用于免疫檢驗(yàn)的病毒樣顆粒、用于所述免疫檢驗(yàn)的封閉劑、及包含它們的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000?] 本發(fā)明涉及用于免疫檢驗(yàn)的病毒樣顆粒(virus-like particle)、用于該免疫檢 驗(yàn)的封閉劑(blocking agent)、及包含該病毒樣顆粒和該封閉劑的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 使用各種顆粒作為免疫檢驗(yàn)傳感器（immunoassay sensors)的方法是已知的（專 利文獻(xiàn)1~8)。例如，專利文獻(xiàn)1或?qū)＠墨I(xiàn)2中公開了利用熒光半導(dǎo)體納米顆?；蚨趸?顆粒作為免疫檢驗(yàn)中的檢測(cè)元件的方法，該方法是利用納米顆粒發(fā)射的熒光進(jìn)行免疫檢驗(yàn) 的方法。
[0003] 專利文獻(xiàn)8中公開了一種納米顆粒綴合物(nanoparticle conjugate)，所述納米 顆粒綴合物包含作為核心的金屬材料、磁性材料或半導(dǎo)體材料以及綴合至其上的各種肽。
[0004] 具有乙型肝炎病毒表面抗原、且在位于該抗原的N末端的Pre-si及Pre-S2區(qū)域以 串聯(lián)的方式插入有2個(gè)源自蛋白質(zhì)A的與抗體的Fc區(qū)域?qū)?yīng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Z標(biāo)簽)的病毒樣 顆粒（下文中有時(shí)稱為ZZ-BNC)，是在使用酵母經(jīng)基因重組而制造的L型乙型肝炎病毒顆粒 的Pre-Si及Pre-S2區(qū)域插入有2個(gè)源自蛋白質(zhì)A的與抗體的Fc區(qū)域?qū)?yīng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Z標(biāo) 簽)的病毒樣顆粒(專利文獻(xiàn)9)。專利文獻(xiàn)10中公開了上述病毒樣顆粒的制造方法及其作為 藥物傳遞系統(tǒng)的有用性。
[0005] 著眼于該BNC-ZZ所具有的作為傳感器元件的高性能，專利文獻(xiàn)3的實(shí)施例中公開 了使用酶標(biāo)記抗體和BNC-ZZ的組合的方法、利用經(jīng)熒光標(biāo)記的BNC-ZZ的抗體檢測(cè)方法、在 免疫檢驗(yàn)中利用BNC-ZZ的方法。專利文獻(xiàn)6中公開了將BNC-ZZ用于經(jīng)陣列固定的抗體來提 高靈敏度的方法。專利文獻(xiàn)4中公開了將生物素化的BNC-ZZ應(yīng)用于免疫檢驗(yàn)的方法，其在實(shí) 施例中顯示，與未經(jīng)生物素化的BNC-ZZ相比，經(jīng)由鏈親和素而結(jié)合有生物素化HRP酶或生物 素化抗體的生物素化BNC-ZZ的靈敏度增高。
[0006] 專利文獻(xiàn)5中公開了一種方法，用于制造并利用包含不具有Pre-s區(qū)域的蛋白質(zhì)分 子和具有ZZ標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分子的雜合(hybrid)型顆粒，以通過提高BNC-ZZ顆粒所具有的抗 體結(jié)合能力來提高免疫檢驗(yàn)的靈敏度。此外，專利文獻(xiàn)7的實(shí)施例中公開了通過將抗體較弱 地交聯(lián)于經(jīng)熒光標(biāo)記的BNC-ZZ上來同時(shí)檢測(cè)多種抗原的方法。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1:日本特表2006-517985號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2:日本特表2002-544488號(hào)公報(bào)
[0011 ] 專利文獻(xiàn)3:日本特開2007-127626號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)4:日本特開2008-191143號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)5:日本特開2010-096677號(hào)公報(bào)
[0014] 專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-121276號(hào)公報(bào)
[0015] 專利文獻(xiàn)7:日本特開2010-210444號(hào)公報(bào)
[0016] 專利文獻(xiàn)8:日本特表2007-506084號(hào)公報(bào) [0017] 專利文獻(xiàn)9:日本特開2001-316298號(hào)公報(bào) [0018] 專利文獻(xiàn)10:日本特開2004-002313號(hào)公報(bào) [0019]非專利文獻(xiàn)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 1: Vaccine 19,3154-3163,2001

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 在免疫分析中，為了提高靈敏度，通常采用以下方法中的任一種：（1)利用對(duì)檢測(cè) 元件的檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)具有高親和性的檢測(cè)元件；（2)增強(qiáng)與檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)結(jié)合后的檢測(cè)元 件所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度。在將如上所述的BNC-ZZ用作檢測(cè)元件時(shí)，其對(duì)檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)的親和 性恒定。因此，增強(qiáng)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度是最有效的手段。
