專利名稱：一種用于鼻咽癌早期診斷的外周血7個基因標志物的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體來說涉及一種用于鼻咽癌早期診斷的外周血7 個基因標志物的檢測試劑盒。
背景技術：
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種在我國南方和東南亞地區(qū)常見 的惡性腫瘤，其進展性發(fā)展，稍晚常發(fā)生轉移和擴散。目前鼻咽癌主要依靠放射性治療，中 晚期腫瘤病人的預后仍然很差，I期患者放療后5年生存率可達90%，IV期患者5年生存率 僅30%，因此早期發(fā)現(xiàn)是提高治愈率的關鍵。對鼻咽癌高危人群進行血清學篩查是發(fā)現(xiàn)早 期鼻咽癌的重要途徑。因為血清學指標的改變通常先于臨床癥狀、體征的出現(xiàn)。目前常用 的血清學指標是VCA-IgA、EA-IgA,臨床實驗室常應用間接酶染色方法測定血清VCA_IgA、 EA-IgA抗體的滴度對鼻咽癌進行輔助診斷，但仍有部分患者EBV血清學各項指標均為陰 性，此類患者不能通過EBV血清學篩查出來。同時由于VCA-IgA假陽性也會給EB病毒攜帶 者造成心理壓力。而影像學檢查目前主要用于協(xié)助診斷、確定病變范圍，準確分期、正確制 定治療靶區(qū)，設計放射野、觀察放療后腫瘤消退情況及隨診檢查。因此，為提高鼻咽癌的早 診率，有必要研發(fā)新的診斷方法。基因組技術的出現(xiàn)使人們能夠更全面地了解腫瘤發(fā)生過程中基因水平的改變。表 達譜芯片技術最先應用于對疾病進行分類這一領域。Golub研究小組首先將這一技術應用 于急性髓細白血病與急性粒細白血病的鑒別中，尋找兩種疾病表達譜的差異。隨后這種方 法被廣泛應用于乳腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、結腸癌、肺癌、卵巢癌以及惡性黑色素瘤 的研究之中，提供了大量的有意義的腫瘤分子標志物。其中van’ t Veer等已經鑒定出70 個基因的表達譜可以預測病人的預后，這一研究成果結合臨床分期，組織學類型已經應用 于臨床。同時與其他臨床指標合用可有效的預測病人5年內發(fā)生轉移的可能性，這個是表 達譜芯片在臨床診斷和預測作用的典型代表。但這些樣本主要來源于腫瘤組織，而腫瘤組 織的核酸不易獲取，利用非侵入性檢測手段發(fā)現(xiàn)腫瘤新的分子標志物已成為人們越來越關 心的熱點。Liew等學者提出所謂前哨原則(Sentinel Principle)，即外周血細胞存在獨特 的基因表達譜型，能反映人體組織穩(wěn)定的(遺傳)和動態(tài)的(環(huán)境和疾病的影響)的變化， 他們通過比較外周血細胞與心臟、肝臟、腎臟、腦等9種組織器官的基因表達譜，證明外周 血可以表達人體基因組80%以上的基因，其中包含組織特異性基因。這就提示我們可以通 過檢測外周血中表達譜芯片，可以篩選出具有診斷價值的基因，并用實時熒光定量RT-PCR 診斷鼻咽癌。

發(fā)明內容
為了克服上述技術缺陷，本發(fā)明提供了一種用于鼻咽癌早期診斷的外周血7個基 因標志物的檢測試劑盒。
3
本發(fā)明所提供的用于鼻咽癌早期診斷的外周血7個基因標志物的檢測試劑盒包 含外周血總RNA提取試劑、RT-PCR反應液、實時熒光定量RT-PCR反應液和SVM鼻咽癌診斷 模型，所述實時熒光定量RT-PCR反應液包含引物，所述引物序列如SEQ IDNO :1_16所示的 序列，這些引物序列是7個基因標志物及內參基因GAPDH的SYBRGreen熒光定量RT-PCR檢 測引物，其上游引物(sense)和下游引物(antisense)的核苷酸序列組成如下HERC5Sense TTTCTTACAGGAACTGACAGACTACAAAntisense :ATGTCAGTGCTCTTATAGGGTCTCTTDLG7Sense TCCATTTACTCAGCTGGAGAGGA Antisense :ATCAGGTTACCACCAAAAGAAATGTPPARGSense GCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAntisense CTGGGCGGTCTCCACTGAPLKlSense