP分析獲得的結(jié)果，或者如果在較大的組中，僅非常少的SNP表現(xiàn)出指示狀態(tài)，而大部分表現(xiàn)出野生型，用來證實結(jié)果。
[0202]在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案中，上文提到的方法可以與分子功能分析步驟組合。例如，在其中可以顯示SNP與特定分子模式相關(guān)的情況下，可以額外地分析相應(yīng)的分子模式以提高所述方法的診斷值。如本文所用，術(shù)語“分子模式”指任何合適的分子或功能狀態(tài)，例如功能基因組狀態(tài)，其與本發(fā)明的一個或多個SNP相關(guān)。
[0203]在本發(fā)明的一特別優(yōu)選的實施方案中，上述方法可以包括確定在SEQ ID Ν0:8和SEQ ID NO:9的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，聯(lián)合檢測SEQ ID NO:8的基因組附近、SEQ ID NO:9的基因組附近或者SEQ ID Ν0:8和SEQ ID Ν0:9的基因組附近的DNAse高敏感性位點。在這個實施方案的上下文中使用時，術(shù)語“基因組附近”指關(guān)于SEQID Ν0:8或SEQ ID Ν0:9的序列的基因組定位，在上文所示的區(qū)域的約0.75kb、lkb、l.5kb、2kb、2.5kb、3kb、4kb、5kb或更多或其間的任何值的區(qū)域。
[0204]如本文所用，術(shù)語“DNAse高敏感性位點”指染色質(zhì)的短區(qū)域，其中基因組的核小體結(jié)構(gòu)可以不以通常的方式組織，這可以導(dǎo)致與成批的染色質(zhì)相比對酶攻擊的敏感性的顯著增加。優(yōu)選地，這樣的DNAse高敏感性位點可以通過其對DNase I和/或其他核酸酶如DNase II或微球菌核酸酶切割的超級敏感性來檢測。
[0205]在本發(fā)明的具體 實施方案中，因此DNase KDNase II和/或微球菌核酸酶或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他合適的酶可以用于分析獲得自對象的基因組DNA，例如來源于如上文所述的樣品的基因組DNA。
[0206]在如上文定義的與SEQ ID NO: 8、或者與SEQ ID NO: 9、或者與SEQ ID NO: 8和SEQID NO:9相關(guān)的SNP內(nèi)的指示核苷酸的存在下，并且如上文所提到的，在相應(yīng)的SNP附近，即在SEQ ID NO:8的基因組附近、在SEQ ID NO:9的基因組附近、或者在SEQ ID N0:8和9的基因組附近存在DNAse高敏感性位點，則可以認(rèn)為對象患有β地中海貧血。
[0207]在其他具體實施方案中，本發(fā)明涉及包含化合物的藥物組合物，所述化合物能夠補(bǔ)償、減少或逆轉(zhuǎn)SEQ ID Ν0:8的基因組附近、SEQ ID Ν0:9的基因組附近、或者SEQ IDΝ0:8和SEQ ID NO:9的基因組附近的DNAse高敏感性。在一具體實施方案中，所述藥物組合物可以用于治療β地中海貧血。
[0208]在本發(fā)明的另一特別優(yōu)選的實施方案中，上述方法可以包括確定在SEQ ID NO:2和SEQ ID Ν0:4和SEQ ID NO: 13的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，聯(lián)合檢測SEQ ID Ν0:2和/或SEQ ID Ν0:4和/或SEQ ID NO: 13的基因組附近的組蛋白3賴氨酸27三甲基化。在這個實施方案的上下文中使用時，術(shù)語“基因組附近”指關(guān)于SEQ ID Ν0:2或SEQ ID Ν0:4或SEQ ID NO: 13的序列的基因組定位，在上文所示的區(qū)域的約0.6kb、0.7kb、
0.75kb、0.8kb、0.9kb、lkb、l.25kb、l.5kb、l.75kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb 或更多或其間的任何值的區(qū)域。
[0209]術(shù)語“組蛋白3賴氨酸27三甲基化”指將甲基殘基加入人基因組DNA內(nèi)的組蛋白3分子的賴氨酸27。甲基化可以通過組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。通常，認(rèn)為在組蛋白3賴氨酸27處的三甲基化的作用為抑制標(biāo)記。[0210] 在本發(fā)明的具體實施方案中，可以使用組蛋白3賴氨酸27甲基化特異性的檢測系統(tǒng)，例如特異性抗體等，以便檢測SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 13的序列的基因組附近組蛋白3賴氨酸27三甲基化的存在。例如，獲得自對象樣品的基因組DNA可以直接用于檢測組蛋白3賴氨酸27三甲基化的特異性富集步驟。合適的方法和進(jìn)一步的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0211]在如上文定義的與SEQ ID N0:2、或者與SEQ ID N0:4、或者與SEQ ID NO: 13、或者與 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 13、或者 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 4、或者SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 13、或者 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 13 相關(guān)的 SNP 內(nèi)的指示核苷酸的存在下，并且如上文所提到的，在相應(yīng)的SNP附近，即在SEQ ID NO: 2的基因組附近、在SEQ ID N0:4的基因組附近、或者在SEQ ID NO: 13等的附近存在組蛋白3賴氨酸27三甲基化，則可以認(rèn)為對象患有β地中海貧血。