[0022]但是，在公開了利用BNC-ZZ的方案的專利文獻(xiàn)4中，作為利用生物素化BNC-ZZ的方 法，僅僅公開了利用已為人們所熟知的生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合能力、使HRP結(jié)合量 升高從而增強(qiáng)信號(hào)的方法，并沒有對(duì)BNC-ZZ進(jìn)行研究。
[0023] ZZ-BNC具有源自蛋白質(zhì)A的抗體結(jié)合部位，與免疫檢驗(yàn)中的重要抗體(小鼠 IgGi、 大鼠 IgG、綿羊IgGi、山羊IgGi、人IgG3等）的結(jié)合弱，使用方法、使用范圍受到很大限制。進(jìn) 而，由于ZZ-BNC與各種IgG結(jié)合，所以在存在多種抗體的環(huán)境下，例如在抗體夾心ELISA (antibody-sandwich ELISA)中、或在對(duì)存在多種抗體的血清等的評(píng)價(jià)中，會(huì)發(fā)生與目標(biāo)以 外的抗體的結(jié)合，因此，難以進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)。
[0024] 此外，考慮到實(shí)用化時(shí)，由于BNC-ZZ、經(jīng)標(biāo)記的BNC-ZZ和經(jīng)修飾的BNC-ZZ為脂蛋 白，因此會(huì)非特異地結(jié)合于玻璃、塑料。非特異性吸附不僅給免疫分析帶來很大影響，而且 在經(jīng)稀釋溶液的長(zhǎng)時(shí)間保存中也將造成嚴(yán)重的問題。
[0025] 為了解決上述課題，本申請(qǐng)的發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用生物學(xué)活 性分子、通過病毒樣顆粒中包含的具有自組織能力（self-organization ability)的蛋白 質(zhì)的特定部位對(duì)病毒樣顆粒進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，所得到的病毒樣顆?？珊线m地用于免疫檢驗(yàn)。
[0026] 進(jìn)而，本申請(qǐng)的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在使用上述病毒樣顆粒的免疫檢驗(yàn)中，特定的封閉 劑可發(fā)揮優(yōu)異的封閉效果。
[0027] 本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的，包括下述廣泛的技術(shù)方案。
[0028] 項(xiàng)1.免疫檢驗(yàn)用病毒樣顆粒，所述顆粒包含具有自組織能力的蛋白質(zhì)，所述顆粒 在該具有自組織能力的蛋白質(zhì)的至少1個(gè)半胱氨酸殘基上經(jīng)由其一個(gè)或多個(gè)巰基而被生物 學(xué)活性分子修飾。
[0029] 項(xiàng)2.如上述項(xiàng)1所述的病毒樣顆粒，其中，所述具有自組織能力的蛋白質(zhì)為HBsAg 蛋白質(zhì)。
[0030] 項(xiàng)3.如上述項(xiàng)1的病毒樣顆粒，所述具有自組織能力的蛋白質(zhì)含有序列號(hào)1所示的 氨基酸序列。
[0031] 項(xiàng)4.如上述項(xiàng)1~項(xiàng)3中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中，所述具有自組織能力的 蛋白質(zhì)具有抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0032]項(xiàng)5.如上述項(xiàng)1~項(xiàng)4中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中，所述生物學(xué)活性分子為 選自由酶、抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生物素、熒光染料、發(fā)光染料及親和素化合物（avidin compound)組成的組中的至少1種。
[0033]項(xiàng)6.如上述項(xiàng)5所述的病毒樣顆粒，其中，所述酶為堿性磷酸酶及/或過氧化物酶。
[0034] 項(xiàng)7.如上述項(xiàng)4或項(xiàng)5所述的病毒樣顆粒，其中，所述抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由蛋 白質(zhì)A的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)G的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)L的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的 組中的至少1種。
[0035] 項(xiàng)8.如上述項(xiàng)4或項(xiàng)5所述的病毒顆粒，其中，所述抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列號(hào)3~5 中任一個(gè)所示的氨基酸序列構(gòu)成。
[0036] 項(xiàng)9.如上述項(xiàng)5所述的病毒樣顆粒，其中，所述親和素化合物為選自由親和素、鏈 親和素、中性親和素蛋白（neutravidin)、AVR蛋白質(zhì)、Bradavidin、Rhizavidin及 Ta mav i d i η ?組成的組中的至少1種。
