專利名稱：絲氨酸乙酰轉移酶基因的植物表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物工程領域，具體涉及一種絲氨酸乙酰轉移酶基因的植物表達載體1300-Surperpromoter-^5^T,及其在轉基因作物中的應用。
背景技術：
過量使用化肥和偏施N肥是引起土壤次生鹽潰化的直接原因(李文慶等，2002，土壤學報，39 (2):283-287)。由于設施土壤處于人為特殊小氣候環(huán)境下，大量肥料施入，加之無雨水淋洗等原因，導致設施土壤的理化性狀和生物學特性產(chǎn)生了很大的變化，許多研究表明，設施土壤耕層的鹽分高于相應的露地土壤1-13倍，且隨著設施栽培年限的增長而增力口(余海英等，2005，土壤，37 (6):581-586)。設施栽培中土壤可溶性鹽組成與露地土壤明顯不同，溫室栽培中土壤含有的NO3' Cl' SO42' Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子含量明顯高于露地土壤，導致總鹽含量增加，其中引起設施栽培土壤次生鹽潰化的鹽離子中，陽離子以Ca2+為主，陰離子以N03_為主，約占陰離子總產(chǎn)量的67-76% (童有為等，1991，園藝學報，18(2):159-162)。因此，硝酸鹽累積是設施栽培中土壤次生鹽潰化的主要特點，這是它們與濱海鹽土、內(nèi)陸鹽堿土的最大區(qū)別。土壤中可溶性鹽分過多所誘導的對植物的傷害作用稱為鹽害(salt-1njury)。植物在系統(tǒng)發(fā)育中產(chǎn)生了對鹽潰環(huán)境的適應能力，稱為抗鹽性(salt-resistence)。植物對鹽潰環(huán)境的適應機理主要有兩種方式:避鹽(salt-avoidance)和耐鹽(salt-tolerance)。在鹽脅迫下，植物的外部形態(tài)和內(nèi)部生理生化特性都會發(fā)生一系列的變化，而這些變化是一個復雜的過程。植物體在感受高鹽后，這些脅迫信號經(jīng)歷一系列的傳遞過程，最后誘導特定的功能基因的表達，在生理上作出調節(jié)反應，影響了植物生理活動的多方面。植物細胞外界溶液里的鹽濃度過高會導致離子平衡和水勢平衡的破壞，破壞細胞的組分和營養(yǎng)需求，進而造成植物整體水平上的破壞。主要表現(xiàn)為植物的形態(tài)構造、細胞膜、保護酶活性、光合作用、物質代謝和內(nèi)源激素的變化等。植物生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)正常條件下不會對植物造成嚴重傷害，但逆境條件下植物細胞結構(如:葉綠體、線粒體、過氧化物酶體)中產(chǎn)生的大量ROS會造成葉綠素、膜質、蛋白質和核酸的氧化傷害，從而破壞正常的生理代謝(Gill et al.,2010,Plant physiology and biochemistry, 48，901-930)。為避免 ROS 的大量積累，具有較強抗鹽性的植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)在鹽脅迫下活性增強，可清除過量R0S。McCordFridocich(1 969)提出的自由基傷害學說，已廣泛用于需氧生物細胞傷害機理的研究。研究表明參與清除ROS的機制有兩種，一種是包括谷胱甘肽轉移酶(GST)、APX、CAT、S0D、谷胱甘肽過氧化物酶(GPOX)等在內(nèi)的酶促反應系統(tǒng)；另一種是抗壞血酸、谷胱甘肽和類黃酮等抗氧化劑在內(nèi)的非酶促反應系統(tǒng)。
目前已知SAT代謝途徑為:絲氨酸(serine, Ser)和乙酰輔酶A (acetyl_CoA)在SAT催化下形成O-乙酰絲氨酸(0-acetylserine, 0AS),在半胱氨酸合成酶[Cys synthase,CSase;常稱O-乙酰絲氨酸硫醇裂合酶
的催化下，H2S與O-乙酰絲氨酸反應形成Cys0 Cys四條代謝旁路中，合成GSH是主要的代謝途徑，并且合成Cys的限制因素是SAT，并非 OAS-TL (ffirtz et al., 2005,Photosynth Res,86: 345-362)。不同類型的 SAT 酶過量產(chǎn)生，無論是在細胞質還是在葉綠體中，都表明了 SAT酶活是合成Cys和GSH量的限制因子(Sirko et al., 2004, Journal of Experimental Botany,404(55): 1881-1888)。在植物中，大蔥、擬南芥(Drouxet al., 1998, Eur J Biochem, 255: 235-245)大豆和菠菜(Saito et al., 1994,Plant Physiology, 106:887-895)韭菜(Urano et al., 2000,Gene, 257:269-277)豌豆(Droux，2003，Plant Physiol Biochem, 41:619-627)等的 SAT 蛋白已經(jīng)得到純化并進行重組蛋白酶活的研究。幾個研究小組通過細菌突變株功能互補篩選來研究植物中編碼SAT基因的 cDNAs(Wirtz et al.，2003，Amino Acids，24:195 - 203)。