[0212]在其他具體實施方案中，本發(fā)明涉及包含化合物的藥物組合物，所述化合物能夠補(bǔ)償、減少或逆轉(zhuǎn)SEQ ID NO:2的相應(yīng)SNP附近、SEQ ID NO:4的基因組附近、或者SEQ IDNO: 13等的基因組附近的組蛋白3賴氨酸27三甲基化。在一具體實施方案中，所述藥物組合物可以用于治療β地中海貧血。
[0213]在其他具體實施方案中，本發(fā)明的其他SNP，例如上文定義的與SEQ ID N0:l、3、
5、6、7、10、11、12或14相關(guān)的SNP (其未表現(xiàn)出與所述SNP附近的基因或調(diào)控區(qū)的明顯功能關(guān)系)可以具有非編碼RNA的功能關(guān)系(Nardella C.et al., Curr Top MicrobiolImmunol.2010;347:135-68)。因此可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的方法的幫助下檢測相應(yīng)的非編碼RNA。在其他實施方案中，這類非編碼RNA及其抑制因子或激活因子可以用于改進(jìn)的檢測β地中海貧血的診斷方法，或者用于相應(yīng)的治療方法。
[0214]在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測或診斷對象的β地中海貧血的組合物，其包含如上文定義的一個或多個多態(tài)位點的核酸親和配體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測或診斷如上文定義的輕度β地中海貧血的組合物。
[0215]如本文所用，術(shù)語“核酸親和配體”指能夠結(jié)合如上文定義的多態(tài)位點的核酸分子。優(yōu)選地，所述親和配體能夠結(jié)合SEQ ID NO: 1-14的序列或其片段，所述片段包含如上文定義的多態(tài)位點，其中所述SEQ ID NO: 1-14的序列包含如上文所述的各自的指示核苷酸。在本發(fā)明的其他實施方案中，核酸親和配體還能夠特異性地結(jié)合與SEQ ID NO: 1-14的序列或其片段(包含如上文定義的多態(tài)位點)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 或 99.5% 或 99.6%,99.7%,99.8% 或 99.9% 相同的 DNA 序列，其中所述 SEQ ID NO: 1-14的序列包含如上文所述的各自的指示核苷酸，或者結(jié)合所述序列的任何片段。在本發(fā)明的其他實施方案中，本發(fā)明的核酸親和配體還能夠特異性地結(jié)合SEQ ID N0:l-14的DNA序列，所述DNA序列包含如上文定義的多態(tài)位點，即結(jié)合不含如上文所述的各自的指示核苷酸的野生型序列。在本發(fā)明的其他實施方案中，核酸親和配體還能夠特異性地結(jié)合與SEQID NO: 1-14的序列(包含如上文定義的多態(tài)位點)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或99.5%或99.6%,99.7%,99.8%或99.9%相同的DNA序列，即結(jié)合不含如上文所述的各自的指示核苷酸的野生型序列或其片段。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合與SEQ ID NO: 1-14的序列互補(bǔ)的序列的核酸親和配體，所述序列包含如上文定義的多態(tài)位點、如上文定義的指示核苷酸，其可以包含或者可以不含指示核苷酸。[0216]在其他具體實施方案中，所述核酸親和配體可以是能夠特異性地結(jié)合SEQ IDNO: 1-14的SNP序列(例如指示序列或野生型序列)的短核酸分子,例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他合適的核酸形式。
[0217]在其他具體實施方案中，所述核酸親和配體可以包含技術(shù)人員已知的任何合適的功能組分，例如標(biāo)簽、突光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、染料、蛋白或抗體或肽的結(jié)合或識別位點、可用于PCR方法的另一段DNA、可用作限制性酶的識別位點的一段DNA等。核酸親和配體還可以以催化RNA的形式提供，所述催化RNA特異性地結(jié)合并切割包含本發(fā)明的SNP的序列，例如在多態(tài)位點的指示核苷酸或野生型核苷酸或不同的核苷酸。
[0218]在其他實施方案中，本發(fā)明設(shè)想核酸親和配體對，其中一個能夠特異性地結(jié)合SEQID NO: 1-14的野生型序列，而另一個能夠特異性地結(jié)合包含如上文定義的指示核苷酸的SEQ ID NO: 1-14的序列。這樣的核酸親和配體對可以通過例如差異標(biāo)記、不同的染料或者如本文所述的任何其他不同的功能性來進(jìn)一步區(qū)分。此外，可以提供超過兩對，例如對于SEQ ID NO: 1-14中的每一個，可以提供一對或其亞組，這也可以通過差異染料、標(biāo)記或其他功能性來區(qū)分。[0219]在其他具體實施方案中，本發(fā)明還涉及特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的非核酸親和配體。這類親和配體可以是肽、適配體樣元件、抗體、DNA基序識別蛋白如限制性酶，或者這些與核酸的組合。
[0220]本發(fā)明的組合物可以額外地包含檢測β地中海貧血所必需或可用的其他成分，例如緩沖液、dNTP、聚合酶、離子如二價陽離子或一價陽離子、雜交溶液等。
