專利名稱：一種腺苷甲硫氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺苷甲硫氨酸的酶促合成制備方法，具體涉及用固定化的腺苷甲硫氨 酸合成酶催化合成制備腺苷甲硫氨酸，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國是人口大國，同時(shí)也是“肝炎大國”。據(jù)1992年全國病毒性肝炎流行病學(xué)調(diào) 查，全國約有1. 2億人攜帶乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率為3. 1%。我國現(xiàn) 有2000萬例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能轉(zhuǎn)化為肝硬化，甚至肝癌。腺苷甲硫氨酸(SAMe)是人體內(nèi)一種極為重要的中間代謝產(chǎn)物。它可以通過轉(zhuǎn)硫 途徑生成體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化及解毒物質(zhì)——半胱氨酸，再生成另一種關(guān)鍵的抗氧化和解毒 物質(zhì)——谷胱甘肽，解除肝內(nèi)的氧化物應(yīng)激狀態(tài)，從而達(dá)到防治肝病的目的。另外SAMe還可 以促進(jìn)依賴性脂磷脂的合成，降低膽固醇和磷脂的比例，恢復(fù)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，促進(jìn)膽汁的 主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和甘油酸三脂的分泌。因此SAM對肝內(nèi)膽汁郁積、各種急、慢性肝炎以及脂肪肝、 肝硬化等肝臟疾病有很好的療效。SAMe于20世紀(jì)80年代出現(xiàn)在歐洲醫(yī)藥市場上，1999年 美國FDA正式批準(zhǔn)SAMe上市，使其迅速成為暢銷的營養(yǎng)保健品之一，年銷售額超過10億美 元。由于其療機(jī)理清楚、效顯著、起效快、副作用小，近年來在國內(nèi)的需求量也越來越大，有 廣闊的市場前景。目前，SAMe的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法3種。化學(xué)合成法采用S —腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供體 (CH3I)合成，腺苷甲硫氨酸有(R，s)和(S，S)兩種構(gòu)型，只有(S，S)構(gòu)型才有生物活性，但 合成產(chǎn)物中含有大量(R，S)腺昔甲硫氨酸，且難以分離，合成產(chǎn)率也低。發(fā)酵法采用在培養(yǎng)基中添加L-甲硫氨酸，用酵母發(fā)酵生產(chǎn)(一)型腺苷甲硫氨 酸，是60年代至80年代生產(chǎn)腺普甲硫氨酸的主要方法，但發(fā)酵法的缺點(diǎn)是終產(chǎn)物積累量 低、原料轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品生產(chǎn)周期長以及SAM的純化工藝復(fù)雜等，從而導(dǎo)致了腺苷甲硫氨酸 的價(jià)格居高不下，限制了 SAM的廣泛生產(chǎn)機(jī)應(yīng)用。酶促轉(zhuǎn)化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L(fēng) 一甲硫氨酸和ATP生成 (一)型腺昔甲硫氨酸。酶作為生物催化劑具有快速、專一的特點(diǎn)，因此酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)腺 苷甲硫氨酸具有高效、工藝簡單、產(chǎn)品生物活性高且無污染的優(yōu)勢。但是，SAMe合成酶在動(dòng) 物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分離純化困難，因此通過酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)SAMe受到 SAMe合成酶活力的限制，基因工程的發(fā)展使獲得大量高活性的SAMe合成酶成為可能，利用 DNA重組技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)SAMe合成酶的基因工程菌，重組菌表達(dá)SAMe合成酶活性為野生 菌的幾十倍到上百倍，經(jīng)初步分離純化后的游離酶可用于體外SAMe的合成，但游離酶不穩(wěn) 定，容易失活。