[0037] 項(xiàng)10.上述項(xiàng)1~9中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中，生物學(xué)活性分子為抗體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域，并且抗體結(jié)合于該抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0038] 項(xiàng)11.封閉劑，其為使用上述項(xiàng)1~項(xiàng)10中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒的免疫檢驗(yàn)用 封閉劑，該封閉劑包含選自由羥烷基纖維素、聚乙烯醇、環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物及2-甲 基丙稀酰氧基乙基磷酰膽堿（21161:1^(^71〇71(?5^1:117]^11〇8。11〇(311〇1;[116)的共聚物組成的 組中的至少1種。
[0039] 項(xiàng)12.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，所述羥烷基纖維素為羥丙基甲基纖維素。
[0040] 項(xiàng)13.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，所述聚乙烯醇的聚合度為200~5000。
[0041] 項(xiàng)14.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，所述環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物為 Pluronic?。
[0042] 項(xiàng)15.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，所述環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物為 _Plur o:nie?.F 12 7 和/或 P】u ro n i c? P1 〇 5。
[0043] 項(xiàng)16.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿的共聚物 為.B.iolipidur.e?。
[0044]項(xiàng)17.如上述項(xiàng)11所述的封閉劑，其中，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿的共聚物 為 B i ο 丨 i p i du re? 2〇6 及/或 B i ο 1 i p i d u re? 8〇2。
[0045] 項(xiàng)18.免疫檢驗(yàn)用試劑盒，包含上述項(xiàng)1~項(xiàng)10中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒和上述 項(xiàng)11~項(xiàng)17中任一項(xiàng)所述的封閉劑。
[0046] 本發(fā)明的病毒樣顆粒能夠以優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行免疫檢驗(yàn)。
[0047] 在使用本發(fā)明的病毒樣顆粒進(jìn)行的免疫檢驗(yàn)中，本發(fā)明的封閉劑可發(fā)揮降低所得 數(shù)據(jù)的背景和/或使檢測(cè)信號(hào)靈敏化的功能，由此顯著提高S/N比。
[0048]根據(jù)使用本發(fā)明的試劑盒的免疫檢驗(yàn)，能夠顯著提高所得到的數(shù)據(jù)的S/N比。
【附圖說明】
[0049]圖1是表示實(shí)施例5的結(jié)果的圖。
[0050]圖2是表示實(shí)施例6的結(jié)果的圖。
[00511圖3是表示實(shí)施例16的結(jié)果的圖。
[0052]圖4是表示實(shí)施例17的結(jié)果的圖。
[0053]圖5是表示實(shí)施例18的結(jié)果的圖。
[0054]圖6是表示實(shí)施例20的結(jié)果的圖。
[0055]圖7是表示實(shí)施例21的結(jié)果的圖。
[0056]圖8是表示實(shí)施例22的結(jié)果的圖。
[0057]圖9是表示實(shí)施例23的結(jié)果的圖。
[0058]圖10是表示實(shí)施例24的結(jié)果的圖（抗GFP抗體）。
[0059]圖11是表示實(shí)施例24的結(jié)果的圖（HMG單克隆抗體）。
[0060]圖12是表示實(shí)施例25的結(jié)果的圖。
[0061]圖13是表示實(shí)施例27的結(jié)果的圖。
[0062]圖14是表示實(shí)施例28的結(jié)果的圖。
[0063]圖15是表示實(shí)施例29的結(jié)果的圖。
[0064]圖16是表示實(shí)施例30的結(jié)果的圖。
[0065]圖17是表示實(shí)施例31的結(jié)果的圖。
[0066]圖18是表示實(shí)施例32的結(jié)果的圖。
[0067]圖19是表示實(shí)施例33的結(jié)果的圖。
[0068]圖20是表示實(shí)施例34的結(jié)果的圖。
[0069]圖21是表示實(shí)施例35的結(jié)果的圖。
[0070]圖22是表示實(shí)施例36的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0071] <病毒樣顆粒>
[0072] 本發(fā)明的病毒樣顆粒用于免疫檢驗(yàn)方法，并且包含具有自組織能力的蛋白質(zhì)。具 有自組織能力的蛋白質(zhì)在該蛋白質(zhì)的至少一個(gè)半胱氨酸殘基上經(jīng)由其一個(gè)或多個(gè)巰基而 被生物學(xué)活性分子修飾。