目前，使用常規(guī)的啟動子CaMV 35S，已將西瓜的SAT基因過表達擬南芥植株(Noji et al.，2002，Amino Acids，22:231-243)，擬南芥的 SAT基因過表達煙草植株(Sirko et al., 2004, J ExpBot,55: 1881-1888)、大腸桿菌的SAT基因過表達馬鈴薯植株(Harms et al.，2000，PlantJ22 (4): 335-343)等，并且研究表明大多數(shù)轉基因植物較野生型相比，植物的GSH含量有所提高，增強了對H2O2造成的氧化脅迫的抗性。但目前尚無有關芹菜SAT基因的報道。此外，大量研究表明外源基因在受體植物內(nèi)可能會出現(xiàn)表達效率低、表達產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，因此選擇一個高效的啟動子很重要。研究表明Super-promoter 在煙草植物(Ni et al., 1995, Plant J, 7: 661-676)和煙草‘BY-2’ 懸浮細胞(Lee et al.，2004，J Bacteriol, 186: 7254-7261)、擬南芥植物和懸浮細胞(Kimet al., 2007, Plant J, 51: 779-791 )、玉米植株和懸浮細胞(Narasimhulu et al., 1996,Plant Cell,8: 873-886)等能夠高效的轉化和表達。Super-promoter和常規(guī)使用的啟動子CaMV 35S和木薯花葉病毒相比，很少出現(xiàn)表達沉默(Butaye et al.，2004，Plant J，39:440-449)。全長基因的獲得是生物工程及分子生物學研究的一個重點，我們文庫中獲得的EST多為一些較短的cDNA片斷。因此，通過RACE技術擴增出芹菜基因的全長序列，并對其生物信息學特性進行分析，同時如果能用高效啟動子Super-promoter在植物中過量表達芹菜SAT,那么SAT就可以高效催化Cys合成GSH過程，以達到增強植物的抗氧化能力來提高植物對N03_脅迫耐受力的目的。目前未見使用高效啟動子Super-promoter過量表達芹菜說r基因的植物表達載體的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物過氧化物GSH合成能力的絲氨酸乙酰轉移酶基因的植物表達載體，該載體是含有絲氨酸乙酰轉移酶基因在基因前端為3個章魚堿合成酶啟動子Aocs、甘露堿合成酶啟動子Amas和甘露堿合成酶啟動子組成的組成型超強啟動子，絲氨酸乙酰轉移酶基因SAT的cDNA來源于芳:菜(Apium graveolens L.vardulce.DC.)，芹菜的谷絲氨酸乙酰轉移酶基因SAT的cDNA GenBank登錄號為JQ723687，
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案:
一、說/基因的重組載體nOO-superpromoter-y^M/1的構建
(I)芹菜基因的擴增
①PCR引物
根據(jù)我們文庫中獲得的SAT基因片段的EST序列設計引物(登錄號JK480388)，由上海生物工程公司合成如下引物:
B26:5’ -GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
SATl:5’ - ACTACGCCACAACCAACAGC-3’
SAT2:5’ -CTTTCTCCAATGATGCTGCTC-3’ ；
②用上述反轉錄產(chǎn)物進行PCR，反應體系如下:
權利要求
1.一種絲氨酸乙酰轉移酶基因的植物表達載體，其特征在于:含有絲氨酸乙酰轉移酶 基因，在基因前端為3個章魚堿合成酶啟動子Aocs、甘露堿合成酶啟動子Amas和甘露堿合成酶啟動子組成的組成型超強啟動子。
2.權利要求1所述的絲氨酸乙酰轉移酶基因的植物表達載體在制備耐鹽的轉基因植株中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有芹菜絲氨酸乙酰轉移酶基因且能提高植物抗高NO3-能力的專用植物表達載體1300-superpromoter-AgSAT，本發(fā)明是利用RACE的方法從芹菜中克隆出SAT基因，用組成型超強啟動子Super-promoter在煙草葉片中過量表達，并通過葉盤轉化法將其轉入野生型煙草中，實驗結果表明在轉基因煙草中SAT基因能夠正常轉錄，在高NO3-環(huán)境條件下，轉入SAT基因和的生長情況比對照植株(未轉基因的野生型)要好，說明過量表達SAT基因能夠很大程度的提高增加轉基因煙草中SAT的酶活性和GSH合成量，同時谷胱甘肽還原酶活性的增強也導致了GSH含量的提高。因此也更有效地提高轉基因煙草抗氧化能力，從而增強其對高硝酸鹽的耐受能力。
文檔編號A01H5/00GK103215306SQ20131013334
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權日2013年4月17日
發(fā)明者李昆志, 王玉英, 徐慧妮, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學