CATCCTCTACAATGATGGTGACAGAntisense CGCTCATGTAATTGCGGAAAKIF15Sense GAAAAGTTGCGTGCCGAAAAAntisense GCCAGGAGTAGGTCTTACTTGTAAAAGKLHL25Sense GGGCTGTGCACATACCAGTTACAntisense :AAGGTCCCACCCCCAAGAGMYST4Sense GAGCCTACCTGTGAGATTGAAGTGAntisense :AGGGTCAGCATTCTTGAAGCAAGAPDHSense CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCAntisense :CCCAATACGACCAAATCCGTT。所述7 個基因標志物為 HERC5、DLG7、PPARG, PLK1、KIF15、KLHL25 和 MYST4。試劑盒中的外周血總RNA提取試劑為由QIAGEN公司提供的PAXgeneTM BloodRNA Kit (QIAGEN,762174)和 miRNeasy Mini Kit(QIAGEN，217004)。試劑盒中的RT-PCR反應液由Invitrogen公司提供的M-MLV逆轉錄試劑盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA.C28025-032)。試劑盒中的實時熒光定量RT-PCR反應液包括ddH20、Platinum SYBR GreenqPCR SuperMix with ROX(Invitrogen,Carlsbad,CA)和 7 個基因標志物及內參基因 GAPDH檢測用上下游引物。上述7個基因標志物組成的SVM鼻咽癌診斷模型的建立包括以下步驟1)送若干例鼻咽癌病人和正常人外周血總RNA樣品進行人類全基因表達譜芯片檢測；2)用t-testunequal impaired算法篩選出鼻咽癌和正常人外周血中的差異基 因；3)用SVM特征選擇方法篩選出具有判別能力的特征基因；4)利用SYBR Green熒光定量RT-PCR對篩選出的特征基因進行驗證；5)利用SVM選擇合適的核函數和懲罰因子建立鼻咽癌診斷模型，并用封裝程序形 成可操作程序；具體來說，包括如下步驟1)分別送上海生物芯片公司20例鼻咽癌和20例正常人外周血總RNA樣品 (去血紅蛋白mRNA)進行Agilent人類全基因寡核苷酸芯片(Agilent Whole Human GeneExpression Microarray 4X44K array)檢測；2)利用Quantile方法對每個樣本原始數據進行標準化處琿；3)利用Agilent生物芯片平臺采用變異系數(CV)與檢出率評價芯片數據是否可
罪；4)利用 GeneSpring 10. 0 軟件采用 t-test unequal unpaired 算法，將 P < 0· 05 且差異倍數在1. 5倍以上的基因確定為差異基因；5)通過SVM特征選擇的方法篩選出具有判別能力的特征基因共7個，并建立由7 個基因標志物組成的SVM判別模型；6)用Real-time PCR驗證7個特征基因是否與芯片數據一致；7)利用SVM選擇合適的核函數和懲罰因子建立鼻咽癌診斷模型，并用封裝程序形 成可操作程序。本發(fā)明還提出了上述試劑盒的使用方法，包括以下步驟1)待檢測樣本血液樣品的收集；2)待檢測樣本血液樣品中總RNA的提取純化；3) RT-PCR 以Olig (dT)為逆轉錄引物，總RNA為模板，進行逆轉錄反應合成cDNA ；4) SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測利用cDNA作為模板，以權利要求2所述的 7個基因標志物的熒光定量檢測引物作為引物，進行實時熒光定量PCR反應，獲得7個基因 標志物在外周血樣本中的相對表達量；5)待檢測樣本結果的判定根據待檢測樣本外周血樣品中7個基因標志物的相對 表達量，利用權利要求3所述的SVM鼻咽癌診斷模型得出外周血樣本的診斷結果。