專利名稱：一種花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種花生根系的二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其 編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微量營養(yǎng)元素鐵是各種生物生長發(fā)育的必需元素，植物缺鐵會(huì)嚴(yán)重抑制植物的生 長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。而植物又是動(dòng)物和人類最根本的食物來源，因此促進(jìn)植物 對(duì)環(huán)境中鐵的吸收、植物體內(nèi)合理運(yùn)轉(zhuǎn)和籽粒鐵的累積對(duì)于提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)而促進(jìn) 人體健康具有重要的意義。對(duì)植物生長而言鐵是第三大限制性營養(yǎng)元素，這主要是由于在 有氧環(huán)境中鐵的溶解性很低(Yi et al.，1994)。實(shí)際上，全世界三分之一以上的土壤都缺 鐵，為了適應(yīng)缺鐵脅迫，植物在長期進(jìn)化過程中形成了從土壤中獲取鐵的機(jī)理I和機(jī)理II 適應(yīng)性反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制(Romheld et al.，1986)。機(jī)理I植物包括雙子葉和非禾本科單 子葉植物。缺鐵時(shí)根系伸長受阻，根尖部分直徑增加，并產(chǎn)生根毛，根部形態(tài)發(fā)生變化，F(xiàn)e3+ 還原酶的活性增加，受ATP酶控制的質(zhì)子分泌增加，使根際pH降低，提高鐵的有效性。機(jī) 理II植物主要是禾本科單子葉植物，它們在缺鐵時(shí)無機(jī)理I植物的上述根形態(tài)學(xué)和生理學(xué) 上的變化，而只是根系中植物鐵載體的合成和釋放量增加。隨著研究的不斷和分子生物學(xué) 技術(shù)的快速發(fā)展，植物吸收利用鐵的分子機(jī)制也逐漸研究清楚，具體而言，機(jī)理I植物缺鐵 時(shí)主要表現(xiàn)為根細(xì)胞質(zhì)膜上鐵還原酶基因FRO將三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵(Yi et al.，1996)， 然后通過根細(xì)胞質(zhì)膜上的二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT將二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到根細(xì)胞內(nèi)供植物吸收利用 (Vert et al.，2002)。而對(duì)于機(jī)理II植物而言，在缺鐵條件下主要通過體內(nèi)合成并分泌麥 根酸鐵載體，釋放到根際麥根酸將鐵螯合，再通過細(xì)胞質(zhì)膜上的YSl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將麥根酸鐵 螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)到根細(xì)胞內(nèi)(Curie et al.，2001)。在植物中第一個(gè)分離鑒定的Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白基因是IRTl (iron-regulated transporter 1)，隨著研究的不斷深入，研究者們逐漸發(fā) 現(xiàn)植物中除了 IRTl基因能轉(zhuǎn)運(yùn)Fe (II)外，還有其它的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即NRAMP基因家 族。NRAMP為天然抗性相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein, NRAMP)，該基因家族是能夠編碼疏水的膜蛋白，在不同物種的進(jìn)化上具有高度的 保守性(Cellier et al.，1995)。在模式植物擬南芥中NRAMPl基因研究得相對(duì)比較清楚， 研究表明擬南芥中AtNRAMPl基因能夠跨膜運(yùn)輸鐵，當(dāng)植物細(xì)胞需要鐵時(shí)，貯存在液泡內(nèi) 的鐵通過跨膜運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，以保證植物對(duì)鐵的需求平衡(Curie et al.，2000)，同時(shí) AtNRAMPl也能夠轉(zhuǎn)運(yùn)錳，參與了植物根系從土壤中吸收錳(Cailliatte et al.，2010)。而 對(duì)于番茄中LeNRAMPl而言則可能對(duì)鐵在微管組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要作用(Bereczky et al.，2003)。