乙酰輔酶a羧化酶除草劑抗性植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了產(chǎn)生對除草劑具有抗性的作物植物的組合物和方法。特別地，本發(fā)明提供了含有改變的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白，并對除草劑的抑制作用具有抗性的小麥植物、植物組織和植物種子，所述除草劑通常抑制ACCase蛋白的活性。
【專利說明】乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性植物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年2月I日提交的美國臨時申請N0.61/438，294和2011年10月31日提交的美國臨時申請N0.61/553830的優(yōu)先權，在此通過引用將上述申請以其全部并入本文之中。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明提供了產(chǎn)生對除草劑具有抗性的作物植物的方法和組合物。特別地，本發(fā)明提供了含有修飾的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白質，并對除草劑的抑制作用具有抗性的小麥植物、植物組織和植物種子，所述除草劑通常抑制ACCase蛋白的活性。
【背景技術】
[0004]小麥是全球種植和最具有廣泛適應性的谷物。普通小麥用于各種食品中，例如面包、餅干、蛋糕、薄脆餅干和面條。一般來說，將硬質小麥碾磨成面粉用于制作面包，而軟質小麥碾磨成面粉則用于糕點和餅干。小麥淀粉用于食品和造紙工業(yè)，如洗衣用淀粉，以及其他產(chǎn)品。
[0005]商業(yè)小麥生產(chǎn)的主要威脅是雜草競爭，這會導致谷物產(chǎn)量降低和質量低劣。雖然可以用耕作來消除雜草，但是經(jīng)耕種的土地的土壤易受到風和水的侵蝕。由于便于應用和有效性，除草劑處理是控制雜草的首選方法。在減少耕地或設計在土壤表面留下高水平殘留物以防止侵蝕的直播種植系統(tǒng)中，除草劑也可以進行雜草控制。小麥中最重要的雜草競爭來自于與其高度相關的草，例如野燕麥和具節(jié)山羊草，很難對這些與栽培作物相關的問題雜草種類設計有效的化學控制策略，這是因為它們往往具有相同的除草劑敏感性。為了解決這一問題，其中的一個方法是開發(fā)抗除草劑的品種。在這個系統(tǒng)中，在“作物中”施用除草劑以控制雜草，而不對除草劑耐受性的作物造成傷害。
[0006]植物中除草劑抗性的開發(fā)提供了重要的生產(chǎn)和經(jīng)濟優(yōu)勢；因此，使用除草劑來控制作物中的雜草或植物幾乎成為普遍慣例。然而，此類除草劑的使用也會造成所需作物植物的死亡或生長的降低，這使得除草劑應用的時間和方法相當關鍵或者在某些情況下根本是不可行的。
[0007]對于農(nóng)民而言,特別感興趣的是使用具有更大效力、廣雜草譜有效性和快速土壤降解的除草劑。通過允許使用除草劑來控制雜草生長并且沒有損害作物的風險，對這些化合物具有抗性的植物、植物組織和種子提供了具有吸引力的解決方案。廣譜除草劑的其中一類是那些能抑制植物中乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)活性的化合物。此類除草劑屬于芳氧基苯氧基丙酸酯類(FOP)和環(huán)己二酮類(DM)化學家族。例如，小麥對于許多靶向單子葉植物的ACCase抑制性除草劑是易感的，這使得幾乎不可能使用這些除草劑來控制禾本科雜草。
[0008]由于小麥在世界舞臺上作為作物植物的重要性，需要對ACCase除草劑的抑制效果具有抗性的小麥雜種，從而當使用除草劑來控制禾本科雜草時允許更大的作物產(chǎn)量。[0009]發(fā)明概沭
[0010]本發(fā)明提供了產(chǎn)生對除草劑具有抗性的作物植物的方法和組合物。特別地，本發(fā)明提供了含有突變的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白質，并對除草劑的抑制作用具有抗性的小麥植物、品種、品系和雜種、以及植物組織和植物種子，所述除草劑通常抑制ACCase蛋白的活性。
[0011]栽培小麥對許多靶向單子葉或禾本科雜草的ACCase抑制性除草劑是易感的。然而，如本文所述，創(chuàng)建了對ACCase抑制性除草劑表現(xiàn)出耐受性的小麥基因型。遺傳分析已經(jīng)在突變體小麥種質中鑒定出了導致ACCase除草劑抗性表型的遺傳差異。
[0012]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種或多種小麥植物，其種質包含能夠使植物對ACCase除草劑具有抗性的突變。此外，在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及所述植物雜交的后代(例如，F(xiàn)l，F(xiàn)2，F(xiàn)3等)，其中所述后代的種質具有與親本植物相同的突變。因此，本發(fā)明的實施方式提供了其種質中含有突變的小麥品種/雜種，因此該植物的表型是ACCase除草劑抗性的。在一些實施方式中，所述后代(例如，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3等)是良種小麥品系相互雜交的結果，其中所述良種小麥品系至少一種含有包含能使植物對ACCase除草劑具有耐受性的突變的種質。
[0013]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了小麥植物，其中所述小麥植物種質賦予對如下水平的一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑所致抑制作用的抗性，所述一種或多種除草劑的水平通常會抑制小麥植物生長。在一些實施方式中，所述一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑來自于芳氧基苯氧基丙酸酯類(FOP)和環(huán)己二酮類(DM)化學品家族。在一些實施方式中，所述賦予對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑所致抑制作用的抗性的小麥植物
種質包含在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC N0._)中所發(fā)現(xiàn)的乙酰輔酶A羧
化酶基因中的一個或多個突變。
`[0014]在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了控制小麥植物或植物種群附近的雜草的方法，包括:提供一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑，將一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑施用到包含小麥植物或小麥植物種群的農(nóng)田中，和控制所述小麥植物或植物種群附近的雜草，使得雜草的生長受到所述一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑的施用的不利影響，而所述小麥植物或其種群的生長沒有受到不利影響。在一些實施方式中，所述一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑來自于芳氧基苯氧基丙酸酯類(FOP)和環(huán)己二酮類(DM)化學家族。在一些實施方式中，所述小麥植物或小麥植物種群包含在AF28-A，AF26-B和/或AFlO-D (ATCC N0._)中所發(fā)現(xiàn)的乙酰輔酶A羧化酶基因中的一個或多個突變。
[0015]在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了小麥雜種、品系或品種，其中所述小麥雜種、品系或品種包含的種質包含乙酰輔酶A羧化酶基因中的一個或多個突變，以使得所述雜種、品系或品種被賦予對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑的抗性。在一些實施方式中，通過包含所述一種或多種突變的小麥種質的漸滲來創(chuàng)建所述的小麥雜種、品系或品種，所述突變賦予對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑的抗性。在一些實施方式中，通過摻入包含一個或多個突變的異源基因來創(chuàng)建所述的小麥雜種、品系或品種，所述突變賦予對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑的抗性。
[0016]在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑具有抗性的小麥雜種、品系或品種的方法，包括鑒定賦予所述除草劑抗性的種質，其中所述除草劑抗性種質衍生自除草劑抗性小麥植物，和將所述種質導入到良種小麥植物雜種、品系或品種中。在一些實施方式中，通過漸滲來將所述種質導入到所述良種小麥植物雜種、品系或品種中。在一些實施方式中，通過導入異源基因來將所述種質導入到所述良種小麥植物雜種、品系或品種中。
[0017]還是在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了小麥雜種、品系或品種，其中所述雜種、品系或品種的種質包含被賦予的對一種或多種乙酰輔酶A羧化酶除草劑的抗性，以及對來自一個或多個非乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的除草劑組中的一種或多種化合物的抗性。
[0018]還是在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了鑒定對乙酰輔酶A羧化酶除草劑具有抗性的小麥植物品系的方法，包括提供來自小麥植物的核酸樣品，提供擴增引物，用于擴增存在于所述核酸樣品中的對應于乙酰輔酶A羧化酶基因的小麥植物基因組區(qū)域，將所述擴增引物應用于所述核酸樣品，使得發(fā)生所述乙酰輔酶A羧化酶基因的所述區(qū)域的擴增，并基于所述擴增的核酸樣品中賦予乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性的一個或多個突變的存在來鑒定對乙酰輔酶A羧化酶除草劑具有抗性的小麥植物。
[0019]仍然在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了小麥種子，其中所述種子的所述種質包含突變的乙酰輔酶A羧化酶基因，所述突變賦予對乙酰輔酶A羧化酶除草劑所致抑制作用的抗性。在一些實施方式中，所述小麥種子的種質包含在AF28-A，AF26-B和/或
AFlO-D(ATCC NO:_)中所發(fā)現(xiàn)的突變體乙酰輔酶A羧化酶基因。在一些實施方式中，