固定化酶技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，它是模擬體內(nèi)酶的作用方式，通過 化學(xué)或無力的手段，用載體將酶束縛或限制在一定的區(qū)域內(nèi)，使酶分子在此區(qū)域進(jìn)行特有 和活躍的催化作用，并可回收及重復(fù)使用。常用的固定化方法可分為4類吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法。理論上，對于游離的酶，通過固定化處理，可以提高酶在體外的穩(wěn)定 性。但是，不同的酶，由于其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的差異，固定化所選用的方法及載體的不同，其酶活 保留率、穩(wěn)定性及多次使用的酶活回收率等存在很大差別。中國專利CN101285085A公開了一種重組微生物全細(xì)胞催化合成SAMe和利用固定 化細(xì)胞催化生產(chǎn)SAMe的方法，但由于微生物細(xì)胞膜的通透性屏障，使反應(yīng)底物和產(chǎn)物都難 于自由進(jìn)入細(xì)胞，生物催化效率明顯低于酶催化反應(yīng)體系，且由于細(xì)胞中，含有其它很多的 一些雜酶會(huì)利用反應(yīng)底物(如ATP)，使得其它反應(yīng)產(chǎn)物也相應(yīng)增多，后續(xù)的純化工藝也會(huì) 更為復(fù)雜困難。牛衛(wèi)寧等(牛衛(wèi)寧，左曉佳，尚曉規(guī)，等.固定化E.Coli JM109 (pBR322-MAT) 細(xì)胞催化合成S-腺苷甲硫氨酸)利用固定化細(xì)胞合成S-腺苷甲硫氨酸，在反應(yīng)八批次后， 固定化細(xì)胞的酶活性開始下降較為明顯，酶活保存僅為最高酶活性的78%。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中利用SAMe合成酶合成SAMe時(shí)，SAMe合成酶體外不穩(wěn)定、容易 失活的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶酶催化合成(S， S)-腺苷甲硫氨酸的方法，該方法生產(chǎn)效率高，產(chǎn)物得率高，且固定化酶經(jīng)多次使用后，仍有 較高的回收率，酶源更穩(wěn)定。本發(fā)明對SAMe合成酶的固定化方法，可以采用吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)結(jié)合 法、包埋_吸附結(jié)合法或包埋_交聯(lián)結(jié)合法中的任意一種，將SAMe合成酶固定在固定化載 體上。本發(fā)明中，優(yōu)選包埋_吸附結(jié)合法或包埋_交聯(lián)結(jié)合法。本發(fā)明中，所述的固定化載體，可以是聚乙烯醇、明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、磁 性微球中的任意一種，優(yōu)選為海藻酸鹽。本發(fā)明中，通過將游離的腺苷甲硫氨酸合成酶以包埋-交聯(lián)結(jié)合法，固定在載體 海藻酸鹽(海藻酸鈣)上，固定化酶反應(yīng)10批次以上，其酶活回收率仍可保證在80%以上， 且酶催化反應(yīng)活性高，ATP轉(zhuǎn)化率可一直穩(wěn)定維持在80%以上。本發(fā)明催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是將固定化酶加入到底物反應(yīng)體系中底 物反應(yīng)體系包括原料甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)，以及其它金屬離子鹽如含Mg2+、K+的 鹽，在pH為6. 0-7. 5、溫度為35-42度的環(huán)境中進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到腺苷甲硫氨酸。