因此，NRAMP基因家族對(duì)于控制鐵在植物根細(xì)胞內(nèi)平衡和向籽粒中轉(zhuǎn)運(yùn)等過程 中具有重要的作用，該基因家族功能的研究對(duì)通過生物學(xué)手段培育富含高鐵含量和人體能 夠有效吸收的作物籽粒并進(jìn)而改善人類鐵營養(yǎng)缺乏具有較大的優(yōu)勢和潛力。花生(Arachis hypogaea L.)是繼大豆之后另一個(gè)重要的油料作物，同時(shí)也是能 夠進(jìn)行生物固氮的豆科植物，然而，花生缺鐵黃化現(xiàn)象在北方石灰性土壤地區(qū)極其普遍，是花生高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因子之一(Zuo et al.，2000)。實(shí)際上，許多雙子葉植物在石灰 性土壤上都不同程度的存在缺鐵問題，提高花生鐵的利用效率和生物固氮具有重要的實(shí)踐 意義和生態(tài)意義?；ㄉ鳛闄C(jī)理I植物，目前有關(guān)花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhNRAMPl基因還沒有相關(guān)的 研究報(bào)道，因此，該基因家族功能的研究將為提高和促進(jìn)作物對(duì)環(huán)境中鐵的吸收、體內(nèi)運(yùn)輸 和向籽粒轉(zhuǎn)移的提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)依據(jù)，從而進(jìn)一步為從分子育種或基因工程培 育耐鐵花生品種提供重要的技術(shù)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhNRAMPl。本發(fā)明從豆科植物花生中分離到花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AhNRAMPl，核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示，共有2041bp，包括5'端非編碼區(qū)，一個(gè)完整的開放閱讀框和包含 PloyA尾巴的3'端非編碼區(qū)，表明是完整的核苷酸編碼序列，SEQ ID No. 1所述序列自5' 端第32-1666堿基為該基因的編碼區(qū)，編碼了 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所提供的花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhNRAMPl蛋白，其為1)由SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。該AhNRAMPl蛋白由545個(gè)氨 基酸組成，具有12個(gè)跨膜區(qū)域。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活 性區(qū)段，將第(91)位的(L)替換為(S)，或是將第(30)位的(I)缺失，或是在(172位后面) 增加(一個(gè)K)。因此，本發(fā)明的花生AhNRAMPl蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、 替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有花生AhNRAMPl蛋白同等活性的由花生AhNRAMPl 蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到 密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特 定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供AhNRAMPl基因在植物耐低鐵脅迫或提高植物種子中鐵 含量中的應(yīng)用。具體是將花生AhRNAMPl基因轉(zhuǎn)化到植物中，提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)低鐵脅迫的 耐受能力或者提高轉(zhuǎn)基因植物種子中鐵的含量。優(yōu)選的植物為豆科植物，更為優(yōu)選的為花生。本發(fā)明提供的AhNRAMPl基因主要在花生根系中表達(dá)，且受缺鐵誘導(dǎo)高效表達(dá)，加 鐵抑制該基因表達(dá)；將AhNRAMPl基因轉(zhuǎn)化到缺失鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因的酵母突變株中，缺鐵條件下 轉(zhuǎn)入AhNRAMPl基因的酵母明顯比轉(zhuǎn)入空載體的酵母長勢好，結(jié)果表明該花生AhNRAMPl基 因?qū)Χr(jià)鐵具有轉(zhuǎn)運(yùn)作用，促進(jìn)了缺失鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因的酵母突變株的生長；將AhNRAMPl基因 轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中，結(jié)果表明該花生AhNRAMPl基因主要定位在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞 膜上；綜合上述，本發(fā)明獲得的AhNRAMPl基因是一個(gè)定位于細(xì)胞膜上，且在轉(zhuǎn)錄水平上受 缺鐵誘導(dǎo)的二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以應(yīng)用于培育富鐵花生品種和耐低鐵花生品種中的應(yīng)用。