本發(fā)明提供了由所述種子生長得到的小麥植物，以及進一步的包含由所述種子生長得到的小麥植物的植物部分。在一些實施方式中，乙酰輔酶A羧化酶基因是AF28-A，AF26-B和/
或AF10-D(ATCC NO:_)中所發(fā) 現(xiàn)的基因的功能性片段，該基因片段編碼的蛋白質片
段足以將對乙酰輔酶A羧化酶除草劑所致抑制作用的抗性賦予小麥植物。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了由所述種子生長得到的小麥植物，以及進一步的包含由所述種子生長得到的小麥植物的植物部分。
[0020]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了來自小麥的純化和分離的核酸序列，其編碼乙酰輔酶A羧化酶。根據(jù)本發(fā)明，從B、D和A基因組中鑒定出了編碼乙酰輔酶A羧化酶的野生型序列(分別為SEQ ID N0:l、2和3)。另外，每個基因組的提供乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性的突變已經(jīng)被鑒定出來，分別是SEQ ID N0:4、5和6。對于每個基因組，A基因組，(SEQ ID NO: 8)出基因組，(SEQ ID NO: 10)山基因組，(SEQ ID NO: 12)，該突變表示在氨基酸2004位置上的Ala向Val的改變(以標準黑草參考序列gi 1199600899 | emb | AM108429.1和 gi 1199600901 |emb|AM108430.1 為參考，SEQ ID No: 13、14、15 和 16，也見圖 9)。本發(fā)明還包括由這些序列編碼的氨基酸，包括SEQ ID N0:7、8、9、10、ll或12，以及保守性修飾的變體，和保留ACCase活性的片段及提供乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性的突變體。
[0021]因此，本發(fā)明的組合物包括分離的多肽，該多肽包含選自由以下組成的組中的氨基酸序列:(a)包含SEQ ID N0:7、9或11和SEQ ID N0:8、10或12的氨基酸序列和(b)與SEQ ID N0:7、9或11和SEQ ID NO:8、10或12具有至少90%、95%或99%序列相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有ACCase活性或提供對乙酰輔酶A羧化酶除草劑的抗性。
[0022]本發(fā)明還包括含有異源核苷酸序列的小麥植物，該核苷酸序列與SEQID N0:l、2、
3、4、5或6或者在4?28^?26-8和/或4?10-0(八了0: NO:_)中所發(fā)現(xiàn)的乙酰輔酶
A羧化酶序列具有至少70%同源性，至少80%同源性，至少85%同源性，至少90%同源性，至少95%同源性，至少97%同源性，或至少99%同源性。在一些實施方式中，所述乙酰輔酶A羧化酶序列編碼或包含一個或多個氨基酸取代，例如，在SEQ ID N0:8中發(fā)現(xiàn)的Ala2004Val，在SEQ ID NO: 10中發(fā)現(xiàn)的_，在SEQ ID NO: 12中發(fā)現(xiàn)的_。
[0023]在一個實施方式中，本發(fā)明還提供了具有由所述種子生長得到的所述小麥植物的所有生理學和形態(tài)學特征的小麥雜交植物。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了來自于所述小麥種子或所述小麥植物部分的組織培養(yǎng)物和再生組織培養(yǎng)物，所述小麥種子或所述小
麥植物部分包含在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC NO:_)中所發(fā)現(xiàn)的乙酰輔酶
A羧化酶基因中的突變。
[0024]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生小麥種子的方法，包括將包含突變體乙酰
輔酶A羧化酶基因(在AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D (ATCCN0:_)中所發(fā)現(xiàn))的植
物進行自交或與第二小麥植物進行雜交，從所述雜交中收集所述種子。在一些實施方式中，產(chǎn)生所述小麥種子的方法包括將親本種子小麥品系與親本授粉小麥品系一起種植，其中所述親本種子品系包含賦予乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性的種質，其中所述授粉系和/或種子品系的種質包含賦予乙酰輔酶A羧化酶除草劑抗性的種質，使所述親本種子和授粉小麥植物一起生長，使得所述親本授粉植物向所述親本種子植物授粉，并收集由所述授粉產(chǎn)生的種子。
[0025]在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了摻入了異源核苷酸構建體的遺傳修飾的小麥植物，該構建體包括可操作地連接到調控序列的SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6，例如表達盒，抑制構建體，植物，植物細胞和種子。本發(fā)明的遺傳修飾的植物、植物細胞和種子可能會表現(xiàn)出表型的改變，例如經(jīng)調控的ACCase或突變體ACCase水平。
[0026]提供了減少或消除·植物中ACCase多肽活性的方法，包括將選定的多核苷酸導入到所述植物中。在特定的方法中，提供所述多核苷酸降低植物中ACCase的水平。
[0027]還提供了在植物中組成型地或在具體調控的時間和組織中提高突變體ACCase多肽水平的方法，包括將選定的多核苷酸與合適的調控元件導入到植物中。在具體的方法中，突變體ACCase多核苷酸的表達提高植物對ACCase除草劑的耐受性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是所發(fā)現(xiàn)的第一種除草劑耐受植物的圖片。該植物在烯草酮除草劑的兩次致死施用下存活。
[0029]圖2是兩株M2親本的種子生長得到的M3植物的圖片。用兩個連續(xù)等級的致死劑量喹禾靈處理植物。左邊的植物在除草劑的兩個施用下存活，而右邊的植物在除草劑的一次施用后死亡。
[0030]圖3是劑量反應研究的圖片，其顯示，相比起未誘變的Hatcher冬小麥，M3代中所選擇的突變體植物對喹禾靈除草劑耐受性提高。1、3和4欄是所針對增高的除草劑耐受性選擇的植物；2欄是未誘變的Hatcher冬小麥。
[0031]圖4是來自A、B和D基因組的ACCase基因以及突變體AF28-A的ACCase基因、突變體AF26-B和突變體AFlO-D基因的序列。
[0032]圖5的圖像描述了用喹禾靈篩選的源自M2的M3突變體的肉眼可見的損傷。水平線以下的數(shù)值與未誘變的Hatcher檢查不同，由最左側的標尺代表。[0033]圖6的圖像描述了用喹禾靈進行的劑量響應試驗，其將未誘變的Hatcher對照(由最左側的標尺代表)與M2-所選擇的M3品系進行比較。
[0034]圖7的圖像展示了小麥A、B、D基因組中野生型和突變體ACCase序列的對比，包括每個突變體序列中新發(fā)現(xiàn)的一個非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0035]圖8的圖像顯示了隨著喹禾靈濃度的提高，ACCase酶耐受性的比較。
[0036]圖9顯示了將本發(fā)明的序列與黑草參考序列進行比對以及相互之間進行比對。
[0037]
[0038]為了提供對于說明書和權利要求書，包括此類術語的范圍的明確和一致的理解，提供了下述定義。以SI接受的形式來表示單位、前綴和符號。除非另有說明，核酸的5’至3’方向在書寫時是從左到右；氨基酸序列的氨基至羧基的方向在書寫時是從左至右。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字，并且包括在所定義范圍內的每個整數(shù)。本文中的氨基酸可以以它們公知的三個字母的符號或由IUPAC-1UB生化命名委員會所推薦的一個字母的符號來表示。同樣的，核苷酸也可以以它們公知認可的單字母代碼來表示。除非另有規(guī)定，本文所使用的軟件、電學和電子術語如The New IEEE Standard Dictionary of Electricaland Electronics Terms (第5版，1993)所定義。下面所定義的術語是參照說明書整體來進行更充分的定義。
[0039]術語“保守性修飾變體”適用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守性修飾變體是指那些編碼相同氨基酸序列或氨基酸序列的保守性修飾變體的核酸。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任意給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在用密碼子指定丙氨酸的每個位點，可將密碼子改變?yōu)樗枋龅娜我庀鄳艽a子，而不會改變編碼的多肽。這種核酸變體是“無義變體”，代表著一種保守性修飾變體。通過參照遺傳密碼子，本文中編碼多肽的每條核酸序列都描述了每種可能的核酸無義變體。本領域普通技術人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；以及UGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)都能被修飾以產(chǎn)生相同功能的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的每個無義變體都隱含在每個所描述的多肽序列中，也在本發(fā)明的范圍之內。
[0040]至于氨基酸序列，本領域普通技術人員將認識到，在編碼序列中改變、添加或缺失了單個氨基酸或小百分比的氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或插入改變是“保守性修飾變體”，這種改變導致氨基酸被化學性質相似的氨基酸所取代。因此，選自I至15中的任意整數(shù)個氨基酸殘基都可以被如此改變。因此，例如，可以進行1、2、3、
4、5、7或10個氨基酸的改變。保守性修飾變體通常能夠提供與衍生出該變體的未修飾多肽序列類似的生物活性。保守取代表格提供的功能類似的氨基酸在本領域都是公知的。
[0041]下面6組中每組含有的是相互之間為保守性取代的氨基酸。
[0042]1)丙氨酸(A)，絲氨酸(s)，蘇氨酸(t)；
[0043]2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E)；
