專利名稱：抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的rna、重組體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物醫(yī)藥及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利 用逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白(FPN1)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾體系(Retro-FPN)，并將其運(yùn)用到鐵 代謝相關(guān)疾病的藥物開發(fā)制備當(dāng)中。
背景技術(shù)：
RNAi指的是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA 時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。
RNA干擾過程主要有2個步驟(1)長雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (2)小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些 酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，該復(fù)合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的 mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。
1998年，安德魯'法厄(Andrew Z. Fire)等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans) 中進(jìn)行反義RNA抑制實驗時發(fā)現(xiàn)，作為對照加入的雙鏈RNA相比正鏈或 反鏈RNA顯示出了更強(qiáng)的抑制效果(Fireetal., 1998)。從與靶mRNA的 摩爾比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強(qiáng)于理論上1:1配對時的抑制 效果，因此推測在雙鏈RNA引導(dǎo)的抑制過程中存在某種擴(kuò)增效應(yīng)并且有 某種酶活性參與其中。隨后，又相繼發(fā)現(xiàn)具有RNase III活性的Dicer可將 長的雙鏈RNA加工成稱之為siRNA (small interfering RNA)的21 23nt 及3 '端突出的短的雙鏈RNA， siRNA與若干個蛋白組成稱之為RISC復(fù)合 物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白復(fù)合物，并由該復(fù)合物 主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。2001年，Tuschl等將短的siRNA導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞 中并由此解決了在哺乳細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應(yīng)， 由此拓展了RNAi在基因治療上應(yīng)用前景。RNAi機(jī)制普遍存在于生物種 中，因此被認(rèn)為是進(jìn)化上相對保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)帝'J。一種假說為，RNAi 機(jī)制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機(jī)制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機(jī)制中的相關(guān)一些因子如內(nèi)源性
雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其范 圍已經(jīng)超越了 PTGS (post transcriptional gene silencing)，如RNAi機(jī)制同 樣參與了轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控過程中。2006年，安德魯'法厄與克 雷格.梅洛(Craig C.Mdlo)由于在RNAi機(jī)制研究中的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生 理及醫(yī)學(xué)獎。
由外界導(dǎo)入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的 RNA酶切割成21~23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作small interfering RNA(siRNA)，其特征是3'端相對于互補(bǔ)鏈突出兩個堿基。完成 上述過程后，siRNA上結(jié)合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白復(fù)合物。在RISC復(fù)合物中，siRNA 依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉(zhuǎn)換為單鏈，進(jìn)而RISC被活化?；罨?RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)(guide strand),序列特異性地結(jié)合在標(biāo)靶 mRNA上并切斷標(biāo)耙mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。迄今為止已 鑒定出包括Dicer在內(nèi)的若干個與RNAi有關(guān)的蛋白因子。在果蠅 (Drosophila melanogaster) RISC中，已知存在著稱為Argonaute2(AG02) 的因子，AG02蛋白的表達(dá)受到抑制時，RNAi效應(yīng)缺失，也就是說AG02 是果蠅RNAi機(jī)制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切 割酶活性(slicer activity), RNAi機(jī)制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主導(dǎo)。另外，幾個RNA解旋酶(RNA helicase)也被鑒定為參與 RNAi機(jī)制的因子。在秀麗隱桿線蟲(C. degans)的RNAi中必須的因子 有EGO 1 ，這是一種RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存 在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標(biāo)靶mRNA作為模板，以導(dǎo)入的 dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA，在細(xì)胞內(nèi)針對于標(biāo)靶mRNA合成 新siRNA的酶。這一反應(yīng)在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在 人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機(jī)制的基 本框架雖然相同，但存在著微妙差異。
RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究 的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi 模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(GOF) 方法更具優(yōu)勢。因此,RNAi在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個重
4要工具。同時，那些在耙標(biāo)實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以 被進(jìn)一步開發(fā)成為RNAi藥物。
在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)方面，RNAi技術(shù)已獲得了廣泛的應(yīng)用。生物 技術(shù)公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細(xì)胞，然后通過 觀察細(xì)胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導(dǎo)的 腫瘤細(xì)胞生長來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。 一旦所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)儆诳捎盟幍?靶標(biāo)(如表達(dá)的蛋白在細(xì)胞膜上或被分泌出細(xì)胞外)，就可以針對此靶標(biāo) 進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)還可用RNAi技術(shù)在細(xì)胞水 平或動物體內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA 已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。然而要將RNA 干擾技術(shù)運(yùn)用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)以及表達(dá)效 率等重要問題。
shRNA即短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA)。在RNAi感染過程中，產(chǎn) 生dsRNA的一個有效方法就是在體內(nèi)表達(dá)一個短發(fā)夾RNA，這種shRNA 包含兩個短反向重復(fù)序列(其中一個與目的基因互補(bǔ))，中間由一個loop 序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，從而降 解目的基因抑制其表達(dá)。
1831年，F(xiàn)ordisch證明缺鐵性貧血患者血液中鐵含量比健康人低，確認(rèn) 了鐵是人體必需微量元素之一。鐵廣泛參與機(jī)體的代謝過程，如血紅蛋白、 肌紅蛋白、激素以及DNA等的合成,還能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞殺菌及吞噬功能， 維護(hù)T、 B細(xì)胞增殖、分化及抗體的產(chǎn)生(Folin等.1991)。長期以來，人們對 鐵與健康的關(guān)系，多著眼于鐵缺乏的危害，如導(dǎo)致缺鐵性貧血、缺鐵吞咽困 難綜合征等疾病。然而，近年來有關(guān)鐵過多引起的健康問題越來越引起人 們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，過多的鐵會產(chǎn)生有毒性的自由基，繼而損傷細(xì)胞， 造成遺傳性血色素病、神經(jīng)退行性疾病等。因此，體內(nèi)必需具有嚴(yán)格的調(diào)節(jié) 機(jī)制,以保持鐵代謝的平衡。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferroportinl， FPN1)，又稱鐵 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)體l (Fe2regulated transporter 1， IREG1)或金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(metal transport protein 1， MTP1)，是一種跨膜的鐵輸出蛋白。
2000年，三個研究小組幾乎同時分離鑒定了編碼該蛋白的基因。 Donovan等首先采用定位克隆的方法從低血色素貧血的斑馬魚中分離鑒定出導(dǎo)致該癥的基因，命名為Ferroportin 1 (FPN1)。與此同時，Abboud和McKie
等分別用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)和消減雜交法鑒定了該基因，并分別 命名為MTP1和REG1 。目前對Ferroportin的研究已成為鐵代謝研究的熱點問
題之一。
人的FPN基因定位于2號染色體上，長度20kb，含8個外顯子，其mRNA 的5'末端非翻譯區(qū)含有一個典型的鐵反應(yīng)元件IRE。 FPN mRNA編碼的蛋 白有571個氨基酸，分子量約62000，至少含有10個跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種膜 蛋白。