具體來說，包括以下步驟1)待檢測樣本外周血樣品的收集使用QIAGEN公司的BD PAXgeneRNA采血管收 集病人外周血樣品；2)待檢測樣本外周血樣品中總RNA的提取純化同時使用QIAGEN公司的PAXgene Blood RNA Kit和miRNeasy Mini Kit提取純化外周血中的總RNA，并用瓊脂糖電泳鑒 定提取的總RNA ；3)逆轉錄反應使用Invitrigen公司的M-MLV逆轉錄試劑盒，使用總RNA為模板， 以Olig(dT)為逆轉錄引物，進行逆轉錄反應合成cDNA ；4) SYBR Green熒光定量RT-PCRPCR檢測根據GenBank提供的7個基因標志物及內參基因GAPDH的相關序列，應用Primer 5軟件設計，經BLAST軟件同源性分析選擇了特 異性很好，并且經過實驗鑒定引物可以成功檢測7個基因標志物在待檢測樣本外周血中的 相對表達量，以該7個基因標志物熒光定量檢測上下游引物作為引物，利用cDNA作為模板， 進行實時熒光定量RT-PCR反應，獲得7個基因標志物在外周血樣本中的mRNA相對含量；5)待檢測樣本供體結果的診斷根據SYBR Green熒光定量RT-PCR中7個基因標 志物在外周血樣本中的mRNA相對含量，利用我們實驗室創(chuàng)建的SVM鼻咽癌診斷模型軟件得 出診斷結果。本發(fā)明的試劑盒具有很高的敏感性和特異性；該試劑盒利用臨床上最易采集的 外周血進行檢測，是一種非侵入性手段；相對于通過手術或鼻內窺鏡活檢獲取腫瘤組織用 于檢測相比更方便；該試劑盒的檢測結果不受EBV陰陽性影響，可以與現(xiàn)有篩查指標血清 VCA-IgA和EA-IgA形成互補，可以作為鼻咽癌的輔助診斷以及早期診斷技術。


圖1是SYBR Green熒光定量PCR驗證芯片結果；圖2是SVM鼻咽癌判別模型的ROC曲線；圖3是部分樣品總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式本發(fā)明是建立在人類全基因表達譜芯片技術基礎上，通過SVM特征選擇的方法挑 選出7個基因標志物并建立由這7個基因標志物組成的SVM鼻咽癌診斷模型，該模型的建 立包括以下幾個方面1. Agilent人類全基因寡核苷酸芯片檢測分別送上海生物芯片公司20例鼻咽癌和20例正常人外周血總RNA樣品(去 血紅蛋白)進行Agilent人類全基因寡核苷酸芯片(Agilent Whole Human Gene ExpressionMicroarray 4X44K array)檢測。2.芯片數據的Quantile標準化利用Quantile方法對每個樣本原始數據進行標準化處理(由上海生物芯片公司 完成)，得到每個基因正常人/鼻炎癌病人的差異倍數和這兩組樣本中每個基因的P值。3.芯片數據可靠性分析利用Agilent生物芯片平臺采用變異系數(CV)與檢出率評價芯片數據的可靠性， 評價標準為CV小于15%和檢出率大于65%為可靠，評價結果為芯片檢測結果可靠。4.差異基因篩選利用GeneSpring 10. 0 軟件采用 t-test unequal unpaired 算法，將 P < 0· 05 且 差異倍數在1.5倍以上的基因確定為差異基因，共篩選出1257個探針(上調687個，下調 570 個)。5.特征基因篩選和SVM判別模型建立通過SVM特征選擇的方法從上述差異基因中篩選出具有判別能力的特征基因共7 個，用100例建模和60例樣本驗證，其中取懲罰系數C = 1000和核參數=9，具體步驟如 下
6
1)選擇適當的核函數(一般為高斯徑向基核函數RBF)，設置好懲罰因子和核函數 的參數；2)將訓練樣本集從低維空間中映射到高維空間，通過核函數技巧將非線性可分的 樣本轉化到在高維空間中使其線性可分；3)如果映射到高維空間后超平面仍不能夠線性可分待分類的訓練樣本，則可采用 軟間隔的方法將訓練樣本盡可能地分開。這種方法引入了松弛變量Ii，可以調節(jié)松弛變量 I i的大小使得訓練集樣本滿足分類超平面的約束條件；4)將求解最優(yōu)超平面的優(yōu)化問題采用拉格朗日(Lagrange)乘子法可以得到拉格 朗日函數，然后再將原優(yōu)化問題轉換成其Wolfe對偶形式；5)求解出上述優(yōu)化問題的解，得出相應的支持向量和分類超平面決策函數閾值 b° ；6)利用分類超平面決策函數對未知標號的驗證樣本進行判別，得出待分類樣本的 預測標號，即預測值大于0判定為正常人，小于0判定為鼻炎癌病人。6. SYBR Green熒光定量RT-PCR驗證7個基因標志物利用芯片檢測時所用的40例外周血樣本中的總RNA進行SYBR Green熒光定量 PCR檢測，圖1是SYBR Green熒光定量PCR驗證芯片結果。