[0221]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的親和配體可以是特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，或者是特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。如本文所用，術(shù)語“特異于一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸”指長度為約12-38個核苷酸，優(yōu)選約15-30個核苷酸的核酸分子,優(yōu)選DNA分子。例如,所述寡核苷酸可以具有16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸的長度。這些分子優(yōu)選可以與指示核苷酸上或周圍的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸互補(bǔ)，但是包含與SEQ ID NO: 1-14相關(guān)的所述如上文定義的指示核苷酸的互補(bǔ)序列。在其他實施方案中，所述分子可以優(yōu)選可以與SEQ ID勵:1-14相關(guān)的如上文定義的多態(tài)位點上或周圍的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸互補(bǔ)，但是包含野生型序列。
[0222]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述如上文定義的寡核苷酸可以具有與包括如上文定義的本發(fā)明的SNP的指示核苷酸的序列互補(bǔ)的序列。在其他實施方案中，所述寡核苷酸還可以具有朝向所述包括如上文定義的本發(fā)明的SNP的指示核苷酸的序列的相反鏈的互補(bǔ)序列。
[0223]在其他實施方案中，本發(fā)明還涉及特異性地結(jié)合SEQ ID NO: 1_14的背景中如上文所示的多態(tài)位點附近的寡核苷酸分子。這些寡核苷酸可以設(shè)計為一對引物的形式，允許擴(kuò)增例如長度為 50bp、75bp、IOObp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、750bp、1000bp或更多且包括本發(fā)明的SNP的多態(tài)位點的DNA段。合適的序列信息可以來源于SEQ IDNO: 1-14的序列，上文所示的基因組序列定位，這允許技術(shù)人員從數(shù)據(jù)存儲庫如人基因組構(gòu)建37.1獲得必需的背景DNA序列。
[0224]如本文所用，術(shù)語“特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的探針”指DNA片段，其能夠特異性地結(jié)合本發(fā)明的多態(tài)位點。例如，所述探針可以這樣設(shè)計，從而其僅結(jié)合包含指示核苷酸的序列、或者野生型序列、或者其互補(bǔ)鏈。在其他實施方案中，所述探針能夠結(jié)合本發(fā)明的多態(tài)位點，即能夠結(jié)合如上文定義的野生型序列、包含指示核苷酸的序列或者在該位置的任何其他變體?？梢岳缭陔s交實驗中通過改變鹽的濃度、修改反應(yīng)溫度、向反應(yīng)加入其他合適的化合物等來進(jìn)一步調(diào)整探針的特異性。還可以這樣設(shè)計探針，從而其結(jié)合多態(tài)位點外部，例如在SEQ ID NO: 1-14的序列內(nèi)，或者其互補(bǔ)序列。
[0225]在其他實施方案中，本發(fā)明的探針可以與SEQ ID NO: 1_14的序列或其片段(包含如上文定義的多態(tài)位點)、與所述序列的任何片段、或者與如上文定義的相應(yīng)的野生型序列、或者與這些序列的互補(bǔ)序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或99.5%或99.6%,99.7%,99.8%或99.9%相同，其中所述SEQ ID NO: 1-14的序列包含如上文所述的各自的指示核苷酸。
[0226]本發(fā)明的探針可以具有任何合適的長度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300,500,1000或超過1000個核苷酸的長度。探針還可以是適當(dāng)修飾的，例如通過加入標(biāo) 記，如熒光標(biāo)記、染料、放射性標(biāo)記等。
[0227]在其他實施方案中，還可以將探針在功能上調(diào)整至如上文所述的方法。
[0228]在另一方面，本發(fā)明涉及如上文定義的核酸分子在檢測或診斷對象的β地中海貧血中的用途。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及如上文定義的核酸分子在檢測或診斷對象的輕度β地中海貧血中的用途。如上文定義的核酸分子可以用作相應(yīng)的檢測手段的模板，例如基于上文定義的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多態(tài)位點的親和配體，例如寡核苷酸或探針可以用于合適的方法以檢測在SEQ ID NO: 1-14的位置501處野生型或指示核苷酸的存在。在確定相應(yīng)的序列時，如本文所述可以證實或否認(rèn)β地中海貧血，優(yōu)選輕度β地中海貧血的存在。
[0229]在另一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及如上文定義的核酸分子在篩查對象的群體中β地中海貧血的存在中的用途。術(shù)語“篩查”指在整個地區(qū)、州或國家，大醫(yī)院和/或鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院和/或前哨戰(zhàn)中用檢測/診斷設(shè)備的較大規(guī)模的檢測項目。篩查可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)化方案進(jìn)行，例如基于相同的緩沖溶液、核酸分子、標(biāo)記試劑等的使用。篩查的結(jié)果可以在本地獲得，或者可以以地區(qū)、全州或全國的方式例如在合適的數(shù)據(jù)庫中在相應(yīng)的平臺等的基礎(chǔ)上整合。在其他實施方案中，篩查可以在醫(yī)療實踐中進(jìn)行，例如地區(qū)、州或全國。
