piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。所述表達(dá)載體是通過(guò)將含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段連接到pCyL50質(zhì)粒上構(gòu)建得到的。將該載體導(dǎo)入豬的基因組，并采用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明的表達(dá)載體具有piggyBac轉(zhuǎn)座子，極大地提高了轉(zhuǎn)基因效率，且將普通質(zhì)粒串聯(lián)重組的轉(zhuǎn)基因整合模式變成了單位點(diǎn)單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內(nèi)環(huán)境。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法為各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備提供了一條新的思路，同時(shí)也對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物模型的制作提供一種簡(jiǎn)便高效的方法。
【專利說(shuō)明】piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種攜帶報(bào)告基因和抗性基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體:pPB-CMV_Neo/EGFP及其構(gòu)建方法，以及piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因的概念是隨著研究者首次通過(guò)原核顯微注射法生產(chǎn)出攜帶外源基因的小鼠而產(chǎn)生的。在過(guò)去的三十三年時(shí)間里，為提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率，研究者們發(fā)展了數(shù)種方法，但是最受研究者們歡迎的還是通過(guò)將線性化的轉(zhuǎn)基因DNA利用原核顯微注射法來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備。利用原核顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有十分明顯的優(yōu)點(diǎn):如它所需要的儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，而其他方法都會(huì)對(duì)儀器設(shè)備有特殊的要求，特別是慢病毒介導(dǎo)法，需要特制的儀器設(shè)備以提高安全性；但最重要的還是因?yàn)樵孙@微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有很好的穩(wěn)定性，尤其在轉(zhuǎn)基因小鼠制備上，如果有足夠的受精卵進(jìn)行原核顯微注射，就可以保證獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。然而在制備轉(zhuǎn)基因家畜大型哺乳動(dòng)物上，如牛、羊、豬等，由于卵母細(xì)胞中的高脂類(lèi)含量，使得常規(guī)的光學(xué)顯微鏡因難以分辨清細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，或是在操作過(guò)程中需要處理單個(gè)細(xì)胞胚胎，因此使用原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因家畜的效率并不聞。
[0003]另一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法是胞漿內(nèi)精子注射法，即利用精子作為轉(zhuǎn)基因載體，來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因的插入，然而與原核顯微注射法一樣，該方法在轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率上高，但被研究者證明在轉(zhuǎn)基因豬的制備上卻被證明效率不高，因此也不適合轉(zhuǎn)基因家畜的制備。
[0004]目前，通過(guò)體細(xì)胞核移植的方法來(lái)生產(chǎn)家畜已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，且該技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越成熟。然而利用該方法生產(chǎn)動(dòng)物效率只有2%。在進(jìn)行體細(xì)胞核移植之前，還需要對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，如果這一步驟的效率也不高，將大大降低最后轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率。通過(guò)對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，再進(jìn)行體細(xì)胞核移植，成為一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物切實(shí)可行的辦法。而對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造所利用載體，經(jīng)歷了從早期的隨機(jī)整合的質(zhì)粒DNA載體、病毒載體,到睡美人(Sleeping Beauty)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。近年來(lái)另外一種轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，即PiggyBac (pB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，最初是從粉紋夜蛾中分離出來(lái)的，也已經(jīng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，并且取得了大量的研究進(jìn)展。但暫并沒(méi)有見(jiàn)到利用PiggyBac (PB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合體細(xì)胞克隆法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0007]—種piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體的構(gòu)建方法,包括以下步驟:[0008](I)、以 SEQ ID NO: 5 的質(zhì)粒為模板，SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 為引物，PCR 擴(kuò)增出序列號(hào)為SEQ ID NO: 3的含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段； [0009](2)、分別用SalI酶切步驟I的loxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段與質(zhì)粒pCyL50，純化，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，SalI進(jìn)行酶切鑒定，得到piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP，序列號(hào)為SEQID N0:4。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(I)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 3min ;98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0011 ] 本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP，序列號(hào)為 SEQ ID N0:4。