由圖1可見，該7個基因標志物 的Real-time PCR驗證結果與芯片結果一致，可用于構建鼻咽癌診斷模型。7.鑒定SVM鼻咽癌診斷模型的判別能力在128例樣本組成的訓練集中，利用SVM鼻咽癌診斷模型得出每個檢測樣本的預 測值并得出診斷結果，并將我們建立的SVM診斷模型的診斷結果與病理診斷結果進行比 較，得到SVM模型的敏感性、特異性、陽性預測值以及陰性預測值，結果見表1，表1是實時熒 光定量RT-PCR診斷鼻咽癌的外周血中7個基因標志物診斷試劑盒在60例樣本中的診斷結 果；同時得到該模型的ROC曲線，見圖2。由圖2可見，該模型ROC曲線的AUC為0. 82111， 該模型具有較高的分類正確率。表 權利要求
一種用于鼻咽癌早期診斷的外周血7個基因標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含外周血總RNA提取試劑、RT PCR反應液、實時熒光定量RT PCR反應液和SVM鼻咽癌診斷模型，所述實時熒光定量RT PCR反應液包含7個基因標志物及內參基因GAPDH的檢測引物，所述引物序列如SEQ ID NO1 16所示的序列。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述7個基因標志物為HERC5、DLG7、 PPARG、PLK1、KIF15、KLHL25 和 MYST4。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述SVM鼻咽癌診斷模型的建立包括以 下步驟1)送若干例鼻咽癌病人和正常人外周血總RNA樣品進行人類全基因表達譜芯片檢測；2)用t-testunequal impaired算法篩選出鼻咽癌和正常人外周血中的差異基因；3)用SVM特征選擇方法篩選出具有判別能力的特征基因；4)利用SYBRGreen熒光定量RT-PCR對篩選出的特征基因進行驗證；5)利用SVM選擇合適的核函數和懲罰因子建立鼻咽癌診斷模型，并用封裝程序形成可 操作程序。
4.權利要求1-3之一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟1)待檢測樣本血液樣品的收集；2)待檢測樣本血液樣品中總RNA的提取純化；3)RT-PCR以Olig(dT)為逆轉錄引物，總RNA為模板，進行逆轉錄反應合成cDNA ；4)SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測利用cDNA作為模板，以權利要求2所述的7個 基因標志物的熒光定量檢測引物作為引物，進行實時熒光定量PCR反應，獲得7個基因標志 物在外周血樣本中的相對表達量；5)待檢測樣本結果的判定根據待檢測樣本外周血樣品中7個基因標志物的相對表達 量，利用權利要求3所述的SVM鼻咽癌診斷模型得出外周血樣本的診斷結果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于鼻咽癌早期診斷的外周血7個基因標志物的檢測試劑盒。該試劑盒包含外周血總RNA提取試劑、RT-PCR反應液、實時熒光定量RT-PCR反應液和SVM鼻咽癌診斷模型，實時熒光定量RT-PCR反應液包含引物，引物序列如SEQ IDNO1-16所示，這些引物序列是7個基因標志物及內參基因GAPDH的SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測引物。所述7個基因標志物為HERC5、DLG7、PPARG、PLK1、KIF15、KLHL25和MYST4。本發(fā)明還提出了上述試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒具有很高的敏感性、特異性、方便性，可以作為鼻咽癌的輔助診斷以及早期診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK101956014SQ20101050255
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權日2010年9月30日
發(fā)明者劉萬里, 張華 , 曹京燕, 曾木圣, 李滿枝, 洪明晃, 胡利娟 申請人:中山大學