[0230]在其他實施方案中，例如在鑒定了 β地中海貧血攜帶者的情況下，篩查方法可以通過遺傳咨詢步驟來補(bǔ)充。
[0231]在一特別優(yōu)選的實施方案中，可以對輕度β地中海貧血進(jìn)行篩查。在一特別優(yōu)選的實施方案中，可以對β地中海貧血攜帶者進(jìn)行篩查。
[0232]如本文所用，術(shù)語“群體”指相似對象的集合，例如生活在相同地區(qū)、州或國家的人，或者通過遺傳群體的其他典型特征鑒定的人。特別優(yōu)選來自南亞的對象的群體。更優(yōu)選印度群體。還設(shè)想亞群，例如北印度或南印度對象的亞群。
[0233]在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測或診斷對象的β地中海貧血的試劑盒，其包含特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，或者特異于上文定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸具有與如上文定義的指示核苷酸互補(bǔ)的序列。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，所述β地中海貧血是輕度β地中海貧血。在其他實施方案中，如上文定義的試劑盒可以包含輔助成分，例如PCR緩沖液、dNTP、聚合酶、離子如二價陽離子或一價陽離子、雜交溶液等。在其他實施方案中，所述試劑盒還可以包含輔助成分如第二親和配體，例如二抗，檢測染料，或者進(jìn)行核酸檢測所必需的其他合適的化合物或液體。這類成分以及進(jìn)一步的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以根據(jù)所進(jìn)行的檢測方法而變化。此外，所述試劑盒可以包含說明書和/或可以提供所獲得的結(jié)果的相關(guān)性的信息。
[0234]在另一優(yōu)選實施方案中，上文提到的的方法、組合物、用途和試劑盒涉及評價對象和/或?qū)ο蟮暮蟠邪l(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險。如本文所用，術(shù)語“評價發(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險”指對象在其生命期間發(fā)展β地中海貧血表型的個人風(fēng)險。例如，如果根據(jù)目前提供的方法，對象診斷為患有β地中海貧血，但是不表現(xiàn)出貧血或者僅表現(xiàn)出非常中等的貧血，可以推測在生命的以后幾十年中有發(fā)展更嚴(yán)重形式的貧血的風(fēng)險。這種推測可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的風(fēng)險因子相關(guān)。
[0235]如本文所用，術(shù)語“評價對象的后代發(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險”指如果對象診斷為β地中海貧血攜帶者，在下一代，即在對象的孩子中發(fā)展β地中海貧血如中間型β地中海貧血或重型β地中海貧血的風(fēng)險。因此例如在如上文定義的篩查方法期間如果夫婦或家庭自己呈現(xiàn)出來，則可以計算該風(fēng)險。因此，如果兩者，男性和女性均診斷為β地中海貧血攜帶者，在可以認(rèn)為孩子可能發(fā)展β地中海貧血的風(fēng)險，特別是發(fā)展嚴(yán)重形式的β地中海貧血如中間型β地中海貧血或重型β地中海貧血的風(fēng)險升高。可以優(yōu)選將風(fēng)險評價加入家庭計劃或遺傳咨詢方法，這可以在醫(yī)院、專業(yè)醫(yī)療實踐或醫(yī)療活動期間提供。
[0236]為了說明目的提供以下實施例和圖。因此應(yīng)當(dāng)理解實施例和圖不應(yīng)理解為限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠清楚地設(shè)想本文列出的原理的進(jìn)一步的修改。
[0237]實施例
[0238]實施例1-SNP的鑒定
[0239]對于SNP的鑒定，進(jìn)行以下實驗步驟:
[0240]1.基于許多參數(shù)選擇樣品,所述參數(shù)包括:
[0241]a.種族-樣品采集自南印度人群
[0242]b.性別
[0243]c.年齡
[0244]d.樣品類型-血液樣品采集自對象(健康和患病的)
[0245]e.家族史
[0246]f.病史
[0247]選擇總計161個樣品，其中疾病樣品71個和對照樣品90個。
[0248]2.用“獨立的倫理委員會”批準(zhǔn)的“知情同意書”收集來自患者和對照的臨床病理信息。
[0249]3.從列出的對象采集血液樣品，利用高效液相色譜篩查β地中海貧血性狀(結(jié)果如圖1所示)，并且利用Affymetrix推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增。該研究的總方案在圖2中給出。
[0250]4.利用Affymetrix全基因組人SNP陣列6.0，在71個患有β地中海貧血的對象和90個對照中的906，000個SNP上產(chǎn)生基因型。從SNP6.0陣列產(chǎn)生數(shù)據(jù)所涉及的步驟包括(Affymetrix的標(biāo)準(zhǔn)方案):
[0251]a.基因組DNA板制備:將人基因組DNA的濃度定量，并且相應(yīng)地，利用還原的TE(Tris-乙二胺四乙酸緩沖液將每個樣品稀釋至50ng/l.! I。
[0252]表1:
【權(quán)利要求】