[0073] 所謂具有自組織能力的蛋白質(zhì)，是能夠在生物體內(nèi)（特別是細(xì)胞內(nèi)）通過包入 (enclosing)脂雙層膜（例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen)、細(xì)胞膜、核膜等） 而形成病毒樣顆粒的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)沒有特別限定，只要具有半胱氨酸殘基即可，例如可 舉出與具有包膜（envelope )的病毒的出芽（budding)功能有關(guān)的蛋白質(zhì)、包膜蛋白 (envelope protein)、或它們的變異體等。
[0074]具有包膜的病毒沒有特別限定，例如可舉出乙型肝炎病毒(HBV)、鴨乙型肝炎病毒 等屬于嗜肝DNA病毒(Hepadnaviridae)科的病毒；仙臺(tái)病毒(HVJ)等屬于副粘病毒科的病 毒;單純皰疹病毒等屬于皰疹病毒科的病毒;流感病毒等屬于正粘病毒科的病毒;人免疫缺 陷病毒等屬于反轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae)科的病毒等。
[0075]具有自組織能力的蛋白質(zhì)沒有特別限定，例如可舉出乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)蛋白質(zhì)（其是與HVB的出芽功能有關(guān)的蛋白質(zhì)）、蛋白質(zhì)F(其是與HVJ的出芽功能有 關(guān)的蛋白質(zhì)）、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)（hemagglutinin neuraminidase protein)、或它 們的變異體。其中，HBsAg蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)F、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)、它們的變異體等是優(yōu) 選的。
[0076]變異體沒有特別限定，只要具有至少一個(gè)的半胱氨酸殘基、并且發(fā)揮如上所述的 能夠形成病毒樣顆粒的作用即可。引入的突變的具體數(shù)量也沒有特別限定，只要所得到的 變異體滿足上述條件即可。通常，突變引入數(shù)可為使得得到的變異體與突變前的氨基酸序 列具有85%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選99%以上的同一性的數(shù)量。
[0077]需要說明的是，此處所謂的突變，包括取代、缺失、插入等。作為具體的突變引入方 法，可以不受特別限制地采用已知的方法，例如要進(jìn)行取代時(shí)，可采用保守取代 (conservative substitution)技術(shù)。術(shù)語"保守取代技術(shù)"是指，氨基酸殘基被具有相似側(cè) 鏈的氨基酸殘基所取代。
[0078] 保守取代技術(shù)包括例如具有賴氨酸、精氨酸、組氨酸等堿性側(cè)鏈的氨基酸殘基彼 此之間的取代。作為保守取代技術(shù)的其他例子，包括:具有酸性側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如天 冬氨酸和谷氨酸)彼此之間的取代;具有非帶電性極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)彼此之間的取代;具有非極性側(cè)鏈的 氨基酸殘基(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸） 彼此之間的取代;具有分枝側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)彼此之間 的取代;具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)彼此之間 的取代。
[0079] 術(shù)語"同一性"是指，2條以上可進(jìn)行比較的氨基酸序列之間相同的氨基酸序列的 程度。因此，2條氨基酸序列或核苷酸序列之間的同一性高，這些序列的同一性或相似性就 高。對(duì)于氨基酸序列之間的同一性的水平，例如，使用序列分析工具FASTA，基于缺省參數(shù) (default parameters)進(jìn)行確定。這些分析方法的具體技術(shù)是已知的，可參照美國(guó)國(guó)家生 物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI)的網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0080] 作為HBsAg，沒有特別限定，例如可舉出含有序列號(hào)1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì) 等，作為該HBsAg的變異體，例如可舉出專利文獻(xiàn)5、9中公開的HBsAg變異體等。作為蛋白質(zhì) F，沒有特別限定，例如可舉出由NCBI的網(wǎng)站上登記的登記號(hào)為NP_056877;版本：NP_ 056877.1GI :9627226所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)等。作為血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)， 沒有特別限定，例如可舉出由NCBI的網(wǎng)站上登記的登記號(hào)為NP_056878;版本：NP_ 056878.1GI :9627227所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)等。
[0081] 具有自組織能力的蛋白質(zhì)具有半胱氨酸殘基，通過半胱氨酸殘基上的一個(gè)或多個(gè) 巰基而被生物學(xué)活性分子修飾。半胱氨酸殘基沒有特別限定，但優(yōu)選為位于基于具有自組 織能力的蛋白質(zhì)形成的病毒樣顆粒的表面、且