[0044]3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0045]4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷；
[0046]5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)以及
[0047]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。[0048]同樣參見 Creighton (1984)Proteins ff.H.Freeman and Company。本文所涉及到的任何序列都應當被解釋為包括保守修飾變體。
[0049]對于具體的核酸，“編碼(encoding) ”或“被編碼(encoded) ”意為包括翻譯成具體蛋白質的信息。編碼蛋白的核酸可以在核酸的翻譯區(qū)域包含非翻譯序列(例如，內含子)，或者可以缺乏這種插入的非翻譯序列(例如，在cDNA中)。使用密碼子來表示編碼蛋白質的信息。通常，核酸使用“通用”遺傳密碼子來編碼氨基酸序列。然而，通用密碼子的變體，例如存在于一些植物、動物和真菌的線粒體、細菌山羊衣原體、或纖毛蟲大核中的通用密碼子的變體，當核酸在它們之中表達時，可使用這些密碼子變體。
[0050]當使用合成方法來制備或改變核酸時，可以利用在核酸要表達的預期宿主中已知的密碼子偏好。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列可以在單子葉植物和雙子葉植物品種中表達，但是由于這些偏好已經(jīng)顯示出不同，因此要對序列進行修飾以考慮單子葉植物或雙子葉植物的具體密碼子偏好和GC含量偏好。
[0051 ] 如本文所使用的，當涉及核酸時的“異源”是來自于外源物種的核酸，或，如果是來自于相同的物種，則基本上是通過人為故意干預從其天然形式在組成上和/或對基因組基因座進行修飾得到的核酸。例如，可操作地連接到異源結構基因上的啟動子所來自的物種與結構基因所來源的物種不同，或者，如果來自于相同的物種，其中一個或兩個基本上由它們的原始形式修飾得到。異源蛋白可以來源于外源物種，或者，如果來自于相同的物種，則基本上是通過人為故意干預而由其原始形式修飾得到的。
[0052]“宿主細胞”是指包含載體，并支持該載體復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞是單子葉植物或雙子葉 植物細胞。特別優(yōu)選的單子葉植物宿主細胞是玉米宿主細胞。
[0053]在將核酸插入細胞的內容中，術語“導入”是指“轉染”或“轉化”或“轉導”，包括涉及將核酸摻入到真核或原核細胞中，其中核酸可以摻入細胞的基因組中(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，轉變成自主復制子，或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。
[0054]術語“分離的”指的是物質，例如核酸或蛋白，其⑴基本上或根本上是不含通常是伴隨在一起的或發(fā)現(xiàn)在其天然存在的環(huán)境中是與其相接觸的組分。分離的物質任選包括在其天然環(huán)境中沒有發(fā)現(xiàn)與該物質在一起的物質；或者(2)如果該物質處于其天然環(huán)境中，則通過人為故意干預對該物質合成地(非天然地)改變其組成和/或將其置于對于在該環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的物質是非天然的細胞位置中(例如，基因組或亞細胞器)?？梢詫μ幱谄涮烊粻顟B(tài)下或從其天然狀態(tài)下移出的物質進行改變以產(chǎn)生合成的物質。例如，如果在核酸所來源的細胞中通過人為干預的方法對核酸進行改變，或者如果是由被改變的DNA轉錄，則天然存在的核酸就變?yōu)榉蛛x的核酸。見，例如Compounds and Methods for Site DirectedMutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiecj U.S.Pat.N0.5, 565, 350; In Vivo HomologousSequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al.，PCT/US93/03868。同樣的，如果通過非天然存在的方法將核酸導入到對于該核酸是非天然的基因組基因座，則天然存在的核酸(例如，啟動子)就變成分離的核酸。本文所定義的“分離的”核酸同樣也被稱為“異源的”核酸。
[0055]本文所用的“核酸”包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈形式的聚合物，除非另有限定，還包括具有天然核苷酸基本特征的已知類似物，即它們雜交到單鏈核酸上的方式與天然存在的核苷酸類似(例如，肽核酸)。
[0056]“核酸文庫”是指分離的DNA或cDNA分子的集合，其包括并基本上代表了指定生物體基因組的整個轉錄部分。示例性核酸文庫的構建，例如基因組和cDNA文庫的構建在標準分子生物學參考文獻中有所教導，例如Berger and Kimmel, Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in EnzymologyjVol.152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.(Berger) ;Sambrook et al., Molecular Cloning—A Laboratory Manual,2nded., Vol.1-3(1989);以及 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubelet al.，Eds.，Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc.and John Wiley&Sons, Inc.(1994)。
[0057]本文所使用的“可操作地連接”包括啟動子和第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列起始和介導第二序列對應的DNA序列的轉錄。一般來說，可操作地連接意味著所連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果要連接兩個蛋白編碼區(qū)，所連接的核酸序列是連續(xù)的并處于相同讀碼框中。
[0058]除非另有說明，術語“ACCase核酸”是指包含多核苷酸(“ACCase多核苷酸”)的核酸，該多核苷酸編碼具有ACCase活性的ACCase多肽，并包括所有的保守性修飾變體，同源旁系等等?！癆CCase基因”是本發(fā)明的基因，是指全長ACCase多核苷酸的異源基因組形式。
[0059]本文所使用的術語“植物”可以包括整個植物、植物部分或器官(例如，葉、莖、根等)、植物細胞、種子及后代。植物細胞，如本文所使用的，進一步包括而不限于獲自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚胎、分生組織、愈傷組織、葉、根、莖、配子體、孢子體、花粉、小孢子或從中發(fā)現(xiàn)的細胞。植物細胞也可以理解為包括修飾的細胞，例如，從上述組織中獲得的原生質體。能夠在本發(fā)明的方法中使用的植物的種類范圍與適合于轉化技術的高等植物范圍相同，包括單子葉植物和雙子葉植物。特別優(yōu)選的植物包括玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥和小米。
`[0060]如本文中所使用的，“多核苷`酸”包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其類似物，所述類似物具有天然核糖核苷酸的必要特征，在嚴格條件下與天然存在的核苷酸雜交至基本上相同的核苷酸序列上，和/或允許與天然存在的核苷酸一樣翻譯成相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源的結構基因或調芐基因的全長或亞序列。除非另有表示，該術語包括涉及具體的序列及其互補序列。因此，出于穩(wěn)定性或其它原因而經(jīng)過主鏈修飾的DNA或RNA與也是本文所指的術語“多核苷酸”。此外，包含不常見堿基(例如肌苷)或修飾的堿基(例如三苯甲基化的堿基)的DNA或RNA (僅僅舉兩個例子)也是本文所使用的術語“多核苷酸”。可以認識到，已經(jīng)對DNA和RNA進行許多種的修飾以實現(xiàn)本領域技術人員所已知的多種有用目的。這里所采用的術語多核苷酸包括多核苷酸的化學、酶或代謝性修飾的形式，以及病毒和細胞(包括簡單和復雜的細胞)的特征性DNA和RNA化學形式。
[0061 ] 本文所使用的術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”可以互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應天然存在氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在氨基酸的此類類似物的基本特征是，當摻入到蛋白質中時，該蛋白對完全由天然存在氨基酸所組成的相同蛋白所激發(fā)的抗體也具有特異性反應性。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”還包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧化、羥化和ADP-核糖基化?？梢哉J識到，眾所周知并如上所述，多肽并不是完全的線性。例如，由于泛素化，多肽可以是分支的，它們也可以是環(huán)狀的，具有或不具有分支，通常是由于翻譯后事件的結果，包括天然發(fā)生事件和人為操縱的非天然發(fā)生的事件。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀的多肽可以通過非翻譯的天然過程和完全的合成方法來進行合成。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明蛋白質的氨基末端含甲硫氨酸和不含甲硫氨酸變體的用途。
[0062]本文所使用的“啟動子”包括轉錄起始位點上游的，并且參與RNA聚合酶和其他蛋白質識別和結合以進行轉錄起始的DNA區(qū)域?！爸参飭幼印笔悄軌蛟谥参锛毎衅鹗嫁D錄的啟動子，無論其來源是否是植物細胞。示例性的植物啟動子包括，但不限于獲自植物、植物病毒和包含在植物中表達的基因的細菌(例如農(nóng)桿菌或根瘤菌)的那些啟動子。處于發(fā)育控制下的啟動子的示例包括能優(yōu)先在特定組織中(例如葉、根、或種子)起始轉錄的啟動子。這種啟動子被稱為“組織優(yōu)先性”。只在特定組織中起始轉錄的啟動子被稱為“組織特異性”?！凹毎愋汀碧禺愋詥幼又饕窃谝环N或多種器官的特定細胞類型中驅動表達，例如，根和葉中的維管細胞?！罢T導型”或“抑制型”啟動子是處于環(huán)境控制之下的啟動子?？赡苡绊懻T導型啟動子驅動轉錄的環(huán)境條件的示例包括厭氧條件或存在光。組織特異性、組織優(yōu)先性、細胞類型特異性和誘導性啟動子構成了“非組成型”啟動子類型。“組成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下都具有活性的啟動子。