[0012]本發(fā)明還提供了 piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0013](I)、將表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系，篩選可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；
[0014](2)、將獲得的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，注射到卵母細(xì)胞中，構(gòu)建重構(gòu)胚胎，采用常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行培育，即可得到PiggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬。
[0015]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述共轉(zhuǎn)染的步驟為:
[0016](I)、把表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEM'? I 中，混勻；
[0017](2)、加入7yL用前混勻的PLUS?Reagents，混勻后靜置5min ；
[0018](3)、加入 21 μ L 用前混勻的 Lipofectamine?LTX，混勻后靜置 30min ；
[0019](4)、用DMEM洗單層細(xì)胞1_2次，加入1000 μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右輕晃混勻，4-6h后換上含有10%胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB的摩爾數(shù)比為3:1。
[0021]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選步驟為:
[0022]轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍單層細(xì)胞，加500 μ g/mLG418篩選濃度培養(yǎng)基4mL，隔天換液，置于39°C，5%C02，飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)至有單個(gè)的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí)，分離出單個(gè)的細(xì)胞克隆，并做擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0023]本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因豬。
[0024]本發(fā)明 申請(qǐng)人:已經(jīng)證明利用piggyBac (pB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作是十分高效的。PiggyBac (pB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括2個(gè)質(zhì)粒載體:pB轉(zhuǎn)座子載體和mPB轉(zhuǎn)座酶載體，其中pB轉(zhuǎn)座子載體攜帶著轉(zhuǎn)座元件和目的基因，轉(zhuǎn)座元件可使PB轉(zhuǎn)座子載體以轉(zhuǎn)座方式整合進(jìn)入細(xì)胞基因組，目的基因則是本發(fā)明 申請(qǐng)人:所要研究的對(duì)象；mPB轉(zhuǎn)座酶載體則會(huì)表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，負(fù)責(zé)對(duì)PB轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)座元件外的無(wú)用序列進(jìn)行切割，提高PB轉(zhuǎn)座子載體的整合效率。而且，由于PiggyBac (pB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的主動(dòng)整合特性，除了整合效率高之外，它較普通質(zhì)粒載體還具有單拷貝多位點(diǎn)整合的特點(diǎn)，這樣進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:[0026]1、本發(fā)明的表達(dá)載體采用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，將普通質(zhì)粒串聯(lián)重組的轉(zhuǎn)基因整合模式，變成了單位點(diǎn)單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內(nèi)環(huán)境。該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)含有多克隆位點(diǎn)MCS，可以方便地進(jìn)行載體重構(gòu)建，以便研究感興趣的基因；還攜帶有EGFP綠色熒光標(biāo)記、Neo抗性篩選標(biāo)記，便于檢測(cè)和篩選細(xì)胞系，其1xP重組位點(diǎn)，也可以方便后期刪除。
[0027]2、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法提供了一種高效制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，為各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備提供了一條新的思路，同時(shí)也對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物模型的制作提供一種簡(jiǎn)便高效的方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖譜，其中M為marker，I為EGFP-Neo融合雙標(biāo)記片段的PCR產(chǎn)物；
[0029]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建得到的載體pPB-CMV-Neo/EGFP的圖譜，其中，PB3’和PB5’為轉(zhuǎn)座子載體中的轉(zhuǎn)座元件，MCS為多克隆位點(diǎn)，CMV為Neo/EGFP融合基因的啟動(dòng)子，Neo為新霉素抗性基因，EGFP為綠色熒光蛋白基因，BGH polyA為終止信號(hào)，AmpiR為氨芐抗性基因；
[0030]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中的轉(zhuǎn)基因豬綠色熒光檢測(cè)結(jié)果，其中A部分為活體照片，B部分為解剖照片，藍(lán)光為熒光燈藍(lán)光激發(fā)條件下所拍照片，自然光為自然條件下所拍照片；轉(zhuǎn)基因代表獲得的轉(zhuǎn)基因豬，野生型為同期出生的同品種杜洛克非轉(zhuǎn)基因豬。
[0031]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中的轉(zhuǎn)基因豬PCR、Southern blot結(jié)果，其中A部分，M為DNA Marker, I至8為8只不同轉(zhuǎn)基因豬的DNA樣品；9，10為非轉(zhuǎn)基因豬DNA對(duì)照；最后一條泳道是質(zhì)粒對(duì)照；A部分第一張圖代表目的基因EGFP片段PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，第二張圖代表轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，第三張圖是β-actin為內(nèi)參基因?qū)φ?；B部分，M為DIG標(biāo)記的Marker，IC是將帶有EG FP基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的I個(gè)拷貝的陽(yáng)性對(duì)照，3C是將帶有EGFP基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的5個(gè)拷貝的陽(yáng)性對(duì)照，5C是將帶有EGFP基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的10個(gè)拷貝的陽(yáng)性對(duì)照；1至8為8只不同轉(zhuǎn)基因豬DNA的EGFP基因片段southern blot雜交結(jié)果，9，10為非轉(zhuǎn)基因豬DNA對(duì)
昭.>、、、?