本發(fā)明首次公開了一個(gè)花生根系二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，獲得了該基因cDNA全長，并得到了其編碼的蛋白序列，同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)從不同角度驗(yàn)證說明了大田 作物花生中該基因具有跨膜運(yùn)輸鐵的生物學(xué)功能，同時(shí)基于此研究結(jié)果，為通過基因工程 或分子育種提高豆科植物鐵利用效率和籽粒鐵的富集提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持， 具有較大的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明花生根系A(chǔ)hNRAMPl基因的3’ RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖2為本發(fā)明花生根系A(chǔ)hNRAMPl基因的5’ RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖3為本發(fā)明酵母表達(dá)載體pDR195-AhNRAMPl圖譜。圖4為本發(fā)明洋蔥表皮細(xì)胞表達(dá)載體35SGFP_AhNRAMPl圖譜。圖5為AhNRAMPl蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析。圖6為AhNRAMP 1與其它植物NRAMP1進(jìn)化樹分析。圖7為AhNRAMPl基因在加鐵和缺鐵條件下轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)差異比較結(jié)果。圖8為AhNRAMPl基因酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果。圖9為AhNRAMPl基因洋蔥表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1將花生種子‘魯花14’(購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)用10%雙氧水消毒20-30分鐘， 清洗干凈后置于飽和硫酸鈣溶液中約8小時(shí)，并同時(shí)通氣避光，然后置于鋪有吸水紙的托 盤中，并用幾層吸水紙蓋好，澆適量的水后避光置于人工培養(yǎng)室中。培養(yǎng)室設(shè)置條件為光 照14小時(shí)30°C，黑暗10小時(shí)22°C。1_2天左右花生發(fā)芽后移入石英砂中培養(yǎng)，待長出1_2 片葉子后轉(zhuǎn)入水培營養(yǎng)液中培養(yǎng)。水培營養(yǎng)液配方如下=KH2PO4(0. 5mM)、K2SO4(0. 75mM)、 KCl (0. ImM)、MgSO4. 7H20 (0. 65mM)、CaSO4. 2H20 (2mM)、H3BO3 (1 μ Μ)、MnSO4. 4H20 (1 μ Μ)、 ZnSO4. 7H20 (1 μ Μ)、CuSO4. 5Η20 (0· 1 μ Μ)、(NH4) 6Μο7024· 4Η20 (0· 005 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，ρΗ 為5· 8 6。實(shí)施例2將已取好保存于-80度冰箱的花生根系及葉片樣品放入已經(jīng)用液氮預(yù)冷的研 缽中，加入液氮迅速研磨植物樣品直至成粉末狀，取出約0. 1克粉末樣品于1. 5毫升無 RNase離心管中，迅速加入1毫升RNA提取液Trizol(購自Invitrogen)。并立即將此樣 品與Trizol的混合液用渦旋震蕩器劇烈震蕩15秒左右，使核蛋白充分解離，室溫靜止5 分鐘，加入200微升氯仿后，充分混勻，靜止5分鐘，放入事先已經(jīng)預(yù)冷到4°C的離心機(jī)中以 12000 X g的速度離心15分鐘，取上清液入新的1. 5毫升的離心管中，加入500微升異丙醇， 上下顛倒充分混勻，室溫放置10分鐘，然后4°C 12000 Xg離心10分鐘，取出后倒掉上清液， 加入1毫升75%的乙醇，渦旋震蕩數(shù)秒以便洗滌沉淀，4°C 7500Xg離心5分鐘，重復(fù)洗滌 兩次，取出后倒掉乙醇，并吸出所有上清液后置于超凈臺(tái)中室溫下風(fēng)干。風(fēng)干后加入適量的DEPC水和RNA酶抑制劑，輕彈離心管讓沉淀充分溶解后放于-20°C或-80°C冰箱中貯存?zhèn)溆谩?shí)施例3利用CLONTECH PCR-Select cDNA Subtraction Kit (購自 Clontech 公司)，用 花生單作，花生/玉米間作中的花生根系樣品進(jìn)行抑制性差減雜交，具體步驟詳見試劑盒 說明書，獲得了 490bp的花生AhNRAMPl基因片段。