[0063]本文所使用的“重組”或“基因修飾”包括通過導入異源核酸而被改變的細胞或載體，或者衍生自所述被修飾細胞的細胞。因此，例如，重組或基因修飾細胞表達并沒有發(fā)現(xiàn)在細胞天然形式中(未重組)以相同形式存在的基因，或者表達由于人為的故意干預而異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。本文所使用的術語“重組”或“遺傳修飾”并不包括由天然發(fā)生事件造成的細胞或載體的改變(例如，自發(fā)突變、自然轉化/轉導/轉座)例如非人為故意干預而發(fā)生的那些事件。
[0064]本文所使用的“表達盒”是核酸構建體，由重組或合成所產(chǎn)生，具有能夠允許特定核酸在宿主細胞中轉錄的一系列核酸元件。重組表達盒能夠摻入到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片·段中。通常，表達載體的重組表達盒部分除其他序列外，包括待轉錄的核酸和啟動子。
[0065]術語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中可互換使用，是指摻入蛋白質、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白質”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限定，也可包括天然氨基酸的非天然類似物，該類似物與天然存在的氨基酸功能類似。
[0066]術語“選擇性雜交”包括在嚴格雜交條件下，核酸序列與指定的核酸靶序列的雜交的可檢測性程度要大于(例如，至少是背景的2倍)其與非靶核酸序列的雜交，并基本上排除了非靶核酸。選擇性雜交序列彼此之間通常具有約至少80%的序列相同性，優(yōu)選90%序列相同性，最優(yōu)選100%的序列相同性(例如，互補)。
[0067]術語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括在該條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測性程度要大于與其他序列雜交的程度(例如，在背景之上至少2倍)。嚴格條件是序列依賴性的，并且在不同的情況下是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定出與探針100%互補的靶序列(同源探測)。另外，可以調整嚴格條件以允許序列中有一些錯配，以使得可以檢測出較低程度的相似性(異源探測)。一般來說，探針的長度小于1000個核苷酸，優(yōu)選其長度小于500個核苷酸。
[0068]通常，嚴格條件是鹽濃度小于1.5M Na離子，通常約0.001至1.0M Na離子濃度(或其他鹽類)，ρΗ7.0至8.3，對于短探針(例如，10至50個核苷酸)溫度至少約為30°C，對于長探針(例如大于50個核苷酸)至少為約60°C的條件。也可以加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到嚴格條件。示例性的低嚴格條件包括在30-35%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下雜交，以及在IX至2X SSC中(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)，在50°C至55°C下洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在40-45%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下雜交，以及在0.5X至IX SSC中，在55°C至50°C下洗滌。示例性的高嚴格條件包括在50%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下雜交，以及在0.1X SSC中，在60°C下洗滌20分鐘。
[0069]特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關鍵因素為離子強度和最終洗滌溶液溫度。對于 DNA-DNA 雜交，可以從 Meinkoth and Wahl, Anal.Biochem.，138:267-284 (1984)的方程中估算 Tm:Tm=81.5°C.+16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) -0.61 (%form) -500/L，其中 M 是一價陽離子的摩爾濃度，%GC是DNA中鳥苷酸和胞嘧啶核苷酸的比例，％form是甲酰胺在雜交溶液中的比例，L是雜交的堿基對的長度。Tm是這樣的溫度(在特定的離子強度和pH下)，在該溫度下，有50%的互補序列與完美匹配的探針雜交。對于每1%的錯配，Tm減少約1°C ;因此，可以調整Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交到具有所需相同性的序列上。舉例而言，如果需要找尋具有.gtoreq.90%相同性的序列，則可Tm降低10°C。通常,對于在具體離子強度和PH下的特異性序列及其互補序列，所選擇的嚴格條件要比熱熔點(Tm)低約5°C。然而，非常嚴格條件可以利用在比熱熔點(Tm)低1、2、3、4、5或6°C下的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以 利用在比熱熔點(Tm)低7、8、9或10°C下的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以利用在比熱熔點(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的雜交和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組合物以及所需的Tm，本領域普通技術人員將會理解也隱含描述了雜交和/或洗滌溶液嚴格性的其他變化形式。如果所需的錯配程度導致Tm小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選提高SSC的濃度以使得使用更高的溫度。對于核酸雜交的外延指導提供在 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acids Probes,Part I, Chapter2, Ausubel, etal., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)中。一般而言，高嚴格洗滌是在含有0.1%SDS的0.5XSSC中，在65°C下洗滌2X15分鐘。
[0070]本文中所使用的“轉基因植物”或“基因修飾植物”包括涉及在其基因組中包括異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸被穩(wěn)定整合進基因組中，使得該多核苷酸能夠傳遞給后代。異源多核苷酸可以單獨或作為表達盒的部分而整合進基因組中。本文中所使用的“轉基因”或“遺傳修飾”包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，其基因型是通過異源核酸的存在而被改變，包括那些最初被改變的轉基因，以及通過有性雜交或無性繁殖從最初轉基因中創(chuàng)建出來的。這里所使用的術語“轉基因”或“遺傳修飾”并不包括由常規(guī)植物育種方法或天然發(fā)生事件造成的基因組(染色體或染色體外)改變，例如隨機異體受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉位或自發(fā)突變。
[0071]本文中使用的“載體”包括用于轉染宿主細胞并將多核苷酸插入其中的核酸。載體往往是復制子。表達載體允許插入其中的核酸進行轉錄。[0072]用下列術語來描述兩個或兩個以上的核酸或多核苷酸序列之間的關系:(a) “參考序列”，(b) “比對窗口”，(C) “序列相同性”，(d) “序列相同性百分比”，和(e) “實質相同性”。
[0073]如本文中所使用的，“參考序列”是作為序列比對基礎的確定序列。參考序列可能是特定序列的子集或全部；例如，是全長cDNA或基因序列的節(jié)段，或者是完整的cDNA或基因序列。
[0074]如本文中所使用的，“比對窗口 ”包括多核苷酸序列的連續(xù)和特定的節(jié)段，其中多核苷酸序列可以與參考序列進行比對，且其中與參考序列(其并不包含添加或缺失)相比，在比對窗口中的多核苷酸部分可以包括添加或缺失(例如，缺口)，以對兩條序列進行最優(yōu)比對。一般來說，對比窗口的長度為至少20個連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選可以是30、40、50、10020個連續(xù)的核苷酸或更長。本領域技術人員會理解，為了避免由于多核苷酸序列中包括缺口而使得與參考序列具有很高的相似性，通常導入缺口罰分，并從匹配數(shù)目中將其減去。
[0075]對序列進行對比的比對方法在本領域是已知的。對序列進行對比的最優(yōu)比對可通過下述來實施:Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同源比對算法；Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源比對算法；Pearsonand Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444 (1988)的搜索相似性方法；用計算機實現(xiàn)這些算法，包括，但不限于:1ntelligenetics, Mountain View, Calif.的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL ;Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr., Madison, ffis., USA,Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA ；Higgins and Sharp, Gene73:237-244(1988)Higgins and Sharp, CAB10S5:151-153(1989)