具體地，本發(fā)明催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的方法包括(1)構(gòu)建含腺苷甲硫氨酸合成酶基因的工程菌細(xì)胞；(2)利用所構(gòu)建得到的工程菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)制備腺苷甲硫氨酸合成酶；(3)腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化用海藻酸鹽、殼聚糖或瓊膠材料將腺苷甲硫 氨酸合成酶發(fā)酵液進(jìn)行包埋，并且用戊二醛、無水丁烯二酸-乙烯交聯(lián)，冷藏4°C條件下備 用；(4)酶促反應(yīng)使用經(jīng)固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶，以甲硫氨酸和三ATP為原料 催化合成腺苷甲硫氨酸，(5)分離反應(yīng)結(jié)束后，將固定化酶從反應(yīng)溶液中分離，純水洗滌固定化酶備用。本發(fā)明中，所構(gòu)建的工程菌細(xì)胞包含來源于大腸桿菌Escherichia coli腺苷甲硫 氨酸合成酶的基因；或包含有來源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae腺苷甲硫氨酸合成酶2的基因。本發(fā)明中，在酶促反應(yīng)步驟中，反應(yīng)底物中進(jìn)一步還包括金屬離子鹽，比如含Mg2+、 K+的金屬鹽，可以是氯化鎂、硫酸鎂、硼酸鉀、硼酸鈉等。本發(fā)明中，酶促反應(yīng)的具體條件為將濃度為0. 3-3. Omg/ml的腺苷甲硫氨酸合成 酶，加入到底物反應(yīng)體系中，底物反應(yīng)體系為甲硫氨酸20-60mM、三磷酸腺苷7-20mM、以及 一定量的Mg2+、K+的金屬鹽，反應(yīng)體系的pH為6. 0-7. 5，溫度為35-42°C。本發(fā)明中，載體固定化酶的加入量，0. 3-3. Omg/ml是指將載體固定化酶換算成腺 苷甲硫氨酸酶的量。本發(fā)明中，固定在載體上的酶液，是指用構(gòu)建得到的工程菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)制備腺 苷甲硫氨酸合成酶的粗酶液，也可以是指用構(gòu)建得到的工程菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)制備腺苷甲硫 氨酸合成酶經(jīng)精制后的精酶或純酶液。本發(fā)明中，底物甲硫氨酸可以是D，L-甲流氨酸混合物，也可以是L-甲硫氨酸，當(dāng) 用D，L-甲硫氨酸混合物時(shí)，加入的底物甲硫氨酸的量應(yīng)大于ATP的量。本發(fā)明合成腺苷甲硫氨酸的方法中，進(jìn)一步地還可以包括在分離出固定化酶后的 反應(yīng)液中，進(jìn)一步加入一定量的陰離子試劑，以使腺苷甲硫氨酸成鹽，提高腺苷甲硫氨酸的 穩(wěn)定性。所用的陰離子試劑，是指含陰離子的無機(jī)酸或有機(jī)酸及其鹽，如可以是鹽酸、硫 酸、對甲苯磺酸鹽、丁二磺酸鹽、?；撬猁}、多磷酸鹽、聚乙烯磺酸鹽、聚乙烯磷酸鹽、聚對苯 乙烯磺酸鹽、聚對苯乙烯磷酸鹽或8-18個(gè)碳原子的脂肪酸酰化?；撬猁}中的任意一種，也 可以是其中的任意兩種的混合。應(yīng)用本發(fā)明用固定化酶，催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸，得到的腺苷甲硫氨酸產(chǎn)物中， 95%以上的為具有生物活性的(S，S)-腺苷甲硫氨酸，并且固定化酶與游離酶相比，具有更 好的穩(wěn)定性，可以回收使用，至少循環(huán)使用10次以上，且其活性仍可保留80%以上，解決了 游離酶只能使用1次的問題。


圖1為精制后的酶促反應(yīng)物(S，S)_腺苷蛋氨酸含量測定高效液相色譜圖。具體是實(shí)施例本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng) 域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改 變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。主要材料所用工程菌重組大腸埃希氏菌(攜帶腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因)，公 司自主構(gòu)建，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2299，并已在中國專利申請CN101392230A中公開記載。實(shí)施例1利用含腺苷甲硫氨酸合成酶的基因菌種發(fā)酵制備腺苷甲硫氨酸合成酶一、發(fā)酵液的配制