用已知的片段序列設(shè)計(jì)引物，以花生根系RNA為模板，用Invitrogen公司Super ScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，01igo(dT)15為引物，42°C反應(yīng)得到反轉(zhuǎn)錄CDNA模板。通過 Clonetech 公司 RACE 試劑盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，分 別克隆測序得到AhNRAMPl基因5’及3，端(方法參見所述試劑盒說明書)。5’端克隆引 物為AhNRAMP-5’ -GSP GCCAATCCACGAAGGCAGTGATGAGG3’端克隆引物為AhNRAMP-3’ -GSP AACACAGCAATGCAAACCCATGTGGA擴(kuò)增得到約1500bp的3’端序列(圖1)，500bp的5’端序列(圖2)，再將之前獲 得的中間片段一起拼接得到全長序列。利用拼接的理論全長序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因全長的引物，分別為Ahnramp-F GACTCATCACTTGGATTGACTGTAhnramp-R CTCATACATACATAGCTCAAGTCACTPCR反應(yīng)體系為反轉(zhuǎn)后的根系cDNA稀釋5倍后用2 μ 1，IOX反應(yīng)緩沖液2 μ 1， dNTPs(10mM)0. 5μ 1，MgCl2 (50mM) 0. 5 μ 1，正向引物 Ahnramp-F(0. OlmM) 0. 5 μ 1，反向引物 Ahnramp-R(0. OlmM) 0. 5 μ LddH2O 13. 7 μ l，Taq DNA 聚合酶(Invitrogen 公司)0· 3 μ 1。將 上述混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；94°C變性 30s ；55°C退火 30s ；72°C延伸 2min ；30 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸 IOmin0PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳得到預(yù)期約1. 6kb的DNA條帶，然后進(jìn)行膠回收純化， 獲得該DNA全長。然后將回收得到的DNA連接到pMD20-T載體(TaKaRa公司)，16°C過夜 反應(yīng)，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)，涂于含Amp抗生素的LB板后 37°C過夜培養(yǎng)，挑單克隆于LB液體37°C過夜搖菌，送菌液測序(上海生物工程公司)，將測 序確認(rèn)為正確的質(zhì)粒命名為pMD20-AhNRAMPl質(zhì)粒。經(jīng)測序，AhNRAMPl核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。利用DNAman軟件翻譯得到該基因編碼的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。實(shí)施例4一、水培培養(yǎng)花生，設(shè)置正常供鐵，缺鐵1，4，7，11天，再重新供鐵1，3天7個(gè)處理。 水培的方法參見實(shí)施例1，其中正常供鐵的水培營養(yǎng)液配方如實(shí)施例1所述，缺鐵的水培營 養(yǎng)液是指去除實(shí)施例1所述的配方中的EDTA-Fe后的營養(yǎng)液。分別提取花生根系及葉片 RNA (方法同實(shí)施例2)，利用DNase消化去除可能污染的基因組DNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過 相對(duì)定量Real-time PCR方法，利用18srRNA基因作為內(nèi)參基因，分析AhNRAMPl基因在不 同的供鐵條件下其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。二、相對(duì)定量 Real time PCR
6
在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，首先需要分別含有AhNRAMPl基因及內(nèi)參基因Ahl8srRNA基因 的質(zhì)粒。含有AhNRAMPl基因的質(zhì)粒直接用前述構(gòu)建好的pMD20-AhNRAMPl質(zhì)粒，Ahl8srRNA 基因質(zhì)粒構(gòu)建過程如下首先用KOD-pIus DNA聚合酶(購自Τ0Υ0Β0)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為KOD-pIus DNA 聚合酶 0. 4 μ 1，10XK0D-plus 緩沖液 2 μ 1，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgS040. 8 μ 1，Q18S-F 正向引物 IOuMO. 6 μ 1、Q18S_R 反向引物 IOuM 0. 6μ 1，花 生根系cDNA 1 μ 1，最后用滅菌水補(bǔ)足到20 μ 1體系。