FPN1廣泛分布于機(jī)體多種組織中,其主要功能可能與機(jī)體的鐵代謝 有關(guān)，有可能是細(xì)胞內(nèi)鐵輸出細(xì)胞的唯一通道，其在鐵代謝中有著非常獨(dú) 特的重要地位。此外,FPN1也可能參與鋅、銅等金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。鐵轉(zhuǎn)運(yùn) 紊亂導(dǎo)致的疾病如斑馬魚的低血色素貧血，人的遺傳性血色素沉著癥等均 與FPN異常有關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有的研究資料,FPN1主要功能有以下幾方面
(一)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能
DMT1是哺乳動物細(xì)胞攝取鐵的蛋白。那么鐵的釋放又是如何進(jìn)行的 呢？在一些已經(jīng)進(jìn)行的研究當(dāng)中，將非洲爪蟾的卵母細(xì)胞預(yù)先負(fù)載55Fe , 然后分別注射FPN1 cRNA禾QDMT1 cRNA,在銅藍(lán)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的存在 下,注射FPN1 cRNA的卵母細(xì)胞將80 %的55Fe釋放出來,而注射DMT1 cRNA的卵母細(xì)胞,則極少釋放55Fe 。 Donovan等也證明了表達(dá)FPN1的 卵母細(xì)胞釋放鐵的量比不表達(dá)FPN1的要高5倍。這些結(jié)果證明FPN1蛋 白具有將鐵從細(xì)胞內(nèi)釋放出來的功能。FPN1在與鐵吸收密切相關(guān)的組織 內(nèi)的表達(dá)也進(jìn)一步說明了它的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能。FPN1在十二指腸絨毛細(xì)胞的 基底膜，特別是腸絨毛頂端吸收細(xì)胞的基底膜有表達(dá),在空腸、回腸不表達(dá)。 肝和脾也有較多的FPN1表達(dá)。小鼠免疫組化表明，F(xiàn)PN1表達(dá)在枯否細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)，肝細(xì)胞表面靠近肝血竇一側(cè)和脾的巨噬細(xì)胞。肝和脾在鐵的再循 環(huán)中發(fā)揮重要的作用,肝的枯否細(xì)胞、脾的巨噬細(xì)胞可吞噬衰老的紅細(xì)胞， 在溶酶體的作用下將紅細(xì)胞裂解,血紅蛋白降解后在血紅素氧化酶的作用 下釋放鐵。因此FPN1在這些部位的表達(dá)表明其可能與鐵的貯存和重新利 用有關(guān)。FPN1在胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞也有表達(dá)，并且在妊娠的最后三個月 最高,這一時期也是胎兒需要鐵較多的時期,這表明FPN1在鐵從母體到育的胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)中有著重要作用。急慢性肺病患者機(jī)體的鐵都有高度積累， 由鐵引起的自由基產(chǎn)生將導(dǎo)致組織傷害,鐵的正常轉(zhuǎn)運(yùn)對肺的防御功能很 重要，因此,FPN1在肺和支氣管上皮細(xì)胞也有表達(dá),并受鐵的正調(diào)控。 (二)其它功能
許多金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體并非專一的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。如Gunshin等證明，在轉(zhuǎn)染DMT1 的爪蟾卵母細(xì)胞中，DMT1對Mg2十、Co2+ 、 Cd2 + 、 Cu2 + 、 Zn2 + 、 Ni2+ 、 Pb2+也有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。因此，F(xiàn)PN轉(zhuǎn)運(yùn)其它離子的功能有待研究。 FPN1還具有一個NADP/腺嘌呤結(jié)合位點序列IFVCGP ,該結(jié)構(gòu)域在 NADH和NADPH還原酶家族(包括酵母鐵還原酶和嗜中性白細(xì)胞氧化還 原酶)中都存在,這表明FPN可能具有鐵轉(zhuǎn)運(yùn)還原酶活性。二價和三價鐵都 存在于細(xì)胞復(fù)雜的平衡之中,這兩種氧化還原價態(tài)之間的轉(zhuǎn)化在鐵的轉(zhuǎn)運(yùn) 和螯合中有很重要的作用。
FPN1的發(fā)現(xiàn)對鐵超載或鐵缺乏疾病的診斷和治療有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前 景。例如，斑馬魚weh突變導(dǎo)致低血色素貧血癥，人類也存在相似的由FPNl 突變引起的疾病。最近,有研究表明在第2號染色體上人的FPN1基因的第5 個外顯子內(nèi)734位核苷酸突變,引起氨基酸的改變(Asp變?yōu)镠is)。這一改變可
能引起過多的鐵被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液循環(huán),因此導(dǎo)致遺傳性血色素病的病癥。顯 然，F(xiàn)PN1的發(fā)現(xiàn)有助于相關(guān)疾病的診斷和治療。
很多先天性或者后天性的鐵相關(guān)疾病都與FPN1有關(guān)，傳統(tǒng)的藥物無 法達(dá)到治療效果，或者僅僅可以減輕患者的癥狀,因此，迫切需要開發(fā)新的 給藥形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種能夠有效抑制 體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、從而調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵水平的RNA。
本發(fā)明的另一 目的在于提供編碼上述RNA的DNA。
本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的靶向性、安全性以及持續(xù)表達(dá) 上述RNA、進(jìn)而抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN1)表達(dá)的重組體。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述RNA、 DNA以及重組體在制備藥物 方面的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN1)表達(dá)的RNA，所述 RNA含有以下序列
Seq ID No. 1: 5，- AGACUAUAAUGAUAACACU -3'
在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述RNA為含有以下雙鏈結(jié)構(gòu)的 siRNA:
5，- AGACUAUAAUGAUAACACU -3， 3，-UCUGAUAUUACUAUUGUGA -5, 優(yōu)選地，所述siRNA具有以下結(jié)構(gòu) 5，陽AGACUAUAAUGAUAACACU□ W 3，-D DUCUGAUAUUACUAUUGUGA -5'
其中口口為3'端的兩個突出堿基，可以為AA或UU，或本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的其他形式。
或者，在本發(fā)明另外的實施方式中，所述RNA為同時含有Seq ID Nal 以及SeqIDNo.l的反向重復(fù)序列的短發(fā)夾RNA (shRNA)。
所述shRNA優(yōu)選含有以下序列
Seq ID No.2:
AGACUAUAAUGAUAACACUUUCAAGAGAGUGUUAUCAUUAU AGUCU
本發(fā)明還公開了編碼所述RNA的DNA。
優(yōu)選的，所述DNA含有序列表中S叫ID No.3禾n/或S叫ID No.4所示 的序列。
本發(fā)明還公開了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的重組體，所述重組體 含有上述的DNA以及基因轉(zhuǎn)移載體。
所述基因轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選為病毒性載體，更優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述RNA、上述DNA以及上述重組體在制備用
于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述鐵代謝紊亂疾病是指血清鐵水平高而導(dǎo)致的鐵代謝紊亂疾病，或 者是指FPN1過量表達(dá)而導(dǎo)致的鐵代謝紊亂疾病。
由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果本發(fā)明的RNA，特別是siRNA及shRNA，以及編碼shRNA的DNA 及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、抑制鐵的吸收與代謝， 并降低體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。
本發(fā)明設(shè)計的shRNA經(jīng)過體內(nèi)以及體外實驗證明，能有效的抑制FPN l表達(dá)，有效的調(diào)節(jié)血清鐵的水平。


圖l是Retrovirus逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的多克隆位點圖；
圖2是Retro-FPNli系統(tǒng)感染體細(xì)胞后，F(xiàn)PN 1蛋白的表達(dá)情況圖3是利用retro-FPNi處理細(xì)胞的體外同位素實驗結(jié)果圖，顯示同位
素Fe55的釋放出現(xiàn)明顯的抑制。
圖4是通過高鐵飼料飼養(yǎng)SD大鼠，構(gòu)建高血清鐵動物模型，然后利
用Retrovirus-FPN li系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)實驗，降低血清鐵水平結(jié)果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明利用鐵代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，有針對性的調(diào)節(jié)FPN1的表 達(dá)，設(shè)計特定的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而降低血清 鐵對于細(xì)胞的損害。本發(fā)明的小干擾性RNA以及DNA所編碼的shRNA， 能特異性的識別序列AGACTATAATGATAACACT，該序列位于FPN 1 (NM_014585.3)第2379-2397堿基處。
要將RNA干擾技術(shù)運(yùn)用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達(dá) 持續(xù)以及表達(dá)效率等重要問題。我們利用失活逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶RNA 干擾片段的DNA模板，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成shRNA，完美的解決了RNA干 擾基因治療的靶向性、安全性以及表達(dá)持續(xù)性的問題。
在本發(fā)明中，我們采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體具有廣泛的宿主細(xì)胞以及高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持續(xù)且可控制的基因表達(dá)等特 點，是一種非常適合用于生物藥品開發(fā)的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移載體。通常而言， 基因轉(zhuǎn)移載體可分兩大類病毒性載體和非病毒性載體。非病毒性載體的 方法包括裸DNA注射、基因槍法、多聚賴氨酸或陽離子脂質(zhì)體包裹DNA 法等。 一般非病毒性載體毒性成分少，且較安全。但它們存在共同的弱點 效率低且攜帶基因表達(dá)時間短。所以目前研究仍是一些病毒性載體，如逆 轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用最早，研究 也相當(dāng)成熟，目前仍被廣泛應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點使其成為基因轉(zhuǎn)移載體的上佳選擇。最重要的一點是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并 穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因 組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變。而另幾種整合載體 ——例如腺相關(guān)病毒，以同源重組的方式整合，整合過程中病毒基因組發(fā) 生重排，可能會影響到外源基因的結(jié)構(gòu)與功能。因此,如果能實現(xiàn)有效的基 因轉(zhuǎn)移，基因治療在對付遺傳性疾病、減緩腫瘤發(fā)展、戰(zhàn)勝病毒性感染和 終止神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等方面都會有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明通過合成干擾片段，將片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體當(dāng)中。轉(zhuǎn)染