按以下配方分別配制種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基(1)種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)(％ ):蛋白胨酵母粉氯化鈉=2:1:2(2)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/100ml培養(yǎng)基)葡萄糖1.47蛋白胨0. 4酵母粉0. 55磷酸二氫鉀0. 4磷酸氫二鉀0. 3磷酸氫二鈉0. 35硫酸銨0. 047硫酸鎂0. 05氯化銨0. 01硫酸亞鐵0. 002氯化鈣0.002 硫酸錳0. 0007200mg/ml 氧化四環(huán)素() 0125 (V/V)(3)補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/100ml培養(yǎng)基)葡萄糖1.12酵母粉0. 55硫酸鎂() 035二、發(fā)酵過程(1)將含有重組菌的甘油種以1 100的比例接入一級種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基) 中，37°C、180rpm搖床培養(yǎng)約8個(gè)小時(shí)。(2)將一級種子液以1 20的比例接入二級種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，37°C、 180rpm搖床培養(yǎng)約8個(gè)小時(shí)。(3)將二級種子液以1 6接入種子罐，37°C、溶氧40 60、PH7. 0。(4)當(dāng)種子罐中菌液的0D600 = 1. 5 2. 0時(shí)，按1 10的比例接入發(fā)酵罐中發(fā) 酵，發(fā)酵條件為溫度37°C、溶氧60 90、PH7. 0。(5)在大罐開始發(fā)酵1個(gè)小時(shí)后開始以流加的方式補(bǔ)料。(6)發(fā)酵的過程中監(jiān)控發(fā)酵液的PH值、0D600、溶氧、濁度等各項(xiàng)參數(shù)。發(fā)酵過程如下表所示
發(fā)酵時(shí)間h攪拌轉(zhuǎn)速rpmPH值OD600溶氧濁度02007.00.17800.812806.91.5621.523206.83.5642.833506.85.9653.943806.97.8645.553807.09.2657.063807.010.5638.473806.811.8659.683806.812.56510.9 (7) 8. 5小時(shí)后停止發(fā)酵。8. 5小時(shí)后停止發(fā)酵，取樣用SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳 測定其中SAM合成酶的表達(dá)量，測定目的酶的表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的41. 4%。
6
實(shí)施例2固定化酶的制備(一)吸附-包埋法制備固定化酶1、材料聚乙烯醇、海藻酸鈉、殼聚糖、硼酸、氯化鋇、吸附劑(硅藻土、活性炭或三
氧化二鋁)。2、固定化液的制備稱取一定量的殼聚糖溶于1 %醋酸溶液中，然后加入一定量的硼酸和氯化鋇溶解， 使最終硼酸濃度為4%、殼聚糖濃度為1. 0%、氯化鋇濃度為2%，pH值為5. 0，備用。3、酶液的配制配備一定濃度的pH4. 6醋酸-醋酸鈉緩沖酶液，0. 22um濾膜過濾備用。4、固定化酶的制備配制聚乙烯醇與海藻酸鈉濃度比為9 1的載體溶液，其中聚乙烯醇濃度占8%， 取載體溶液總體積20ml。稱取0. 5g硅藻土，加入適量酶液(酶包埋量40mg)、吸附lOmin， 然后一并加入到聚乙烯醇-海藻酸鈉溶液中，混勻，之后，用注射器吸取該混合液滴到硼 酸_氯化鋇_殼聚糖混合固化液中，固化一定時(shí)間，4°C冰箱備用。包埋-交聯(lián)法制備固定化酶1、材料聚乙烯醇、海藻酸鈉、殼聚糖、硼酸、氯化鋇、吸附劑(硅藻土、活性炭或三