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?940C 2min, 94°C 15s, 55°C 30s，68°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin。PCR反應(yīng)后電泳檢測，鑒定得到單一條帶且條帶大小無誤后利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (購自 Invitrogen 公司)，將剩下的 PCR 產(chǎn)物取 1 μ 1，加 0. 5 μ 1 salt soluti。n，ly 1滅菌水，及0. 5yLPCR BlimtTOPO載體，室溫連接約30分鐘，然后將3 μ 1連 接反應(yīng)液加到ToplO感受態(tài)細(xì)胞中(購自Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，冰上放置30分鐘 左右，然后42度水浴放置約45秒，迅速放到冰上，3分鐘后加200 μ 1LB,置于37度搖床搖1 小時(shí)，然后把該菌液涂到含有卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上，37度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)約 13-15小時(shí)后，可見單一的小菌落，挑單菌落于2mlLB培養(yǎng)基中在37度搖床搖12小時(shí)左右， 提取質(zhì)粒得到T0P0-Ahl8srRNA質(zhì)粒，進(jìn)一步測序鑒定分析，保證所有堿基序列無誤后選擇 該質(zhì)粒待用。把pMD20-AhNRAMPl質(zhì)粒及內(nèi)參基因TOPO-Ahl8srRNA質(zhì)粒稀釋成不同的濃度梯 度，使拷貝數(shù)分別為IO3, IO4, IO5, IO6, IO7,分別以此為模板1 μ 1，同時(shí)用花生的根系及葉片 樣品RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋5倍加2 μ 1為模板，反應(yīng)體系為TaKaRa SYBR Greenpremix 6. 25 μ 1，ROX Reference Dye 0. 25 μ 1，正向反向引物各0. 2 μ mol，然后以滅菌水補(bǔ)足到 12. 5μ 1 體系，應(yīng)用 Applied BiosystemsStepOne Plus Real Time PCR System 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min30s ；95°C變性15s ；58°C退火30s ；72°C延伸30s， 同時(shí)收集熒光；40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s。最后通過計(jì)算得到 AhNRAMPl基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)值。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明該花生AhNRAMPl基因主要在根系中表達(dá)，且表達(dá)量在 缺鐵的條件下明顯增強(qiáng)，加鐵時(shí)表達(dá)受到抑制，說明AhNRAMPl基因是一個(gè)受缺鐵條件誘導(dǎo) 的基因。相對(duì)定量Real time PCR引物通過引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5. 0及結(jié)合 oiigoe軟件設(shè)計(jì)獲得，引物分別為Q18S-F CCGTCTCAAACAAGAACAAAACCQ18S-R TCACACCAAGTATCGCATTTCGQnramp-F CCTCATCACTGCCTTCGTQnramp-R ATTGCTGTGTTATCCTTGGTC實(shí)施例5在已知的AhNRAMPl基因序列編碼區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物，包括編碼區(qū)，且反向引物包括 終止密碼子，并在正反向引物5’端分別加上酶切位點(diǎn)Xba I和Sac I，引物為YNramp-Xba I-F TCTAGAATGGCAAGCGTTCTTAGACAYNramp-Sac I-R GAGCTCTTATTCCGGTAGTGGGATAT
用KOD-plus DNA聚合酶PCR擴(kuò)增加酶切位點(diǎn)AhNRAMPl基因全長，PCR反應(yīng)體系為 10XK0D-plus 緩沖液 2μ l，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgS040. 8 μ 1，正向反向引物分別 IOuM 0. 6μ 1，花生根系cDNAly l，K0D-plus DNA聚合酶0. 4 μ 1，加滅菌水至20 μ 1體系。