1.一種分離的核酸分子,其選自: (i)SEQID NO:1 [rs666247]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替； (ii)SEQID N0:2[rsl2707034]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替； (iii)SEQID NO: 3 [rs707497]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替； (iv)SEQ ID N0:4[rsl7024172]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替； (v)SEQID N0:5[rsl6950705]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替； (Vi)SEQ ID NO:6[rsll956461]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替； (vii)SEQID NO: 7 [rs609539]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替； (viii)SEQID NO:8[rs7975838]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替； (ix)SEQID N0:9[rsl2063296]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替； (x)SEQID N0:10[rsl6913719]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替； (xi)SEQID NO:ll[rsll497898]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替； (xii)SEQID NO:12[rsl7168572]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替； (xiii)SEQID NO:13[rsl6933412]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及 (xiv)SEQID N0:14[rsl6864505]，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13個或全部的包含所述指示核苷酸的所述多態(tài)的改變的序列組構(gòu)成β地中海貧血的標(biāo)記，優(yōu)選輕度β地中海貧血的標(biāo)記。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸或核酸的集合，其中所述組至少包含: (i)SEQID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；或者 (ii)SEQID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C 代替；或者 (iii)SEQID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；或者 (iv)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；或者 (V)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者 (Vi)SEQ ID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者 (vii)SEQID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:7，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；或者 (viii)SEQID NO: 1，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 3，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 5，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO: 6，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO:7,除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸G被指示核苷酸A代替；以及SEQID NO:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 10，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；以及SEQ ID NO: 11，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 12，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者 (ix)SEQID NO:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO: 14，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸C被指示核苷酸T代替；或者 (x)SEQID NO:8，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID NO:9，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；或者 (xi)SEQID NO:2，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替；以及SEQ ID N0:4，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸A被指示核苷酸G代替；以及SEQ ID NO: 13，除了在位置501處的單一多態(tài)性改變，其中野生型核苷酸T被指示核苷酸C代替。