重組體入Phoenix細(xì)胞，獲取病毒上清，體外以及體內(nèi)實驗證明能夠有效 抑制FPN 1 。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，構(gòu)建了人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN1)的逆 轉(zhuǎn)錄病毒干擾體系(Retro-FPNli)，并取得了良好的抑制效果。 下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實施例l
根據(jù)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN1)序列(NM—000617.1 )，設(shè)計模板鏈 與編碼鏈。分別于5'端加上BglII與XhoI酶切位點，送Invitrogen公司合 成序列。經(jīng)過篩選，獲得干擾效果最為顯著的本發(fā)明的FPN1干擾片斷序 列如下
模板鏈(SeqlDNo.3): 5 ，-GATCCCCAGACTATAATGATAACACTTTCAAGAGAGTGTTATCA
TTATAGTCT TTTTTTA-3,
編碼鏈(SeqlDNo.4): 5'-AGCTTAAAAA AGACTATAATGATAACACT TCTCTTGA AGTGTTATCATTATAGTCT GGGG誦3，
實施例2
Retro-FPN li系統(tǒng)構(gòu)建
一、將合成的FPN1干擾片段(SeqlDNo.3及S叫IDNo.4)進(jìn)行退
火。具體步驟如下1.建立退火系統(tǒng)
5ul 10x退火buffer 2nmole模板鏈S叫ID No.3 2nmole編碼鏈Seq ID No.4 用三蒸水補(bǔ)足至50ul。
2. 放入PCR儀，95°C 5分鐘，75°C 5分鐘，55°C 5分鐘，42°C 5分 鐘，37°C 15分鐘，之后逐步遞減溫度至室溫。
3. 制12% 1 xTAE聚丙烯酰胺膠，取lOul上述退火產(chǎn)物跑膠200V lh。銀染觀察退火條帶。置于-8(TC保存退貨產(chǎn)物。
三、酶切(XbaI與XhoI)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(圖l所示)，膠純化回 收后，用T4連接酶與退火產(chǎn)物室溫連接24小時，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選之后，獲得 正確克隆。送Invitrogen公司測序鑒定，命名為Retro-FPN li系統(tǒng)。具體 操作步驟如下
1.構(gòu)建質(zhì)粒酶切體系
Bgl II 10U
Xhol 腦
10 x Buffer 5ul
BSA 0.5ul
Retro質(zhì)粒(pSUPER) lOul 用水補(bǔ)足50ul， 37°C， 2h。
3. 利用試劑盒(invitrogen)膠純化上述酶切產(chǎn)物。
4. 構(gòu)建連接系統(tǒng)
10 x Buffer 2ul T4連接酶 lul Retro酶切產(chǎn)物 lul 退火產(chǎn)物 5ul 用水補(bǔ)足20ul，16°C， 16h。
4. 取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。
5. 挑取陽性克隆，小量擴(kuò)增質(zhì)粒。
6. 用EcoRI與XhoI酶切鑒定質(zhì)粒，選擇陽性結(jié)果質(zhì)粒，測序保存。
ii實施例3
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-FPN li的生產(chǎn)流程
1、 接種Phoenix細(xì)胞1.5X107個細(xì)胞于9cm培養(yǎng)皿(Corning)中， 37°C， 5%0)2培養(yǎng)過夜；
2、 轉(zhuǎn)染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；
3 、取20ul上述Retro-FPN li與DMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標(biāo)記為A 管，另取20ul脂質(zhì)體與500ulDMEM培養(yǎng)基混勻，標(biāo)記為B管。將A管 與B管混勻，室溫放置30min，將混合物輕輕加入第1步中的9cm培養(yǎng)皿 的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
5、 24小時后加7.5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；
6、 收集細(xì)胞上清并用0.45um濾器過濾，細(xì)胞可以擴(kuò)大培養(yǎng)，持續(xù)收 取病毒上清。
7、 測定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl調(diào)整細(xì)胞滴度至1000VP/ml。
8、 包裝入2ml西林瓶中(每瓶含lml)，保存于-8(TC 。
9、 對病毒進(jìn)行熱源檢測、微生物檢測，確保無熱源，無細(xì)菌、真菌、 野生病毒污染。
實施例4
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-FPN li體外實驗
復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔1乂106個。取Retro-FPN li慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入 P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細(xì)胞株，分別處理0h、 6h、 12h、 24h、 48h，收集細(xì)胞，利用real-time PCR技術(shù)進(jìn)行定量測定FPN 1 mRNA表達(dá)情況，以0h為對照組，可見FPN 1的表達(dá)在12h之后受到明 顯的抑制。如圖2。
實施例5
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-FPN li體外鐵釋放實驗