PCR反 應(yīng)體系為 94°C 2min，94°C 15s，57°C 30s, 68°C lmin30s，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR 反應(yīng)后 電泳檢測鑒定條帶大小正確后，取1 μ IPCR產(chǎn)物，利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit 進(jìn)行連接反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化涂板，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序分析確定該質(zhì)粒序列無誤(具體同前)。實(shí)施例6將實(shí)施例5構(gòu)建的質(zhì)粒用Xba I和Sac I進(jìn)行酶切，雙酶切體系為質(zhì)粒20 μ 1， Buffer M 5μ 1，Xba I和Sac I酶各2 μ 1，滅菌水21 μ 1以補(bǔ)足到50 μ 1體系。并同時(shí)酶 切載體質(zhì)粒PDR195 (Inoue et al.，2009)，體系同上，電泳并切膠回收含有Xba I和Sac I 酶切位點(diǎn)的AhNRAMPlcDNA全長的目的條帶即XbaISac IAhNRAMPl。用Xba I和Sac I酶切后的載體質(zhì)粒PDR195進(jìn)行堿性磷酸酶處理，體系為45 μ 1 酶切后質(zhì)粒，5 μ 1 H緩沖液，1μ 1堿性磷酸酶(購自NEB，New England Biolabs)，49 μ 1滅 菌水，37度放置1小時(shí)。然后用苯酚氯仿異戊醇抽提載體PDR195的酶切片段，無水乙醇沉 淀及70%乙醇洗滌，干燥沉淀后用20 μ 1的滅菌雙蒸水溶解。隨后用Takaraligation Kit Mix連接酶切處理后的載體PDR195和XbaISac IAhNRAMPl基因。連接反應(yīng)體系為PDR195 載體 0. 5 μ 1，XbaISac IAhNRAMPl 基因 4 μ 1，ligation Kit solution 4·5μ1，連接反應(yīng) 過夜。然后進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測序進(jìn)一步確定序列的正確性，獲得 PDR195-AhNRAMPl 質(zhì)粒。酵母轉(zhuǎn)化及酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)主要試劑配制10XTE 0. IM Tris, IOmM EDTA 調(diào)節(jié) pH 至 7. 5，121 度高壓滅菌 20minIOXLiAc 即IM醋酸鋰，稱取10. 2g醋酸鋰加適量高純水溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH 值到7. 5，定容到100ml, 121度高壓滅菌20min50% PEG :50g PEG 加水定容到 100ml，120 度高壓滅菌 20minYPD培養(yǎng)基20g蛋白胨、IOg酵母提取物、20g葡萄糖，加水定容到1L，調(diào)節(jié)pH為 4. 7SD 平板(IL) (NH4) 2S045g、MgS04500mg、NaCl 500mg、CaCl2500mg、KH2P048 50mg、 K2HP04150mg、H3B03500 μ g、CuS0440 μ g、KI 100 μ g、FeCl3200 μ g、MnS04400 μ g、 Na6Mo7024200 μ g、ZnS04400 μ g、生物素 20 μ g、泛酸 2mg、葉酸 2ug、肌醇 10mg、煙酸 400 μ g、 對(duì)氨基苯酸200 μ g、維生素B6400 μ g、核黃素200 μ g、維生素B1400 μ g、色氨酸20mg、亮氨 酸100mg、組氨酸20mg、葡萄糖20g、瓊脂粉20g，加水定容至1L，121度高壓滅菌后倒約30 個(gè)平板。將缺失高親和力及低親和力鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因fet3、fet4的酵母突變體株 DEY1453 (Inoue et al.，2009)接種少量加入 3ml YPD，pH 為 4. 7 的培養(yǎng)液中，30 °C 搖 16-18小時(shí)至飽和，測定0D600值，再用三角瓶裝50mlYPD中加適量該菌液使0D600值調(diào) 節(jié)至0. 2-0. 3, 30 0C搖3-4小時(shí)至0D600約0. 4-0. 6，把得到的菌液IOOOg 5min 25 "C離 心，去上清加8ml TE，混勻后1000g 5min 25°C離心，去上清后在沉淀的菌中加入1200 μ 1 滅菌水、150 μ 1 10 X TE及150 μ 1 10 X LiAc，震蕩數(shù)秒使菌株懸浮起來。同時(shí)取PDR195， PDR195-AhNRAMPl分別10 μ 1加入80 μ 1滅菌水和10 μ 1已經(jīng)過煮沸處理的鮭魚精DNA，將