氧化二鋁)。2、固定化酶的制備(1)聚乙烯醇(PVA)固定化酶配置10% PVA的水溶液10ml，加入0. 02g海藻酸 鈉充分溶解，然后與一定濃度的粗酶液混合均勻，使用6號針頭注射器滴入2% CaCl2的飽 和硼酸溶液，邊滴入邊攪拌，在4°C冰箱中固定化8h，在10%甲苯的水溶液通透處理lh，清 洗后備用。(2)海藻酸鈣(CA)固定化酶配置2%海藻酸鈉的水溶液10ml，然后與一定濃度 的粗酶液混合均勻，使用6號針頭注射器滴入2% CaCl2的水溶液，在4°C冰箱中固定化4h， 在10%甲苯的水溶液通透處理lh，清洗后備用。(3)明膠固定化酶將保溫與37°C的10%明膠的水溶液10ml與一定濃度的粗酶 液混勻，鋪成2mm厚的膜，4°C冷卻2h，切成2mm左右的小塊，加入0. 5%戊二醛的水溶液交 聯(lián)30min，10%甲苯的水溶液通透處理lh，洗滌備用。實(shí)施例3酶促反應(yīng)將上述固定化酶按3. Omg/ml (這算成SAM合成酶的量)加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)體 系包括100mM 四硼酸鈉 +50mM K2S04+40mM MgS04+20mM ATP+60mMD, L-Met, 35°C > pH 為 6. 5 的條件下，反應(yīng)8小時(shí)，將固定化酶與反應(yīng)液分離，用純水漂洗固定化酶3-4次，濾干后待下 次使用。實(shí)施例4酶促反應(yīng)將上述固定化酶按0. 3mg/ml (這算成SAM合成酶的量)加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)體 系包括100mM 四硼酸鈉 +40mM MgCl2+20mM ATP+20mM L_Met，30°C、pH 為 7. 0 的條件下，反 應(yīng)8小時(shí)，將固定化酶與反應(yīng)液分離，用純水漂洗固定化酶3-4次，濾干后待下次使用。實(shí)施例5酶促反應(yīng)將上述固定化酶按2. lmg/ml(這算成SAM合成酶的量)加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)體
7系包括80mM 四硼酸鈉 +40mM K2S04+40mM MgS04+30mM ATP+100mMD, L_Met，42°C、pH 為 6. 8 的條件下，反應(yīng)8小時(shí)，將固定化酶與反應(yīng)液分離，用純水漂洗固定化酶3-4次，濾干后待下 次使用。實(shí)施例6酶促反應(yīng)在本發(fā)明允許的范圍內(nèi)，對固定化酶、ATP、D，L-Met的量進(jìn)行適當(dāng)變更，按實(shí)施例 3的方法，進(jìn)行酶促反應(yīng)，合成腺苷甲硫氨酸，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地進(jìn)行實(shí)施。實(shí)施例7SAMe的精制將實(shí)施例5得到的酶促反應(yīng)液通過安伯來特(amberlite) IRC-76 (弱酸性離子交 換樹脂)的交換柱，使SAMe吸附在樹脂上，樹脂用0. 00005mol/L(0. 000IN)硫酸水溶液通 過該交換柱，然后再用0. 2mol/L(0. 4N)硫酸水溶液洗脫SAMe，得到SAMe洗脫液。再將該洗脫液通過安伯來特XAD_4(合成吸附劑)的交換柱，使雜質(zhì)吸附在樹脂 上，得到精制后的含有SAMe的水溶液。將上述含有SAMe的水溶液通過安伯來特IRA-67 (弱堿性離子交換樹脂)的交換 柱，得到除去了過量硫酸根離子的含有SAMe的液體組合物。實(shí)施例8各種固定化酶方法經(jīng)過連續(xù)批反應(yīng)后ATP轉(zhuǎn)化率及酶活回收率的比較按實(shí)施例3的條件，對各種固定化酶進(jìn)行連續(xù)批次反應(yīng)，分別檢測器ATP轉(zhuǎn)化率及 SAM產(chǎn)量、酶活回收率，結(jié)果見表1ATP轉(zhuǎn)化率ATP轉(zhuǎn)化率是通過計(jì)算反應(yīng)前后ATP的含量的比值，間接評價(jià)腺苷蛋 氨酸的產(chǎn)量(理論上認(rèn)為消耗的ATP全部轉(zhuǎn)化為腺苷蛋氨酸)。ATP含量是通過面積歸一 法測定。酶活回收率每批反應(yīng)的酶活回收率是通過每批反應(yīng)后腺苷蛋氨酸的含量與第一 批反應(yīng)結(jié)束后腺苷蛋氨酸的含量的比值得出。表1各種固定化酶批次反應(yīng)后ATP轉(zhuǎn)化率及酶活回收率比較
