專利名稱：利用piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法。
背景技術(shù)：
piggyBac轉(zhuǎn)座子是一種功能強(qiáng)大的轉(zhuǎn)基因載體，piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基 因研究技術(shù)在昆蟲、哺乳類動(dòng)物上均已有獲得成功的研究報(bào)道，但在水產(chǎn)動(dòng)物上未見相關(guān) 艮道O XMiI-H Macropodus opercularis (Linnaeus)屬于倉(cāng)盧形目 Perciformes 攀倉(cāng)盧禾斗 Anabantidae，是一種廣泛分布于我國(guó)南方及東南亞各國(guó)的內(nèi)陸小型淡水觀賞魚，具有來(lái)源 廣、易于傳代和飼養(yǎng)容易等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明將PiggyBac轉(zhuǎn)座子引入到水產(chǎn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 中，利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子為載體，將綠色熒光蛋白基因整合到叉尾斗魚基因組內(nèi)，這一技 術(shù)不僅能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育成具有特異性功能叉尾斗魚新品種，而且還 是首次將PiggyBac轉(zhuǎn)座子引入到水產(chǎn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，為轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物導(dǎo)入外源基 因開辟了新的方法，具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚方法，是利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子為載體，將綠色熒光蛋白基因整合到叉尾斗魚基因組 內(nèi)，創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下(1)采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建獲得帶有綠色熒光標(biāo)記基因的piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒及 能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，PiggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒包含piggyBac轉(zhuǎn)座子的2個(gè)轉(zhuǎn)座臂、Amp 抗性基因、A3啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白標(biāo)志基因和SV40的多聚腺苷酸識(shí)別序列，輔助質(zhì)粒包 含piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個(gè)轉(zhuǎn)座臂、Amp抗性基因、A3啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)座酶基因；(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，將piggyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒 導(dǎo)入叉尾斗魚受精卵，即轉(zhuǎn)基因Gtl代叉尾斗魚，飼養(yǎng)至成魚以交配續(xù)代，即轉(zhuǎn)基因G1代叉尾 斗魚，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時(shí)期，通過(guò)選擇熒光標(biāo)志基因獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因叉尾 斗魚；(3)育成的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚能夠用于基因功能研究的實(shí)驗(yàn)材料和提升其觀賞價(jià)值。所述的采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法的注射時(shí)間是產(chǎn)卵后1小時(shí)以內(nèi)、處于單細(xì)胞時(shí) 期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的PiggyBac質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒分別都溶 解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，兩種質(zhì)粒以ng/μ 1為單位的濃 度比率為10 1 1 2，顯微注射時(shí)這兩種質(zhì)粒的總濃度為30ng/l·! 1 900ng/μ 1 ；每 粒受精卵注射質(zhì)粒的總體積為0. Snl 5nl。轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗(yàn)證方法為通過(guò)熒光體視顯微鏡篩選表
3達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā) 射波長(zhǎng)為5IOnm 550nm。本發(fā)明具有的有益效果是本發(fā)明可以借助熒光標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體，這種轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基 因叉尾斗魚能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種。 另外，開拓了 PiggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因魚研究的先河，為拓寬轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的研究 空間打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖1是piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2是輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖3是G1代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測(cè)結(jié)果之一。圖4是&代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測(cè)結(jié)果之二。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:采用顯微注射方法，將攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記基因的piggyBac質(zhì)粒(如 圖1所示)及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(如圖2所示)按10 1比率混合，2種質(zhì)粒 的總濃度為30ng/y 1，質(zhì)粒溶解在0. ImM含有ImM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后在叉尾斗 魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)采用顯微注射方法導(dǎo)入受精卵中，導(dǎo)入部位為受精卵動(dòng)物極，導(dǎo)入總體積 為5nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的G1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時(shí)期開始，通過(guò)熒光顯微鏡(Olympus， SZX12，日本)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗魚，激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為5IOnm 550nm。一共注射了 1209粒受精卵，Gtl代獲得了 121尾叉尾斗魚，G1代中有6尾叉尾斗魚為 轉(zhuǎn)基因魚。在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，EGFP分別在尾部(2尾)、眼部(3尾)和 腹部(1尾)表達(dá)。將上述6尾轉(zhuǎn)基因魚中的4尾魚(尾部1尾、眼部2尾和腹部1尾)，采用 PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因已成功導(dǎo)入了叉尾斗魚中(如圖3所示)。PCR 上下游引物分別為5 ‘ -ACGACGGCAACTACAAGACC-3 '和 5 ‘ -GCGGAGAATGGGCGGAACT-3 ‘。 在圖3中，泳道1為非轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚的陰性對(duì)照；泳道2和3為pPIGA3GFP質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì) 照；泳道4至7為G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚陽(yáng)性魚，其中泳道4為尾部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、 泳道5、6為眼部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道7為腹部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚。Marker為分 子標(biāo)記，單位為bp，從上而下條帶分子量為2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0實(shí)施例2 采用顯微注射方法，將攜帶EGFP標(biāo)志基因的piggyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座 酶的輔助質(zhì)粒按1 2比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為900ng/yl，質(zhì)粒是溶解在2mM含 有SmM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后在叉尾斗魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)導(dǎo)入受精卵中，導(dǎo)入總體積 為0.8nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)G1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時(shí)期開始，通過(guò)熒光顯微鏡(Olympus， SZX12，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗魚，激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 5IOnm 550nmo轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)一共注射了 908粒受精卵，獲得了 81尾叉尾斗魚，G1代中有5尾叉尾斗 魚為轉(zhuǎn)基因魚。在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，分別在尾部(1尾)、眼部(3尾)和 腸道(1尾)具有綠色熒光表達(dá)。對(duì)上述5尾轉(zhuǎn)基因魚采用PCR實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)了 EGFP標(biāo)記 基因的成功轉(zhuǎn)入(如圖4所示)，PCR上下游引物分別為5 ‘ -ACGACGGCAACTACAAGACC-3 ‘ 和5 ‘ -GCGGAGAATGGGCGGAACT-3 ‘。在圖4中，泳道1為非轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照。泳道2表示 PPIGA3GFP質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；泳道3至7為G1代5尾轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，其中泳道3為尾部表達(dá) EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道4、5、6為眼部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道7為腸道表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn) 基因魚；Marker為分子標(biāo)記，單位為bp，從上而下條帶分子量為4500bp，3000bp，2250bp， 1500bp,IOOObp,750bp,500bp,250bp。實(shí)施例3 采用顯微注射方法，將攜帶GFP標(biāo)記基因的PiggyBac質(zhì)粒(圖1)及其能夠提供 轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按3 1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為120ng/yl，質(zhì)粒溶解在 0. 5mM含有3mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后在叉尾斗魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)顯微注射導(dǎo)入受精 卵中，導(dǎo)入部位為受精卵動(dòng)物極，導(dǎo)入總體積為2nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的G1叉尾斗魚的胚胎發(fā) 育時(shí)期開始，通過(guò)熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗 魚，激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為5IOnm 550nm。一共注射了 873粒受精卵，獲得了 119尾叉尾斗魚，G1代中有6尾叉尾斗魚為轉(zhuǎn)基 因魚。在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，EGFP有在尾部(2尾)和眼部(4尾)表達(dá)的 個(gè)體。采用PCR技術(shù)也證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因的成功轉(zhuǎn)入。轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚飼養(yǎng)再至成魚 交配產(chǎn)卵續(xù)代。綜上所述，利用piggyBac轉(zhuǎn)座子已獲得能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)EGFP熒光標(biāo)記基因 的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，證明PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以作為水產(chǎn)動(dòng)物的一個(gè)轉(zhuǎn)基因載體。
權(quán)利要求
一種利用piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建獲得帶有綠色熒光標(biāo)記基因的piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒包含piggyBac轉(zhuǎn)座子的2個(gè)轉(zhuǎn)座臂、Amp抗性基因、A3啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白標(biāo)志基因和SV40的多聚腺苷酸識(shí)別序列，輔助質(zhì)粒包含piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個(gè)轉(zhuǎn)座臂、Amp抗性基因、A3啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)座酶基因；(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，將piggyBac質(zhì)粒及其能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒導(dǎo)入叉尾斗魚受精卵，即轉(zhuǎn)基因G0代叉尾斗魚，飼養(yǎng)至成魚以交配續(xù)代，即轉(zhuǎn)基因G1代叉尾斗魚，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時(shí)期，通過(guò)選擇熒光標(biāo)志基因獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚；(3)育成的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚能夠用于基因功能研究的實(shí)驗(yàn)材料和提升其觀賞價(jià)值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚方法，其特征在于所述的采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法的注射時(shí)間是產(chǎn)卵后1小時(shí)以內(nèi)、 處于單細(xì)胞時(shí)期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的PiggyBac質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助 質(zhì)粒分別都溶解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，兩種質(zhì)粒以ng/ μ 1為單位的濃度比率為10 1 1 2，顯微注射時(shí)這兩種質(zhì)粒的總濃度為30ι^/μ1 900ng/ μ 1 ；每粒受精卵注射質(zhì)粒的總體積為0. 8nl 5nl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚方法，其特征在于轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗(yàn)證方法為通過(guò)熒光體 視顯微鏡篩選表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為 460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 5 IOnm 550nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用piggyBac轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法。是先構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)將這兩種轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入到叉尾斗魚受精卵內(nèi)，依靠piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特性，使綠色熒光蛋白基因?qū)氲讲嫖捕肤~基因組內(nèi)，并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。本發(fā)明可以借助熒光標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體，這種轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種。另外，開拓了piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因魚研究的先河，拓寬了轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的研究空間。
文檔編號(hào)C12N15/65GK101979597SQ201010504599
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者危浩, 葉少群, 莊蘭芳, 楊國(guó)梁, 王軍毅, 鐘伯雄, 高強(qiáng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué);浙江省淡水水產(chǎn)研究所