;Corpet, et al., Nucleic Acids Researchl6:10881-90(1988);Huang, et al., ComputerApplications in the Biosciences8:155-65 (1992)以及 Pearson,et al., Methodsin Molecular Biology24:307-331 (1994)中詳細描述了 CLUSTAL 程序?？捎糜跀?shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST家族程序包括:用于在核苷酸數(shù)據(jù)庫序列中用核苷酸查詢序列的BLASTN ;用于在蛋白質數(shù)據(jù)庫序列中用核苷酸查詢序列的BLASTX ;用于在蛋白質數(shù)據(jù)庫序列中用蛋白質查詢序列的BLASTP ;用于在核苷酸數(shù)據(jù)庫序列中用蛋白質查詢序列的TBLASTN ;以及在核苷酸數(shù)據(jù)庫序列中用核苷酸查詢序列的TBLASTX。見CurrentProtocolsin Molecular Biology,Chapterl9, Ausubel, et al., Eds.,GreenePublishing andffiley-1nterscience, New York(1995)。
[0076]除非另有說明，本文所提供的序列相同性/相似性數(shù)值是指使用BLAST2.0程序套件，利用默認參數(shù)所得到的數(shù)值。Altschul et al., Nucleic AcidsRes.25:3389-3402(1997)。實施BLAST分析的軟件是公眾可獲得的，例如，通過NationalCenter for Biotechnology-1nformation www.hcb1.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過在查詢序列中確定長度為W的短字段來確定高得分序列對(HSP)，當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字段比對時，其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為相鄰字串得分閾值(Altschul et al.，supra)。這些起始相鄰字串命中作為種子發(fā)起搜索，以尋找含有它們的更長HSP。字串命中沿著每條序 列向兩個方向延伸，直到累積比對得分不再增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(對匹配殘基對的獎勵得分，總是>0)和N(對錯配殘基的罰分，總是〈O)來計算累積得分。對于氨基酸序列，使用打分矩陣來計算累積得分。當:累積比對得分從其達到的最大值下降了數(shù)值X時；由于一個或多個負分值殘基比對使累積得分達到O及O以下時；或者到達任何一條序列的末端時，停止命中字段在各個方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用的默認值為字串長度(W)為11，期望值(E)為10，閾值100，M=5, N=-4,以及兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認值為字串長度(W)為3，期望值(E)為10，以及BLOSUM62打分矩陣(see Henikoff&Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)。
[0077]除了計算序列相同性百分比，BLAST算法還可以實現(xiàn)兩條序列之間的相似性數(shù)據(jù)分析(see, e.g.，Karlin&Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的其中一種相似性測量方法是最小和概率(P(N))，其表示了兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率。
[0078]BLAST搜索假定可以將蛋白質建模為隨機序列。然而，許多真實的蛋白質包含非隨機序列的區(qū)域，該序列可以是同聚束(homopolymeric tract)、短周期重復、或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復雜度區(qū)域可以在互不相關的蛋白質之間比對，即使這些蛋白的其他區(qū)域完全不相似。可以采用一些低復雜度過濾程序來減少這種低復雜度比對。例如，可以單獨或組合米用 SEG (Wooten and Federhen, Comput.Chem., 17:149-163 (1993))和XNU(Claverie and States, Comput.Chem., 17:191-201 (1993))的低復雜度過濾。
[0079]在涉及兩條核酸或多肽序列的內容中，本文所使用的“序列相同性”或“相同性”包括當以最大對應性進行比對時，在特定的比較窗口中兩條序列相同的殘基。當序列相同性百分比用于指蛋白質時，可以認為不相同殘基位置的不同往往是由保守性氨基酸的取代所造成的，在該位置上的氨基酸殘基被其他的具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基所代替，因此并不會改變分子的功能特性。當序列的不同是在于保守性取代時，可以向上校正序列相同性百分比以校準取代的保守性。由這種保守性的取代而不同的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進行校正的方法是本領域技術人員熟知的。通常涉及將保守性取代作為部分而不是完全的錯配進行打分，因此增加了序列相同性百分比。因此，舉個例子，相同的氨基酸所給的得分為1，而非保守性取代所給的得分為0，則保守性取代所給的得分為O至I之間。例如，根據(jù)Meyers and Miller, Computer Applic.Biol.Sc1., 4:11-17 (1988)的在程序 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA)中所執(zhí)行的算法來計算保守性取代的得分。
[0080]本文所使用的“序列相同性百分比”是指通過在一個比較窗口內比較兩條最優(yōu)比對的序列所確定的值，其中當與參考序列(其并不包含添加或缺失)進行比較時，多核苷酸序列在比較窗口中的部分可以包含添加或缺失(即間隙)，以實現(xiàn)兩條序列的最優(yōu)比對。通過以下來計算百分比:確定兩條序列中出現(xiàn)相同核苷酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，用比較窗口中位置的總數(shù)除匹配位置的數(shù)目，將結果乘以100，以產(chǎn)生序列相同性百分比。
[0081]本文所使用的術語“品種”和“栽培種”是指由給定基因型或基因型組合獲得的特征表達所定義的植物，其通過表達至少一種所述特征而與其他的植物種群相區(qū)別，并且就其適合不變地進行繁殖而言可被認為是一個整體(unit)。
[0082]本文所使用的術語“雜種”是指在遺傳學上不相似的植物親本的后代或子代，或者是指與自然授粉所產(chǎn)生的非雜交種子相對的由控制交叉授粉而產(chǎn)生的原種(Stock)。[0083]本文所使用的術語“后代(progeny) ”是指植物的世代，其中該世代的祖先可以追溯到所述植物。本文所使用的術語除草劑抗性植物的“后代”包括除草劑抗性植物的后代以及該植物的任何突變體、重組或遺傳修飾的衍生植物，無論是相同的物種或不同的物種，其中原始除草劑抗性植物的除草劑抗性特性已經(jīng)轉移到所述后代植物中。
[0084]本文所使用的術語“植物組織”包括分化和未分化的植物組織，包括那些存在于根、枝條、葉、花粉、種子和瘤中的組織，以及培養(yǎng)中的細胞(例如，單細胞、原生質體、胚、愈傷組織等)。植物組織可以在植株中，在器官培養(yǎng)物，組織培養(yǎng)物或細胞培養(yǎng)物中。
[0085]本文所使用的術語“植物部分”在本文中使用是指植物結構或植物組織，例如，花粉、胚珠、組織、豆莢、種子和細胞。在本發(fā)明的一些實施方式中，轉基因植物是作物植物。本文所使用的術語“作物”和“作物植物”是以它們的廣義來使用的。該術語包括但不限于，可被人類食用的、用作動物或魚類或海洋動物飼料的、或被人類食用或使用或觀賞的任何種類的植物，或者是用于工業(yè)或商業(yè)或教育的任何植物。
[0086]本文所使用，涉及植物的術語“良種種質”是指被證明具有遺傳優(yōu)勢的遺傳材料。
[0087]本文所使用的術語“良種植物”是指對優(yōu)良的農(nóng)藝性能進行選擇和育種所得到的任何植物。
[0088]本文所使用的術語“性狀”是指生物體的可被觀察和測量的特性。例如，本發(fā)明描述了對FOP和DIM除草劑具有抗性的植物。
[0089]本文所使用的術語“標記”和“DNA標記”以及關于“選擇標記”的“分子標記”是指生理學或形態(tài)學性狀，被確定為用于其本身的選擇的標記或用于選擇其他的與該標記緊密連鎖的性狀的標記。例如，這樣的標記可以是與除草劑耐受性相關的基因或性狀，包括但不限于簡單重復序列(SSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因插入和/或缺失等等。
[0090]本文所使用的術語·“漸滲(introgress) ”和“漸滲(introgressing) ”和“漸滲(intoogression)”是指將外源遺傳物質摻入育種原種品系的常規(guī)(即經(jīng)典)授粉育種技術。例如，本發(fā)明提供了通過雜交兩個植物世代而漸滲入除草劑耐受的突變體ACCase基因的小麥作物植物。
[0091]當涉及基因時，本文所使用的術語“野生型”是指在植物種群中常見的功能性基因。功能性野生型基因是在群體中最常被觀察到的基因，因此可任意地叫做基因的“正?！被颉耙吧汀毙问?。
[0092]本文所使用的術語“突變體”或“功能性突變體”當涉及基因或基因產(chǎn)物時分別是指與野生型基因或基因產(chǎn)物相比，表現(xiàn)出序列和/或功能特性修飾(即改變的特征)的基因或基因產(chǎn)物。因此，當用于涉及核苷酸序列時，術語“修飾的”和“突變”是指與另外的，通常是相關的核苷酸序列有一個或多個核苷酸不同的核酸序列，當用于涉及由所述“修飾的”或“突變”核酸編碼的多肽時，術語“功能性突變體”是指保持了活性的蛋白或多肽。在本申請中，ACCase突變體蛋白，或其“功能性突變體”是保持了其天然創(chuàng)造必需氨基酸的活性的ACCase基因。此外，“修飾的”核苷酸序列被解釋為如在本領域技術人員已知的簡并密碼子中所發(fā)現(xiàn)的那樣。例如，遺傳密碼子是簡并的，因為有很多不同密碼子代表相同氨基酸的例子；遺傳密碼子中有一些氨基酸可能每個都是由一個以上的密碼子編碼。可以預見的是，本發(fā)明可以包括這種簡并，例如，其中小麥雜種包含與SEQ ID1、2、3、4、5或6，或與在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC N0._)中發(fā)現(xiàn)的序列具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性的在例如小麥種質中所發(fā)現(xiàn)的ACCase。