4.在對象中檢測或診斷β地中海貧血,優(yōu)選輕度β地中海貧血的方法,所述方法包括以下步驟: (a)從對象樣品分離核酸 (b)確定在權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點處存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)； 其中權(quán)利要求1-3中任一項定義的指示核苷酸的存在指示β地中海貧血的存在。
5.權(quán)利要求4的方法，其中通過等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析、引物延伸測定、iPLEX SNP基因型分型、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)基因型分型、使用分子信標(biāo)、四引物ARMS PCR、游離內(nèi)切核酸酶侵入測定、寡核苷酸連接酶測定、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、定量實時PCR測定、基于SNP微陣列的分析、限制性酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、靶向重新測序分析和/或全基因組測序分析來進(jìn)行所述核苷酸序列的確定。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述方法包括確定樣品中的HbA2濃度的額外步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過HPLC、微量色譜、等電聚焦或毛細(xì)管電泳來進(jìn)行所述HbA2濃度的確定。
8.權(quán)利要求4-7中任一項的方法，其中所述樣品是組織、器官、細(xì)胞和/或其片段的混合物，或者組織或器官特異性樣品，例如來自陰道組織、舌、胰、肝、脾、卵巢、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織、腫瘤組織的組織活檢樣品，或者體液、血液、血清、唾液或尿，優(yōu)選血液。
9.權(quán)利要求4-8中任一項的方法，其包括確定在SEQID N0:8和SEQ ID N0:9的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，以及檢測SEQ ID N0:8和/或SEQ ID NO:9的基因組附近的DNAse高敏感性位點，其中權(quán)利要求1-3中任一項定義的指示核苷酸的存在以及所述DNAse高敏感性位點的存在指示β地中海貧血的存在。
10.權(quán)利要求4-8中任一項的方法，其包括確定在SEQID NO:2, SEQ ID Ν0:4和SEQID NO: 13的多態(tài)位點存在的核苷酸序列和/或分子結(jié)構(gòu)，以及檢測SEQ ID N0:2和/或SEQID N0:4和/或SEQ ID NO: 13的基因組附近的組蛋白3賴氨酸27三甲基化，其中權(quán)利要求1-3中任一項定義的指示核苷酸的存在以及所述組蛋白3賴氨酸27三甲基化的存在指示β地中海貧血的存在。
11.用于在對象中檢測或診斷β地中海貧血，優(yōu)選輕度β地中海貧血的組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點的核酸親和配體。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述親和配體是特異于權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，優(yōu)選是具有與權(quán)利要求1-3中任一項定義的指不核苷酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸，或者是特異于權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。
13.權(quán)利要求1-3中任一項定義的核酸分子在檢測或診斷對象的β地中海貧血、優(yōu)選輕度β地中海貧血中的用途,或者在篩查對象的群體、優(yōu)選南亞對象的群體中β地中海貧血、優(yōu)選輕度β地中海貧血的存在中的用途。
14.用于在對象中檢測或診斷β地中海貧血、優(yōu)選輕度β地中海貧血的試劑盒，所述試劑盒包含特異于權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點的寡核苷酸，優(yōu)選是具有與權(quán)利要求1-3中任一項定義的指示核苷酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸，或者特異于權(quán)利要求1-3中任一項定義的一個或多個多態(tài)位點的探針。
15.權(quán)利要求4-10中任一項的方法，權(quán)利要求11或12的組合物，權(quán)利要求13的用途，或者權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述β地中海貧血的診斷包括評價對象和/或?qū)ο蟮暮蟠l(fā)展β地中海 貧血的風(fēng)險。
【文檔編號】C12Q1/68GK103649332SQ201280016846
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月6日
【發(fā)明者】S·V·卡達(dá)維爾, S·庫馬爾, R·辛格, N·迪米特羅娃 申請人:皇家飛利浦有限公司