復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔1乂106個。將細(xì)胞分成 兩組， 一組加PBS， 一組加Retro-FPN li慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加 lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻， 以充分感染細(xì)胞株。按照0h、 12h、 24h、 48h的時間點進(jìn)行Fe55同位素200810141911.0
釋放實驗，發(fā)現(xiàn)在24小時后，鐵的釋放開始受到抑制，48小時后出現(xiàn)明 顯抑制。如圖3. 實施例6
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-FPN li體內(nèi)實驗
選擇3月齡SD大鼠雄雌各20只，高鐵飼料喂養(yǎng)一個月，構(gòu)建高鐵模 型，之后按照性別隨機(jī)分為兩組。
實驗組注射retro-FPN li病毒液，每次劑量為500ul病毒液 (1000VP/ml)，每3天注射一次，3次為一療程；對照組注射PBS等滲 鹽水；
一療程結(jié)束后，分別于3、 6、 9、 12、 15、 18天處死大鼠取腦組織測 鐵，并采集血清按常規(guī)方法利用血清生化儀測定血清鐵濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，從第6天開始，由于鐵的吸收以及釋放受 到抑制病毒組血清鐵濃度開始下降，但是腦組織的鐵含量有顯著上升。如 圖4所示。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說 明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若 干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序 歹U 表 〈110〉錢忠明，葛嘯虎，柯亞
〈120〉抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的RNA、重組體及其應(yīng)用 〈130〉 081010 <160> 4
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 19
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
ag3cuau朋u gauaBcscu 19
〈210〉 2
〈211〉 46
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈400〉 2
agacuauaau gauaacacuu ucaagagagu guuaucauua uagucu 46
〈210〉 3
<211> 61
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
14〈400〉 3
gatccccaga ctataatgat aacactttxa agagagtgtt atcattatag tctgtttttt 60
61
<210> <211> 〈212〉 〈213〉
4
60 腿
人工序列
〈400〉 4
agcttaaaaa agactataat gataacactt ctcttgaagt gttatcatta tagtctgggg 60
權(quán)利要求
1、一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN 1)表達(dá)的RNA，其特征在于所述RNA含有以下序列Seq ID No.15’-AGACUAUAAUGAUAACACU-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為含有以下 雙鏈結(jié)構(gòu)的siRNA:5，隱AGACUAUAAUGAUAACACU -3，3 ，-UCUGAUAUUACUAUUGUGA -5 ，。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為同時含有 S叫IDNo.l及其反向重復(fù)序列的shRNA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNA，其特征在于，所述shRNA含有以下 序列Seq ID No.2:AGUCU 。
5、 編碼權(quán)利要求1 4任意一項所述RNA的DNA。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA，其特征在于所述DNA含有序列 表中Seq ID No.3禾口/或Seq ID No.4所示的序列。
7、 一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的重組體，其特征在于所述重組體 含有權(quán)利要求5或6所述的DNA以及基因轉(zhuǎn)移載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組體，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)移載體為 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
9、 權(quán)利要求1 4任意一項所述的RNA在制備用于治療鐵代謝紊亂 疾病的藥物中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求5或6項所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病 的藥物中的應(yīng)用。
11、 權(quán)利要求7或8所述的重組體在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN 1)表達(dá)的小干擾性RNA。本發(fā)明進(jìn)一步公開了編碼所述小干擾性RNA的相應(yīng)shRNA的DNA以及能表達(dá)所述RNA的重組體。本發(fā)明的小干擾性RNA、DNA以及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、抑制鐵的釋放與代謝，調(diào)節(jié)體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。
文檔編號C12N15/867GK101538568SQ20081014191
公開日2009年9月23日 申請日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者亞 柯, 葛嘯虎, 錢忠明 申請人:香港理工大學(xué)深圳研究院