[0093]發(fā)明詳沭
[0094]乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是催化乙酰輔酶A的羧化以生成丙二酸單酰輔酶A的生物素化酶。這個羧化是一個兩步可逆的反應，由如下組成:由生物素羧化酶活性對羧基載體結構域的生物素基團進行ATP-依賴性羧化，然后由羧基轉移酶活性將羧基基團從生物素轉移至乙酸輔酶 A(Nikolau et al.，2003，Arch.Biochem.Biophys.414:211-22)。乙酸輔酶A羧化酶不僅僅是植物體內脂肪酸合成的關鍵酶(合成過程發(fā)生在葉綠體和線粒體中)，ACCase還在長鏈脂肪酸和黃酮的形成過程中，以及發(fā)生在細胞質內的丙二?；^程中發(fā)揮作用。ACCase有兩種同工型，其中葉綠體ACCase占總ACCase活性的比例超過80%(Herbertet al.，1996，Biochem.J.318:997-1006)。芳氧基苯氧基(FOP)和環(huán)己二麗(DIM)是已知能選擇性抑制雜草中葉綠體ACCase的兩類化學物質(Rendina et al., 1990, J.Agric.FoodChem.38:1282-1287)。
[0095]將小麥品種的種子暴露在化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)下，種植并評估其對ACCase除草劑的耐受性。其中一種基因型，AF28_A(SEQ ID NO:4)對所測試的每種除草劑都表達出高水平的耐受性。本文進一步證實，將AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D與良種親本品系雜交會產(chǎn)生良好的種子組以及在后代植物中產(chǎn)生ACCase除草劑抗性。
[0096]因此，本發(fā)明的一個實施方式提供了含有改變的ACCase基因和蛋白質的植物種質。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了 ACCase除草劑用于雜種植物的農(nóng)田中以減少存在于所述作物農(nóng)田中的單子葉雜草植物數(shù)量的用途，其中所述雜種種質包含改變的賦予ACCase除草劑抗性的ACCase酶，并且所述雜草植物是ACCase除草劑易感的。優(yōu)選的植物包括小麥、稻和大麥或其它具有類似突變的單子葉谷物植物。
[0097]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了具有對ACCase除草劑所致抑制作用的抗性的植物，所述對ACCase除草劑所致抑制作用的抗性是單獨的或與與其它的抗性性狀組合，所述其它抗性性狀例如對禾草螟(Chilo partellus)的昆蟲抗性(Girijashankar etal., 2005, Plant Cell R印.24:513-522，以其整體并入本文)。在一些實施方式中，例如，其種質包含來自于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的合成cryIAc基因的小麥雜種，被漸滲至其種質提供ACCase除草劑抗性的小麥品系中。同樣，ACCase除草劑抗性和昆蟲抗性的摻入是通過植物轉基因至相同的小麥雜種中來完成的。本領域技術人員將知道本文所述的適合于將兩種或更多種抗性屬性并入到同一個植物中的各種技術。
[0098]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了在植物中的ACCase除草劑抗性，包括，例如，通
過植物育種和選擇將名為AF28-A、AF26-B和/或AF10-D，ATCC N0._的ACCase種質
整合進良種品種中，從而開發(fā)出對用于雜草控制的ACCase抑制性除草劑具有耐受性的除草劑耐受性植物。在上述植物中開發(fā)該除草劑耐受性性狀允許使用這些除草劑來控制在這些作物存在時生長的單子葉雜草。在一些實施方式中，通過漸滲或經(jīng)典的育種方法來將ACCase抗性性狀導入良種品系的。在一些實施方式中，是通過異源基因轉基因利用表達或抑制構建體將ACCase抗性基因導入到良種品系中。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了植
物，優(yōu)選小麥，其中該小麥植物的至少一個祖先包含來自于保藏在ATCC登錄號:_
下的名為AF28-A的種質的ACCase抗性基因。在一些實施方式中，ACCase抗性除草劑基因包括與SEQ ID NO: 4，或者與保藏在ATCC登錄號:_下的AF28-A中所發(fā)現(xiàn)的ACCase
抗性除草劑基因具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性的核酸序列。在一些實施方式中，
ACCase抗性除草劑基因與SEQ ID NO: 4，或者與保藏在ATCC登錄號:_下的AF28-A
中所發(fā)現(xiàn)的包含Ala2004Val氨基酸取代的ACCase抗性除草劑基因具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。
[0099]在一些實施方式中，使用經(jīng)典的育種技術將ACCase除草劑抗性種質滲入到良種植物品系中。用于小麥，大麥，稻和其他單子葉谷類作物的經(jīng)典育種方法的示例可以在，例如 Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, Fifth Edition, BlackwellPublishing中找到，并以其全部并入本文之中。
[0100]在一個實施方式中，將ACCase除草劑抗性種質滲入到提供食物供人類消耗的植物中，優(yōu)選小麥。在一些實施方式中，將ACCase除草劑抗性種質滲入到為牲畜(例如，家禽，牛，豬，羊等)提供食物的小麥植物中。在一些實施方式中，將ACCase除草劑抗性種質滲入到用于諸如乙醇產(chǎn)生等工業(yè)工藝的小麥植物中。在一個實施方式中，利用載體和本領域已知技術通過轉基因將ACCase除草劑抗性基因導入植物基因組中。
[0101]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了保藏在ATCC登錄號:_下的AF28-A品
系中的小麥植物部分的ACCase抗性種質，所述小麥植物部分是花粉、胚珠、組織、豆莢和細胞中的一種或多種。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了 Fl雜種，其種質包含如本文所述的ACCase抗性基因。在一些實施方式中，F(xiàn)l雜種是兩個良種小麥品系的雜交品種，其中至少一個品系含有的種質包含如本文所述的ACCase抗性基因。
`[0102]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了在植物群體中控制雜草的方法。在一些實施方式中，控制雜草包括向所述植物群體施用ACCase除草劑，這樣使雜草的生長受到抑制而不會對植物的生長帶來不利影響。在一些實施方式中，所施用的ACCase除草劑來自于芳氧基苯氧基丙酸酯類(FOP)除草劑家族，包括但不限于，炔草酯(clodinafop-propargyl)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草靈(diclofop-methyl)、精惡唑禾草靈(fenoxaprop-p-ethyl)、批氟禾草靈(fluazifop-b-butyl)、氟吡乙禾靈(haloxyfop-ethoxyethyl)、吡氟甲禾靈(haloxyfop-etotyl)、氟吡甲禾靈(haloxyfop-R-methyl)、惡草酸(propaquizafop)、精喹禾靈(quizalofop-p-ethyl)和quizalo-p-refuryl化合物。在一些實施方式中，所應用的ACCase除草劑來自于環(huán)己二酮類(DIM)除草劑家族，包括但不限于:禾草滅(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、clefoxydim、烯草酮(clethodim)、噻草酮(cycloxydim)、環(huán)苯草酮(profoxydim)、烯禾唳(sethoxydim)、吡喃草酮(teproloxydim)和三甲苯草酮(tralkoxydim)化合物。在一些實施方式中，所應用的ACCase除草劑包括來自于如本文所公開的FOP和DM ACCase除草劑家族的化合物的組合。然而，本發(fā)明并不局限于所使用的ACCase除草劑，本領域技術人員將領會到，在任何給定的時間內將會發(fā)現(xiàn)新的能抑制ACCase酶的ACCase除草劑。
[0103]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了植物(例如Fl，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4等)，其種質賦予對ACCase除草劑以及來自于一個或多個不同除草劑組的一種或多種額外除草劑的抗性。例如，用于抑制雜草生長的另外的除草劑組包括但不限于，脂質合成抑制劑(例如，芳氧基苯氧基丙酸酯、環(huán)己二酮、苯并呋喃、氯甲酸、二硫代磷酸酯、硫代氨基甲酸酯)，光合系統(tǒng)II中光合作用抑制劑(例如，苯基氨基甲酸酯、咕嗪酮、三嗪、三嗪酮(triazinone)、三唑啉酮(triazolinone)、尿嘧唳、酰胺、尿素、苯并噻二嗪酮(benzothiadiazinone)、腈、苯基吡啶)，光合系統(tǒng)I中光合作用抑制劑(例如，雙吡啶)，卟啉原氧化酶抑制劑(例如，二苯醚，N-苯基鄰苯二甲酸亞胺(N-phenyl phthalimide),噁二唑，oyzolidinedione,苯批唑，嘧啶二酮，噻二唑)，類胡蘿卜素生物合成抑制劑(例如，噠嗪酮，吡啶羧基酰胺，異噁唑酮(isoxazolidinone),三唑(tirazole)), 4-輕苯基丙酮酸雙氧化酶抑制劑(例如，紅千層(callistemone),異惡唑,批唑，三酮)，EPSP合酶抑制劑(例如，甘氨酸)，谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如，次膦酸)，二氫蝶酸合酶抑制劑(例如，氨基甲酸酯)，微管組裝抑制劑(例如，苯甲酰胺、苯甲酸、二硝基苯胺、磷酸酰胺化物(phosphoroamidate)、吡唳),細胞分裂抑制劑(例如，乙酰胺，氯乙酰胺，氧乙酰胺(oxyacetamides)),細胞壁合成抑制劑(例如，腈，三唑羧基酰胺(triazolocarboxamides))以及生長素運輸抑制劑(例如，phthalamates,縮氨基脲)。在一些實施方式中,本發(fā)明提供了來自于良種植物品系的Fl雜種，其包含對一種或多種ACCase除草劑的抗性，單獨地或與對上述除草劑組中一種或多種除草劑的抗性組合。