權(quán)利要求
一種酶催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，包括將腺苷甲硫氨酸合成酶加入到反應(yīng)底物體系甲硫氨酸和三磷酸腺苷中，催化得到腺苷甲硫氨酸，其特征在于，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶是預(yù)先固定在固定化載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的固定化載體為聚乙烯醇、明膠、海藻酸 鹽或殼聚糖中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述的腺苷甲硫氨酸固定到載體上是采 用包埋_吸附結(jié)合法或包埋_交聯(lián)結(jié)合法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法具體包括如下步驟(1)構(gòu)建含腺苷甲硫氨酸合成酶基因的工程菌細(xì)胞；(2)利用所構(gòu)建得到的工程菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)制備腺苷甲硫氨酸合成酶；(3)腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化用海藻酸鹽、明膠或聚乙烯醇材料將腺苷甲硫氨 酸合成酶發(fā)酵液進(jìn)行固定化處理，冷藏于4°C條件下備用；(4)酶促反應(yīng)將固定化酶加入到反應(yīng)底物甲硫氨酸和三磷酸腺苷反應(yīng)體系中進(jìn)行反 應(yīng)，催化反應(yīng)得到腺苷甲硫氨酸；(5)分離反應(yīng)結(jié)束后，將固定化酶從反應(yīng)溶液中分離，純水洗滌固定化酶備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的酶促反應(yīng)步驟中，底物反應(yīng)體系中還 包括金屬離子鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的金屬離子鹽為金屬M(fèi)g2+和/或K+鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的酶促反應(yīng)具體條件為將濃度為 0. 3-3. Omg/ml的腺苷甲硫氨酸合成酶，加入到底物反應(yīng)體系中，底物反應(yīng)體系為甲硫氨酸 20-60mM、三磷酸腺苷7-20mM，以及鎂離子和鉀離子鹽，反應(yīng)體系的pH為6. 0-7. 5，溫度為 30-42 °Co
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，酶促催化反應(yīng)后，所得的腺苷甲硫氨酸中， (s，s)_腺苷甲硫氨酸的重量百分含量不低于90%。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步的步驟包括向所得酶促反應(yīng)液中加入陰離子試 劑，形成腺苷甲硫氨酸鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的陰離子試劑是對甲苯磺酸鹽、丁二磺 酸鹽、?；撬猁}、多磷酸鹽、聚乙烯磺酸鹽、聚乙烯磷酸鹽、聚對苯乙烯磺酸鹽、聚對苯乙烯 磷酸鹽或8-18個(gè)碳原子的脂肪酸?；；撬猁}中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腺苷甲硫氨酸的酶催化制備方法，將腺苷甲硫氨酸合成酶的游離酶固定在固定化載體上，如固定在海藻酸鹽上，與底物反應(yīng)系統(tǒng)甲硫氨酸、三磷酸腺苷及其他金屬鹽離子物質(zhì)反應(yīng)，所得反應(yīng)產(chǎn)物中活性物質(zhì)(S，S)-腺苷甲硫氨酸含量高，且腺苷甲硫氨酸合成酶經(jīng)多批次反應(yīng)后，仍然可保留高活性。
文檔編號C12P19/40GK101979645SQ20101050318
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者侯建華, 關(guān)晶華, 熊國裕, 許曉, 韓智沖 申請人:北京凱因科技股份有限公司;北京凱因生物技術(shù)有限公司