[0032]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中的piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)與普通質(zhì)粒篩選綠色突光單克隆細(xì)胞團(tuán)的效率對(duì)比圖，其中A部分為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在藍(lán)色熒光燈下的成像，左邊是普通的EGFP質(zhì)粒
[0033]pT2AL200R175-CAGGS-EGFP轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞的結(jié)果，右邊為piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞的結(jié)果，B部分是分別統(tǒng)計(jì)piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和普通EGFP質(zhì)粒
[0034]pT2AL200Rl75-CAGGS-EGFP轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞所獲得的陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0035]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0036]如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)施例中所使用的試劑均來(lái)源于市售，操作方法均為現(xiàn)有常規(guī)操作方法。[0037]實(shí)施例1攜帶報(bào)告基因與抗性基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體φΡΒ-CMV-Neo/EGFP的構(gòu)建
[0038]包括以下步驟:
[0039]1、擴(kuò)增含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段
[0040]以質(zhì)粒PPSP-PB-neoEGFP-XynB-manA(SEQ ID NO: 5，這個(gè)質(zhì)粒是經(jīng)過(guò) 申請(qǐng)人:采用改造常規(guī)手段，PCR、酶切以及連接的方法改造而成的)為模板，設(shè)計(jì)引物，5'加酶切位點(diǎn)Sail，擴(kuò)增出含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段；引物序列分別如下:
[0041]Neo/EGFP-F:
[0042]5’ -GTCGACCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC-3’ (SEQ ID NO:1);Neo/EGFP-R:
[0043]5’-GTCGACGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ (SEQ ID NO:2)PCR 的反應(yīng)體系為
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)、以SEQID NO: 5的質(zhì)粒為模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2為引物，PCR擴(kuò)增出序列為SEQ ID NO:3的含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段； (2)、分別用SalI酶切步驟I的loxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段與質(zhì)粒pCyL50，純化，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，SalI進(jìn)行酶切鑒定，得到PiggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP，序列為SEQ ID N0:4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(I)中所述 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 3min ；98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
3.權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP，序列為 SEQ ID N0:4。
4.一種piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)、將權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系，篩選可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； (2)、將獲得的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，注射到卵母細(xì)胞中，構(gòu)建重構(gòu)胚胎，采用常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行培育，即可得到PiggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)染的步驟為: (1)、把表達(dá)載體pPB-CMV-N eo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEM? I 中，混勻； (2)、加入7μ L用前混勻的PLUS?Reagents，混勻后靜置5min ； (3)、加入21μ L用前混勻的Lipofectamine?LTX，混勻后靜置30min ； (4)、用DMEM洗單層細(xì)胞1-2次，加入1000μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右輕晃混勻，4-6h后換上含有10%胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體pPB-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB的摩爾數(shù)比為3:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選步驟為: 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍單層細(xì)胞，加500 μ g/mLG418篩選濃度培養(yǎng)基4mL，隔天換液，置于39°C，5%C02，飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)至有單個(gè)的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí)，分離出單個(gè)的細(xì)胞克隆，并做擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因豬。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103468732SQ201310320502
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】徐志謙, 吳珍芳, 鄒嫻, 李紫聰, 劉德武, 張獻(xiàn)偉, 曾芳, 周榮, 曾海玉 申請(qǐng)人:吳珍芳, 李紫聰