[0104]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6(編碼野生型或突變體ACCase蛋白質(SEQ ID N07、8、9、10、11或12))的異源核苷酸序列的用途，其用于提供選定的ACCase除草劑抗性農(nóng)藝性狀。在一個實施方式中，核苷酸序列包含在保藏于ATCC
登錄號:_下的名為AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D的種質中所發(fā)現(xiàn)的突變體ACCase
基因。在一些實施方式中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。在一些實施方式中，ACCase核苷酸序列可操作地連接至啟動子序列，并形成表達或抑制構建體的組成部分，并且在一些實施方式中，ACCase核苷酸序列與在AF28_A、AF26_B和/或AF10-D中所發(fā)現(xiàn)的ACCase抗性除草劑基因，或與在A、`B、D基因組中包含氨基酸取代Ala2004Val的SEQID NO:4,SEQ ID N0:5和/或SEQ ID NO:6具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。
[0105]經(jīng)典小麥育種
[0106]通過利用植物授粉方法的技術，已經(jīng)對農(nóng)田作物進行了經(jīng)典育種。如果花粉可以從一朵花轉移到同一株植物的同一朵或另外一朵花上，則認為該植物是“自花授粉”，而如果來自于另一株植物的花朵的花粉發(fā)生授粉時，則認為該植物是“異花授粉”。經(jīng)過多代而被挑選出來的自花授粉植物會在其如果不是全部也是大多數(shù)的基因位點上變?yōu)榧兒系?，從而產(chǎn)生均一的(uniform)真正育種后代群體。將來自于不同背景的兩種純合植物，或者將兩個不同的純合品系進行雜交，將會產(chǎn)生均一的雜種植物群體，該雜種植物在很多基因位點上更可能是雜合的。將兩種在很多基因位點上都是雜合的植物進行雜交，將會產(chǎn)生遺傳學上不相同且不均一的雜種植物子代。
[0107]小麥植物是自花授粉植物，但是它們也可以通過異花授粉繁殖。開發(fā)小麥雜種需要開發(fā)授粉親本(育性恢復)和使用細胞質雄性不育恢復系統(tǒng)的種子親本自交系，將種子親本和授粉親本進行雜交，對雜交進行評估。也可以使用用于提供雜種母本雄性不育性的化學雜交制劑來開發(fā)小麥雜種。譜系育種程序組合了理想的性狀；在本發(fā)明中，理想性狀是植物對ACCase除草劑的抗性。將這個性狀放進來自于一個或多個品系的育種池中，使得通過雜交創(chuàng)建新的自交系，然后挑選具有理想性狀的植物，接著進行更多的雜交，等等。將新的自交系與其他的自交系進行雜交(例如，如本文所描述的那些良種植物品系)。
[0108]譜系育種起始于將兩種基因型雜交，例如AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D與良種小麥品系。如果原始的兩個親本不能提供全部的理想特性，則可以在育種群體中包括其他的來源。例如，如果需要雜種同時得到ACCase除草劑抗性和對本文所述的其他除草劑組的抗性，則可以利用經(jīng)典育種技術將具有這些特性的植物進行雜交。在譜系方法中，優(yōu)勢植物自花授粉并且選擇連續(xù)幾代。在隨后的幾代中，由于自花授粉和選擇，雜合狀態(tài)讓步于純合植物的純合品系。通常，在譜系方法中，可進行五代或更多代的自花授粉和選擇(例如，SI，
S2,S3, S4, S5 等)。
[0109]回交育種被用于改良植物品系。回交育種將一個或多個特定的理想性狀從一個來源轉移到缺少該性狀的另一個來源。這可以通過，例如，將供體(例如，AF28-A)與良種自交系(例如，良種品系)進行雜交來完成。該雜交的后代再回過來與良種自交系進行雜交(即回交)，接著在所產(chǎn)生的后代中選擇所需要的性狀(例如，對ACCase除草劑的抗性)。在五個或更多個世代并且對所需性狀進行選擇之后，該后代在控制所需表型的位置(位點)上通常是雜合的，但是在其他遺傳性狀上將會與良種親本很相像。最后的回交則是典型的自花授粉以給出所轉移的基因的純的育種后代。
[0110]在目前的雜交小麥育種程序中，新親本系開發(fā)為種子親本系還是花粉親本系取決于它們是否含有育性恢復基因；種子親本系不含有育性恢復基因且在某些的胞質中是雄性不育的(也被稱為“A”品 系植物)，而在其他的胞質中則是雄性可育的(也被稱為“B”系植物)，然而，花粉親本品系不是雄性不育的，并含有雄性恢復基因(也被稱為“R”系植物)。通常將種子親本品系創(chuàng)建成胞質雄性不育，使得這些植物中的花藥極小至不存在，因此需要異花授粉。種子親本品系只產(chǎn)生種子，胞質的傳遞僅通過卵來完成。含有在Fl雜種中完全恢復育性所必需的基因的親本品系提供用于異花授粉的花粉，該雜交與雄性不育種子親本聯(lián)合產(chǎn)生具有良好籽粒品質的高產(chǎn)單交種。
[0111]通常,通過種植成行成片的雄性不育植物(種子親本)和成行成片的育性恢復植物(花粉親本)，使花粉親本植物的花粉對種子親本進行風媒授粉來實施該胞質雄性不育育性恢復系統(tǒng)以產(chǎn)生雜交種子。該過程產(chǎn)生了被消費者收獲和種植的茁壯的單交種。也可以通過將隱性核不育基因遺傳育種至特定的種群中來創(chuàng)建雄性不育的種子親本植物，然而胞質雄性不育育性恢復系統(tǒng)仍然是用于育種雜交小麥的經(jīng)典系統(tǒng)，不過化學誘導雄性不育也已經(jīng)被廣泛使用。Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, FifthEd.，Blackwell Publishing提供了關于當前小麥育種程序的很好的綜述，以其全部并入本文。
[0112]本發(fā)明并不局限于所列舉的小麥品系，本領域技術人員將認識到，任何良種小麥品系同樣都適合于本發(fā)明描述的組合物和方法。
[0113]植物轉基因
[0114]本發(fā)明的組合物包括被鑒定為ACCase編碼序列(其參與植物對ACCase除草劑的響應)的小麥核苷酸序列。具體地，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO:5、6、7、8和9所示氨基酸序列的核苷酸序列。進一步提供了具有由本文所述核酸分子編碼的氨基酸序列的多肽，例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示的那些核苷酸序列。
[0115]本發(fā)明的組合物可以用于各種方法中，通過這些方法蛋白產(chǎn)物可以在作物植物中表達，作為除草劑抗性蛋白行使功能。這種表達導致表達的水平、組織或時間發(fā)生改變或調整以實現(xiàn)ACCase除草劑抗性的改良。本發(fā)明的組合物可以在與特定ACCase的來源相同的物種中表達，或者，也可以在任何感興趣的物種中表達。用這種方式，ACCase的編碼序列可以與導入到作物植物中的啟動子組合使用。在一個實施方式中，可使用高水平表達組成型啟動子，導致ACC的高水平表達。在其他的實施方式中，將編碼序列可操作地連接至組織特異性啟動子上，以指導其在已知對ACCase除草劑易感的植物組織中表達，例如葉子。同樣的，可以操控表達的時間。例如，通過合適地選擇啟動子，可以在植物生長早期增強表達，以使引發(fā)(prime)植物對除草劑處理的響應。
[0116]在具體的實施方式中，提高植物除草劑耐受性的方法包括，用包含本發(fā)明核苷酸序列的DNA構建體穩(wěn)定轉化植物，該核苷酸序列可操作地連接到能在植物中驅動表達的啟動子上。
[0117]此外還提供了轉化的植物、植物細胞、植物組織及其種子。
[0118]本發(fā)明的方法可以與本領域中可提供的其他方法一起使用以增強植物中的其他性狀?？梢哉J識到，這樣的第二核苷酸序列可以以正向或反向使用，這取決于所期望的結
果O
[0119]突變體ACCase核苷酸序列(SEQ ID N0:4、5和/或6)的這種過表達將會是使用所述突變體核苷酸序列的優(yōu)選方法。使用不同啟動子來驅動這種過表達的各種優(yōu)點和缺點對本領域技術人員而言都是已知的。然而，通過舉例的方式，組成型啟動子能夠驅動表達，但是更理想的啟動子是能靶向組織，例如葉子。
[0120]本發(fā)明的序列，在 下面將進行更詳細的討論，包括編碼序列、反義序列及其片段和變體。本發(fā)明的序列的表達可以用于調節(jié)或調控相應的ACCase蛋白的表達。本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白組合物。
[0121]所公開的核苷酸序列和由其編碼的蛋白質的片段和變體同樣包括在本發(fā)明中?！捌巍笔侵负塑账嵝蛄械囊徊糠只虬被嵝蛄械囊徊糠?，以及因此由其編碼的蛋白。核苷酸片段可以編碼保留了天然蛋白生物學活性的蛋白質片段，因此具有ACC樣活性，從而影響除草劑響應。另外，用作雜交探針的核苷酸序列片段通常并不編碼保留生物學活性的蛋白片段。因此，核苷酸序列片段的范圍是從至少約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸到編碼本發(fā)明蛋白質的全長核苷酸序列。
[0122]編碼本發(fā)明ACCase蛋白生物學活性部分的ACCase核苷酸序列片段編碼至少15、25、30、50、100、150、200，或250個連續(xù)氨基酸，或直到本發(fā)明全長蛋白質中存在的全部數(shù)
量的氨基酸。
[0123]可以使用本發(fā)明的核苷酸序列從其他生物體中特別是其他植物中，更特別是其他單子葉植物，分離相應的序列。用這種方式，可利用諸如聚合酶鏈式反應(PCR)、雜交等方法，基于這些序列與本文所示序列的同源性來鑒定這樣的序列。基于這些序列與本文所示的完整ACCase序列或其片段的同源性而分離出來的序列也包括在本發(fā)明中。這樣的序列包括所公開序列的直系同源序列?！爸毕低础笔侵竵碜杂谝粋€共同祖先基因并由于物種形成而在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因。當它們的核苷酸序列和/或它們編碼的蛋白質序列享有如本文中其他地方所定義的實質相同性時，在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因被認為是直系同源的。直系同源基因的功能在物種間往往是高度保守的。