8前面已處理好的含TE及LiAc的突變株菌懸浮液100 μ 1也分別加入到該質(zhì)粒溶液中，震蕩 混勻，加 480 μ 1 50% PEG,60 μ 1 10ΧΤΕ 及 60 μ 1 10 X LiAc 后 30 度搖 30min，再加 70ul DMSO (二甲基亞砜)溫和混勻，然后42度水浴15min，冰上放置90s，短暫離心后去上清，加 200 μ 1滅菌雙蒸水并輕輕混勻。取100 μ 1涂于加鐵的SD平板上。約2天左右長出菌落。挑單菌落30度過夜搖菌后，測定0D600值，再用三角瓶裝的25ml YPD將0D600值 調(diào)節(jié)稀釋為0. 2，接著搖4-5小時(shí)后，分別取Iml菌液離心30s，去上清，加Iml滅菌水渦旋混 勻，離心30s，去上清，再加ImllOXTE渦旋混勻，離心30s，去上清，再加Iml滅菌水重復(fù)洗 2遍，最后加300ul滅菌水渦旋混勻，測定0D600值，用滅菌水將0D600值稀釋調(diào)節(jié)為0. 1， 然后依次稀釋10倍，得到0D600值分別為10—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3,10_4濃度梯度的菌液，然后分別將 該菌液依次點(diǎn)10 μ 1于缺鐵的SD平板，放置30°C培養(yǎng)室培養(yǎng)2天左右，比較酵母的生長狀 況。結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明在缺鐵條件下，轉(zhuǎn)入AhNRAMPl基因的酵母長勢明顯優(yōu) 于轉(zhuǎn)入空載體的酵母，說明該AhNRAMPl基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵的能力。實(shí)施例7根據(jù)載體上的酶切位點(diǎn)及參考AhNRAMPl基因序列選擇合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)加 酶切位點(diǎn)PCR引物獲得全長，引物為Nramp-Xho I-F CTCGAGATGGCAAGCGTTCTTAGACANramp-Bgl II-R AGATCTGTTCCGGTAGTGGGATATCAG用KOD-plus DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體方法同前，確定序列準(zhǔn)確無誤后，用 TaKaRa ligation Kit Mix連接酶將酶切處理后的35S-GFP載體和含有Xho I及Bgl II 酶切位點(diǎn)的AhNRAMPl基因連接，得到35S-GFP-Ahnramp載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后用QIAGEN質(zhì)粒提 取試劑盒獲得高純度的質(zhì)粒，然后將準(zhǔn)備好的質(zhì)粒1 μ g進(jìn)行金粉包裹處理，加10 μ 1金粉， 10 μ 1 2. 5Μ CaCl2及4111 0. IM亞精胺并充分渦旋混勻。同時(shí)做對(duì)照處理空載體質(zhì)粒。利 用 Biolistic PDS-1000/He ParticleDelivery System(Bio-Rad，Tokyo，Japan)，將處理好 的載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中，28度避光孵育4小時(shí)左右后用激光共聚焦顯微鏡(LSM510， Karl Zeiss)觀察表達(dá)的GFP熒光。結(jié)果如9所示，結(jié)果表明該AhNRAMPl基因定位于洋蔥表皮細(xì)胞膜上。
權(quán)利要求
花生根系A(chǔ)hNRAMP1蛋白，其為1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白的花生AhRNAMPl基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求2或3所述的基因在植物耐低鐵脅迫或提高植物種子中鐵含量中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將花生AhRNAMPl基因轉(zhuǎn)化到植物中，提高 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)低鐵脅迫的耐受能力或者提高轉(zhuǎn)基因植物種子中鐵的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為豆科植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為花生。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開了花生二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhNRAMP1，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了編碼上述蛋白的基因。運(yùn)用本發(fā)明提供的AhNRAMP1培育的豆科植物新品種可以提高對(duì)鐵利用的效率和提高籽粒中鐵的含量。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101955522SQ20101050402
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者左元梅, 張福鎖, 熊宏春, 王朋飛, 申紅蕓 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)