[0124]在PCR方法中，可設計用于PCR反應的寡核苷酸引物以從提取自任何感興趣的植物的cDNA或基因組DNA擴增相應的DNA序列。設計PCR引物和PCR克隆的方法在本領域中通常是已知的，并公開于，例如Sambrook.See also Innis et al., eds.(1990)PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, New York);Innisand Gelfand, eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press, New York);和 Innis andGelfand, eds.(1999)PCR Methods Manual (Academic Press, New York)中。已知的 PCR 方法包括，但不限于，使用配對引物、巢式引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。
[0125]在雜交技術中，將已知核苷酸序列的全部或部分用作探針，選擇性地與來自于所選擇生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群體中(即基因組或cDNA文庫)所存在的相應核苷酸序列雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可檢測基團例如32P或其它任何可檢測標記進行標記。因此，例如，可以基于本發(fā)明的ACCase序列，通過標記合成寡核苷酸來制備用于雜交的探針。制備雜交探針和構建cDNA和基因組文庫的方法，在本領域是公知的并公開在Sambrook中。
[0126]可通過本領域已知的和本文公開的任何方法來測定ACCase多肽的生物學活性(即影響ACCase除草劑響應)。
[0127]本發(fā)明的核苷酸序列可以在宿主細胞中表達，例如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞，或優(yōu)選植物細胞。預計本領域技術人員知曉很多可用于表達編碼本發(fā)明蛋白質的核酸的表達系統(tǒng)。不會試圖詳細描述已知的用于在原核或真核細胞中表達蛋白的各種方法。
[0128]在用于在感興趣·植物中表達的表達盒或DNA構建體中提供本發(fā)明的序列。表達盒包括可操作地連接至本發(fā)明ACCase序列的5’和3’調控序列。該表達盒還可以包括至少一個額外的待共轉化進所述生物體中的基因。此外，額外的基因可以在多個表達盒中提供。
[0129]所提供的此類表達盒具有多個限制性位點使得插入的ACCase序列可處于調控區(qū)域的轉錄調控之下。表達盒還可以額外含有選擇性標記基因。
[0130]表達盒可包括，以轉錄的5’_3’方向，轉錄起始區(qū)域(即，啟動子)、翻譯起始區(qū)域、本發(fā)明的多核苷酸、翻譯終止區(qū)域，以及任選存在的，在宿主生物體內行使功能的轉錄終止區(qū)域。調控區(qū)域(啟動子、轉錄調控區(qū)域以及翻譯終止區(qū)域)和/或本發(fā)明的多核苷酸對于宿主細胞或相互之間可以是天然/類似的。此外，調控區(qū)域和/或本發(fā)明的多核苷酸對于宿主細胞或相互之間是異源的。
[0131]雖然優(yōu)選使用異源啟動子來表達所述序列，但可以使用天然啟動子序列。此類構建體將改變宿主細胞(即，植物或植物細胞)內ACCase的表達水平。因此改變了宿主細胞(即植物或植物細胞)的表型。
[0132]終止區(qū)域可以是天然與轉錄起始區(qū)域一起的，可以是天然與可操作地連接的感興趣的DNA序列一起的，或可以來自于另外的來源。農(nóng)桿菌Ti質粒中可以提供合適的終止區(qū)域，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)域。也見Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Ce1164:671-674;Sanfacon et al.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272;Munroe et al.(1990)Gene91:151-158;Balias et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903;and Joshi etal.(1987) Nucleic Acid Res.15:9627-9639 中。
[0133]在合適的情況下，對基因進行優(yōu)化以提高其在轉化植物中的表達。即，可使用植物偏好的密碼子來合成基因以改良表達。本領域中可獲得用于合成植物偏好基因的方法。見，例如U.S.Pat.Nos.5，380，831，and5, 436，391，and Murray et al.(1989) Nucleic AcidsRes.17:477-498，其通過引用并入本文。
[0134]已知可對序列進行額外的修飾以增強細胞宿主中基因的表達。這包括清除編碼假多聚腺苷酸化信號、外顯子-內含子剪接位點信號、轉座子樣重復以及其他可能對基因表達有害的熟知序列的序列。序列的G-C含量可以被調整至指定細胞宿主的平均水平，其參考宿主細胞中表達的已知基因計算。如果可能的話，對序列進行修飾以避免預測的發(fā)夾二級mRNA結構。
[0135]表達盒還可以在表達盒構建體中含有5 ’前導序列。這種前導序列可以用于增強翻譯。翻譯前導序列在本領域是已知的，包括:小核糖核酸病毒前導序列，例如，EMCV前導序列(腦心肌炎病毒的 5’ 非編碼區(qū))(Elroy-Stein et al.(1989)PNAS USA86:6126-6130)；馬鈴薯Y病毒前導序列，例如，TEV前導序列(煙草蝕刻病毒)(Allison et al.(1986)Virologyl54:9-20);以及人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP) (Macejak et al.(1991)Nature353:90-94)，來自于苜?；ㄈ~病毒衣殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMV RNA4)(Jobling et al.(1987) Nature325:622-625);煙草花葉病毒(TMV)前導序列(Gallie etal.(1989) in Molecular Biology of RNA, ed.Cech (Liss, New York), pp.237-256);以及玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)前導序列(Lommel et al.(1991) Virology81:382-385)。同樣見于Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968 中。也可以利用其它已知的方法來增強轉錄。
[0136]在制備表達盒時，可以對各種DNA片段進行操作，以便提供處于正確方向以及視情況而定處于適當讀碼框中的DNA序列。為此,可以采用接頭(adapter)或連接子(linker)連接DNA片段，或可以包括其它的操作以提供便于使用的限制性位點、除去多余的DNA、除去限制性位點等。為了這個目的，可以包括體外誘變、引物修復、限制性、退火、重取代例如轉換和顛換。
[0137]—般來說，表達盒將包含用于選擇轉化細胞的可選擇性標記基因。利用可選擇性標記基因來選擇轉化的細胞或組織。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如那些編碼新霉素磷酸轉移酶II (NEO)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)的基因，以及賦予除草劑化合物抗性的基因，所述除草劑化合物例如草銨磷(glufosinate)、草甘膦、銨類、溴苯腈、咪唑啉酮以及 2，4-二氯苯氧基乙酸(2, 4-D) ο 一般見于:Yarranton(1992)Curr.0pin.Biotech.3:506-511;Christopherson et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318;Yaoet al.(1992)Cell71:63-72;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422;Barkleyet al.(1980)in The Operon, pp.177-220;Hu et al.(1987)Ce1148:555-566;Brownet al.(1987)Cell49:603-61 2;Figge et al.(1988) Cel152:713-722;Deuschle etal.(1989) Proc.Natl.Acad.Ac1.USA86: 5400-5404; Fuerst et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2549-2553;Deuschle et al.(1990)Science248:480-483;Gossen (1993)Ph.D.Thesis, University of Heidelberg;Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921;Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356;Zambretti etal.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956 ; Baim et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076;Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653;Hillenand-ffissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162;Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595;Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis, University of Heidelberg;Gossen etal.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551; 01 iva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919;Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.78(Springer-Verlag, Berlin);Gill et al.(1988)Nature334:721_724;和WO
【發(fā)明者】M·奧斯特里, S·黑利, P·韋斯特拉, V·A·瓦爾德斯 申請人:科羅拉多小麥研究基金會公司